Name: investigation of genetic dependencies using crispr-cas9-based competition assays
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays at JoVE.com

El plásmido pCW Cas9 fue un regalo de Eric Lander & David Sabatini (plásmido Addgene # 50661) y pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - plásmido W del laboratorio Yusa (plásmido Addgene #67974. Nos gustaría agradecer al núcleo de la citometría de flujo en Pas Medical Discovery Institute por oportuna ayuda con análisis de flujo y clasificación. Nos gustaría agradecer el apoyo de la Fundación Señora Tata Memorial a A.D. Nos gustaría también agradecer el apoyo de las siguientes fuentes de financiamientos: NIH/NCI P30 CA030199 cáncer centro patrocinado por donación, la Fundación de la V y los centros de cáncer del NCI de San Diego (C3) #PTC2017to A.J.D.

1. generar AML celular línea Clones con alta expresión de Cas9 estables y activos
<ol><li>Producción de lentivirus Cas9
	<ol>
<li>Día 0: Placa 4 x 106 293T células en 10 mL de DMEM con 10% suero bovino fetal (FBS) y penicilina y L-glutamina en un plato de cultivo de tejidos de 10 cm en una bioseguridad nivel 2 (BSL2) certifican campana de cultivo celular. Coloque el plato en una incubadora de 37 ° C.</li>
		<li>Día 1: Las células 293T plateado deben ser confluente de 70 – 80% el d?...

<ol>
	<li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology.">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nature Method. 10 (10), 957-963 (2013).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096 (2014).</li><li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+Genome+Editing+and+Beyond.">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+cancer+drug+targets+by+CRISPR-Cas9+screening+of+protein+domains.">Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains.</a> Nature Biotechnology. 33 (6), 661-667 (2015).</li><li>Kuhn, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Chromatin+Regulators+Inhibits+Leukemogenic+Gene+Expression+in+NPM1+Mutant+Leukemia.">Targeting Chromatin Regulators Inhibits Leukemogenic Gene Expression in NPM1 Mutant Leukemia.</a> Cancer Discovery. 6 (10), 1166-1181 (2016).</li><li>Erb, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+control+by+the+ENL+YEATS+domain+in+acute+leukaemia.">Transcription control by the ENL YEATS domain in acute leukaemia.</a> Nature. 543 (7644), 270-274 (2017).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Brinkman, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantification+of+template-directed+CRISPR/Cas9+editing.">Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing.</a> Nucleic Acids Research. 46 (10), 58 (2018).</li><li>Nguyen, A. T., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+functions+of+Dot1+and+H3K79+methylation.">The diverse functions of Dot1 and H3K79 methylation.</a> Genes &amp; Development. 25 (13), 1345-1358 (2011).</li><li>Vlaming, H., van Leeuwen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+upstreams+and+downstreams+of+H3K79+methylation+by+DOT1L.">The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L.</a> Chromosoma. 125 (4), 593-605 (2016).</li><li>Bernt, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MLL-rearranged+leukemia+is+dependent+on+aberrant+H3K79+methylation+by+DOT1L.">MLL-rearranged leukemia is dependent on aberrant H3K79 methylation by DOT1L.</a> Cancer Cell. 20 (1), 66-78 (2011).</li><li>Daigle, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+killing+of+mixed+lineage+leukemia+cells+by+a+potent+small-molecule+DOT1L+inhibitor.">Selective killing of mixed lineage leukemia cells by a potent small-molecule DOT1L inhibitor.</a> Cancer Cell. 20 (1), 53-65 (2011).</li><li>Jo, S. Y., Granowicz, E. M., Maillard, I., Thomas, D., Hess, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+Dot1l+in+murine+postnatal+hematopoiesis+and+leukemogenesis+by+MLL+translocation.">Requirement for Dot1l in murine postnatal hematopoiesis and leukemogenesis by MLL translocation.</a> Blood. 117 (18), 4759-4768 (2011).</li><li>Nguyen, A. T., Taranova, O., He, J., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DOT1L,+the+H3K79+methyltransferase,+is+required+for+MLL-AF9-mediated+leukemogenesis.">DOT1L, the H3K79 methyltransferase, is required for MLL-AF9-mediated leukemogenesis.</a> Blood. 117 (25), 6912-6922 (2011).</li><li>Zuber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toolkit+for+evaluating+genes+required+for+proliferation+and+survival+using+tetracycline-regulated+RNAi.">Toolkit for evaluating genes required for proliferation and survival using tetracycline-regulated RNAi.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 79-83 (2011).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+essential+genes+in+the+human+genome.">Identification and characterization of essential genes in the human genome.</a> Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).</li><li>Li, M. J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+transduction+of+hematopoietic+cells.">Lentivirus transduction of hematopoietic cells.</a> CSH Protocols. 2007, (2007).</li></ol>

En este manuscrito, se describe un protocolo detallado para llevar a cabo un ensayo de crecimiento competitivo basado en el Cas9 CRISPR para investigar el papel de genes candidatos en líneas de células de la AML mediante citometría de flujo en células AML de humano/murino (figura 5). El objetivo del análisis es identificar el efecto de la canceladura del gene en el mantenimiento de la proliferación de células AML durante dos a tres semanas en una escala de rendimiento medio. Algunos p...

Las últimas décadas han visto numerosos esfuerzos de investigación se centró en la identificación de la contribución de principales vías moleculares en la patogenia de la leucemia mieloide aguda (AML). Tradicionalmente, interrupción de genes en las células de la AML se ha realizado con ratones knockout condