Name: investigation of genetic dependencies using crispr-cas9-based competition assays
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays at JoVE.com

Плазмиды pCW-Cas9 был подарок от Eric Lander и Дэвид Сабатини (плазмида # 50661 Addgene) и pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W плазмиды от Юса лаборатории (плазмида #67974 Addgene. Мы хотели бы поблагодарить проточной цитометрии ядро SBP медицинского открытия Института за своевременную помощь с анализа потока и сортировки. Мы хотели бы отметить поддержку леди Тата Мемориальный фонд до н.э. Мы хотели бы также отметить поддержку следующие источники финансирования: NIH/NCI Р30 CA030199 рака центр при поддержке гранта, Сан-Диего NCI рака центров (C3) и V-фонд #PTC2017to A.J.D.

1. создания AML клеток линии клоны с высоким выражением стабильных и активного Cas9
<ol><li>Производство Cas9 Лентивирусы
	<ol>
<li>День 0:6 293T клетки Клемная 4 x 10 в 10 мл DMEM с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), пенициллин и L-глютамина в 10 см блюдо культуры ткани в области биобезопасности ...

<ol>
	<li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology.">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nature Method. 10 (10), 957-963 (2013).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096 (2014).</li><li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+Genome+Editing+and+Beyond.">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+cancer+drug+targets+by+CRISPR-Cas9+screening+of+protein+domains.">Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains.</a> Nature Biotechnology. 33 (6), 661-667 (2015).</li><li>Kuhn, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Chromatin+Regulators+Inhibits+Leukemogenic+Gene+Expression+in+NPM1+Mutant+Leukemia.">Targeting Chromatin Regulators Inhibits Leukemogenic Gene Expression in NPM1 Mutant Leukemia.</a> Cancer Discovery. 6 (10), 1166-1181 (2016).</li><li>Erb, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+control+by+the+ENL+YEATS+domain+in+acute+leukaemia.">Transcription control by the ENL YEATS domain in acute leukaemia.</a> Nature. 543 (7644), 270-274 (2017).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Brinkman, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantification+of+template-directed+CRISPR/Cas9+editing.">Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing.</a> Nucleic Acids Research. 46 (10), 58 (2018).</li><li>Nguyen, A. T., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+functions+of+Dot1+and+H3K79+methylation.">The diverse functions of Dot1 and H3K79 methylation.</a> Genes &amp; Development. 25 (13), 1345-1358 (2011).</li><li>Vlaming, H., van Leeuwen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+upstreams+and+downstreams+of+H3K79+methylation+by+DOT1L.">The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L.</a> Chromosoma. 125 (4), 593-605 (2016).</li><li>Bernt, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MLL-rearranged+leukemia+is+dependent+on+aberrant+H3K79+methylation+by+DOT1L.">MLL-rearranged leukemia is dependent on aberrant H3K79 methylation by DOT1L.</a> Cancer Cell. 20 (1), 66-78 (2011).</li><li>Daigle, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+killing+of+mixed+lineage+leukemia+cells+by+a+potent+small-molecule+DOT1L+inhibitor.">Selective killing of mixed lineage leukemia cells by a potent small-molecule DOT1L inhibitor.</a> Cancer Cell. 20 (1), 53-65 (2011).</li><li>Jo, S. Y., Granowicz, E. M., Maillard, I., Thomas, D., Hess, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+Dot1l+in+murine+postnatal+hematopoiesis+and+leukemogenesis+by+MLL+translocation.">Requirement for Dot1l in murine postnatal hematopoiesis and leukemogenesis by MLL translocation.</a> Blood. 117 (18), 4759-4768 (2011).</li><li>Nguyen, A. T., Taranova, O., He, J., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DOT1L,+the+H3K79+methyltransferase,+is+required+for+MLL-AF9-mediated+leukemogenesis.">DOT1L, the H3K79 methyltransferase, is required for MLL-AF9-mediated leukemogenesis.</a> Blood. 117 (25), 6912-6922 (2011).</li><li>Zuber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toolkit+for+evaluating+genes+required+for+proliferation+and+survival+using+tetracycline-regulated+RNAi.">Toolkit for evaluating genes required for proliferation and survival using tetracycline-regulated RNAi.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 79-83 (2011).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+essential+genes+in+the+human+genome.">Identification and characterization of essential genes in the human genome.</a> Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).</li><li>Li, M. J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+transduction+of+hematopoietic+cells.">Lentivirus transduction of hematopoietic cells.</a> CSH Protocols. 2007, (2007).</li></ol>

В этой рукописи мы описываем подробный протокол для проведения пробирного ТРИФОСФАТЫ-Cas9 основе конкурентоспособных роста расследовать роль генов кандидата в AML клеточных линий с помощью проточной цитометрии в клетках человека/мышиных AML (рис. 5). Цель анализа требуется ...

В последние несколько десятилетий стали свидетелями многочисленных исследований было сосредоточено на выявлении вклад основные молекулярные пути в патогенезе острый миелоидный лейкоз (ОМЛ). Традиционно ген нарушения в клетках AML была выполнена с использованием условной нокаут мышей или шпильки короткие РНК (индуцируемый). В то время как нокаут мышей предлагают сложную систему для пространственно временной контроль ген-удаления, генерации мышей Нокаут гена трудоемкий, длительным и дорогостоящим. Кроме того ген просвечивание с помощью рекомбинации стратегии не легко масштабируемой; Эти стратегии не хорошо подходят для допроса нескольких генов параллельно. После открытия РНК интерференции методы для нокдауна эндогенного мРНК, используя малые интерферирующие РНК (siRNA) или индуцируемый многие группы началась с использованием методов РНК интерференции для расследования роли конкретных генов в борьбе с отмыванием денег. Поскольку мышиных и человеческие клетки AML сложно transfect методами традиционной липидных трансфекции, большинство исследований работает lentivirally или retrovirally кодировке индуцируемый для изучения функции генов в клетках бод. Недавнее открытие кластеризованной регулярно interspaced короткие палиндром повторяется (ТРИФОСФАТЫ) и связанные Cas nucleases (ТРИФОСФАТЫ-Cas9) революционизировало ген ориентация технологии1,2,3. С помощью ТРИФОСФАТЫ-Cas9, конкретные гены или геномных регионов может быть удален, редактировать или с меткой эффективность и простота. ТРИФОСФАТЫ-Cas9-редактирование на основе гена теперь становится методом выбора для расследования взаимоотношений генотип фенотип в типах различных клеток, благодаря простоте, эффективности и широкого применения этой техники. Методы, основанные на ТРИФОСФАТЫ-Cas9 также становится методом выбора в борьбе с отмыванием денег, не только для допроса отдельных генов, но также, как способ для нескольких генов в выстроились или пула генетической экраны, направленных на расследование нескольких генов параллельно как потенциал AML-зависимости4,5,6.
В этой рукописи мы опишем простой конкурентных роста assay для измерения воздействия ген беспорядки на рост клеток ПФТ, основанный на стабильной ТРИФОСФАТЫ-Cas9-опосредованной ген редактирования следуют высок объём проточной цитометрии. Этот метод является простой, эффективной и масштабируемой пропускной способности среднего экспериментов для изучения роли нескольких генов параллельно в клетках бод.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>FLAG-M2 Antibody</td>
			<td>sigma-aldrich</td>
			<td>F3165, lot # SLBS3530V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31446, lot # TA2514341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>34095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imaging System</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>17001401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend RT centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S34859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>SAFC</td>
			<td>12303C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>single gRNA vector</td>
			<td>Addgene #67974</td>
			<td>pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CelLytic Nuclear extraction kit</td>
			<td>sigma-alorich</td>
			<td>NXTRACT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XtremeGENE 9</td>
			<td>sigma-alorich</td>
			<td>6365787001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retronectin</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>NEBioLabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligation buffer</td>
			<td>NEBioLabs</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase enzyme</td>
			<td>NEBioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP9724-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP9731-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen mini-prep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IL-3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IL-6</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>216-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stable competent cells</td>
			<td>NEBiolabs</td>
			<td>C3040I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Tissue Culture dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lysis solution</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein precipitation solution</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA hydration solution</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbSI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0539S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APEX 2.0 X Taq Red Master Mix Kit</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>42-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP2956100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene conical tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>1495949A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene conical tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>1495970C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of genetic dependencies using crispr-cas9-based competition assays

Джин возмущений исследования широко используются для изучения роли отдельных генов в патогенезе бод. Для достижения полной гена срыв, многие из этих исследований сделали использовать сложные гена нокаут моделей. Хотя эти исследования с нокаут мышей предлагают элегантный и проверенные временем системы для расследования взаимоотношений генотип фенотип, быстрый и масштабируемый метод для оценки кандидата генов, которые играют роль в AML пролиферации или выживания в моделях ПФТ поможет ускорить параллельных допроса нескольких генов кандидата. Последние достижения в технологии изменения генома резко повысили нашу способность выполнить генетических возмущений в беспрецедентных масштабах. Одна такая система генома редактирования является основанный ТРИФОСФАТЫ-Cas9 метод, который может использоваться для сделать быстрые и эффективные изменения в геноме целевой ячейки. Простоту и масштабируемость ТРИФОСФАТЫ/Cas9-опосредованной ген-удаления делает его одним из самых привлекательных методов допроса большого числа генов в фенотипических анализов. Здесь мы представляем простой анализа с использованием ТРИФОСФАТЫ/Cas9 при посредничестве ген нарушения в сочетании с высокой пропускной способностью на основе потока цитометрии конкуренции анализов расследовать роль генов, которые могут играть важную роль в распространении или выживания человека и мышиных ПФТ клеточных линий.

В нашем исследовании мы сначала преобразованы MOLM13 человека ПФТ клеток линии, которая несет транслокации MLL-AF9 с высоким титр вируса кодирования лентивирусные плазмида Cas9-blasticidin. В наших руках массовых несортированные MOLM13-Cas9 клетки не отображать выражение высокого уро?...

Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays at JoVE.com

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

Эта рукопись описывает основанный ТРИФОСФАТЫ-Cas9 метод кластерного регулярно Interspaced короткие палиндром повторяет (ТРИФОСФАТЫ) для простого и оперативного расследования роли нескольких генов кандидат в острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) пролиферации в параллельно. Эта техника является масштабируемым и может быть применен в других рак клеточных линий, а также.

Исследование генетических зависимостей с помощью анализов на основе ТРИФОСФАТЫ Cas9 конкурс

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

Это видео продемонстрирует простой метод для исследования нескольких генов-кандидатов в AML параллельно, используя систему Crisper-Cas9 в сочетании с цитометрией потока на основе конкурентного анализа роста. Основным преимуществом этой техники является то, что она быстрая и масштабируемая. Демонстрация процедуры будет Бо Руи Чэнь, пост документ из нашей лаборатории.Программное обеспечение для проектирования CRISPR на основе Интернета используется для разработки четырех-шести отдельных RNAs руководства для гена интереса. Для начала заполните соответствующую информацию в полях звездочками. Затем выберите целевой геном для одного руководства РНК-дизайна.Вставьте целевую последовательность в поле последовательности и нажмите на кнопку отправки. Для клонирования в желаемом одном руководстве РНК выражение плазмид, prepend нуклеотидов CACC в смысле глионуклеотид и AAAC к обратному бесплатный антисенсе олигонуклеотид. Premixed чувство и antisense oligonucleotides после этого приказано от компании в плите 96 наилучшим образом, обозначенной смешиванием Oligo.Установите отдельный U-Bottom 96 хорошо пластины, помечены Аннеалирование плиты. Подготовь мастер-микс из одного микролитера полинуклеотидной киназы Т4, одного микролитера буфера перевязки ДНК 10x T4 и шести микролитров воды на аннеалятную реакцию. Добавьте 8 микролитров мастер-микса к каждому колодец Аннеалярной плиты, а затем 2 микролитров премиксового смысла и антисенс-олигонуклеотидов.Pipette два-три раза осторожно хорошо перемешать, а затем спина пластины кратко, чтобы получить смеси на дно скважин. Используйте следующую программу annealing в машине PCR. 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут, 95 градусов по Цельсию в течение двух минут и 30 секунд, а затем медленное охлаждение до 22 градусов по Цельсию со скоростью 0,1 градуса по Цельсию в секунду.Когда annealing будет завершена, подготовить свежие 96 хорошо пластины, помечены Разбавленный Oligo Mix, путем разбавления фосфорилированных и annealed олигонуклеотидов от аннеалирования реакции один до 200 с водой. Линейность вектора экспрессии РНК-руководства путем переваривания пяти микрограммов вектора с 1,5 микролитров фермента ограничения BBS1, используя соответствующий буфер при 37 градусах по Цельсию в течение двух часов. Далее возьмите свежие 96 хорошо пластины помечены Лигация плиты, и добавить 20 нанограммОВ BBS1 переваривается одного руководства РНК экспрессии вектор к одному хорошо на желаемое одно руководство РНК перевязки.К этому добавьте 2 микролитров фосфорилированных олигонуклеотидов из разбавленной пластины Oligo Mix. Добавить к каждой хорошо, один микролитер 10X T4 лигазы буфера, и один микролитер фермента T4 лигазы, и осторожно пипетки для смешивания. Инкубировать пластину при комнатной температуре в течение двух часов.Примерно за 10 минут до того, как будет сделана реакция перевязки, заполните 90 микролитров химически компетентных клеток E.coli на льду. Передача 10 микролитров aliquots компетентных клеток в каждом колодец отдельного 96 хорошо пластины индивидуально. Добавьте смесь перевязки в скважины, содержащие компетентные клетки.Пипетка вверх и вниз мягко, и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 минут. Pipette пять микролитров смеси ДНК бактерий из каждой реакции преобразования непосредственно в колодец 6 пластины хорошо, содержащий LB агар с 100 миллиграммов на миллилитр ампициллина. Добавить примерно пять-восемь стеклянных бусин к каждому хорошо, и встряхнуть 6 хорошо пластины от восьми до 10 раз круговыми движениями.Инкубировать пластины при 37 градусах по Цельсию в одночасье. На следующий день, выбрать один-два одиночных колоний из каждой хорошо, со стерильным 20 микролитр пипетки отзыв, и полоса его на помечены месте на стерильных 10 сантиметров Петри блюдо, с LB агар и 100 миллиграммов на миллилитр ампициллина После полос на пластине LB, извлечь кончик в три миллилитров ампициллина среды в 14 миллилитров , отмечен соответствующим бактериальным числом клонов. Бактериальная пластина затем отправляется непосредственно для секвенирования Сэнгер.После подтверждения последовательности клонированных одногидных РНК, очистите ДНК от соответствующей 14 миллилитровой трубки, используя комплект miniprep в соответствии с инструкциями производителя. Однонародные РНК-лентивирусные частицы производятся в формате 96 хорошо, как описано в текстовом протоколе. А вирусный супернатант сразу замораживается при температуре минус 80 градусов по Цельсию.За день до трансдукции одного направляющих РНК в клетках AML Cas9, пальто плоского дна, не ткани культуры лечение 96 хорошо пластины, с 100 миллилитров рекомбинантных человеческих фибронектин фрагмент при концентрации 10 микрограмм на миллилитр. Оберните пластину цепляться обернуть, чтобы избежать потери испарения, и оставить его на скамейке на ночь. На следующий день удалите рекомбинантный фрагмент фибронектина человека с каждой пластины из 96 хорошо.Оттепель вирусных supernatant каждого отдельного руководства РНК при комнатной температуре. Добавьте 50 микролитров вирусного супернатанта из каждой трубки к каждой покрытой хорошо трансдукционной пластины. Оберните пластину пленкой, чтобы избежать потенциального загрязнения во время центрифугации.Спин пластины на 1, 300 раз г при 35 градусов по Цельсию в течение 90 минут. Ближе к концу спинфекции подсчитайте высокие клетки Cas9, выражаюющие клон В3 из культуры колбы. После подсчета, спина вниз необходимое количество клеток, и повторного перерасхода в свежей среде.После 90-минутной спинфекции используйте многоканарновую пипетку, скорректированную до 50 микролитров, чтобы медленно удалить супернатант из всех скважин, наклонив пластину. Добавьте 100 микролитров культуры клеток клона B3 к каждой хорошо медленно, сползая вниз от обода. Спин пластины на 1, 300 раз г при 35 градусов по Цельсию в течение двух минут, чтобы клетки оседают на дно.Перенесите пластину в инкубатор культуры тканей по Цельсию на 37 градусов цельсия. На следующий день добавьте 100 микролитров свежей среды к каждому хорошо содержа одномандатным РНК-транс индуцированным клеткам, таким образом, чтобы окончательный средний объем составил 200 микролитров. Верните тарелку в инкубатор.72 часов после трансдукции, проверить процент одного руководства РНК, содержащей BFP положительные клетки в каждой хорошо поток цитометрии. Используйте краситель жизнеспособности клеток, чтобы отметить и исключить мертвые клетки из анализа. Продолжить повторное покрытие доли клеток в новые скважины со свежей среде после каждого анализа фактов, чтобы избежать разрастание во время анализа.Каждые два-три дня повторяйте анализ фактов, чтобы проверить относительную долю положительных ячеек BFP по сравнению с отрицательными аналогами BFP. Проанализируйте процент положительных ячеек BFP для каждой точки времени, используя программное обеспечение для анализа фактов. Ключом к успеху конкурентного анализа распространения является использование надлежащих методов gating для обеспечения того, чтобы в конечном итоге живые номера клеток являются точными.Перетащите файлы FCS для каждого образца в программное обеспечение. Двойное нажатие на любой образец файла, и построить точку участок вперед рассеяния по сравнению с боковой рассеяния, с вперед рассеяния на х-оси, и боковой рассеяния по оси. Ворота все клетки.Двойное нажатие на закрытые ячейки, и участок жизнеспособности пятно на y-оси по сравнению с вперед рассеяния высоты или области точка участка. Ворота жизнеспособности пятно отрицательных клеток. Двойное нажатие на закрытые живые ячейки, и участок BFP на y-оси по сравнению с вперед рассеяния на x-оси.Ворота BFP положительные ячейки. Примените все эти ворота ко всем образцам, перетащив выбранный образец во все образцы под вкладкой группы. Нажмите на редактор таблицы, чтобы сделать таблицу анализа всех образцов.Перетащите положительный отсчет BFP из одного образца в таблицу и нажмите на кнопку отображения в редакторе таблицы, чтобы создать пакетный отчет по всем образцам, при этом таблица отображает процент положительных ячеек BFP. Сохраните таблицу в качестве файла Excel. Эта система была использована для исследования роли генов, которые могут играть определенную роль в распространении или выживании человеческих и murine AML клеточных линий.Ориентация на локус безопасной гавани AAVS1 с двумя отдельными однонаправленными РНК не повлияла на пролиферацию клеток MOM13 Cas9 человека В отличие от этого, когда был направлен связанный с репликацией ДНК ген RPA3, наблюдалось прогрессивное и значительное снижение доли положительных клеток BFP по сравнению с отрицательными непереведенными аналогами BFP. Аналогичным образом, эффекты одного руководства РНК ориентации Dot1l, эпигенетический регулятор, и родопсин, ген пигментации глаз, были протестированы в мыши MLL-AF9 Cas9 клеток. Одно руководство РНК ориентации Dot1l, показали резкое и постепенное снижение конкурентоспособности распространения в отличие от одного руководства РНК ориентации Родопсин.Эти результаты демонстрируют уязвимость MLL-AF9, выражаюющего массовые клетки лейкемии к истощению Dot1l, подтверждая ранее опубликованные результаты. Предполагая, от четырех до шести руководства РНК на ген, этот метод хорошо подходит для использования для тестирования по крайней мере от 16 до 24 генов параллельно, и он также может быть применен для тестирования генных зависимостей в любой линии раковых клеток. В случае большего числа генов, таких как весь молекулярный путь, который должен быть протестирован в клетках AML, бассейн CRISPR-Cas9 на основе экранов будет более полезным.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Сокультивирования Анализы по изучению макрофагами и микроглии стимуляции глиобластомы вторжения

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

Разработка и ведение доклинической пациента Derived Опухоль модели ксенотрансплантата для исследования принципиально новых видов лечения рака

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

<em&gt; Drosophila</em&gt; Имаджинальное Disc Опухоль Модель: Визуализация и Количественная экспрессии генов и опухолевой инвазии с использованием генетических Мозаики

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Assays клеток опухоли стволовых клеток глиобластомы мозга исследования миграции и вторжения

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Assay цифровой полимеразной цепной реакции для генетической вариации в спорадических семейное аденоматозное Polyposis пациента, используя формат чип в трубе

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Оценка метаболических профиля первичных лейкозных клеток

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

Дрожжи как шасси для разработки функциональных анализов для изучения человека P53

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Пациент полученных гетерогенных Xenograft Модель рака поджелудочной железы использованием черыщения зебрав в качестве хозяев для сравнительной оценки наркотиков

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...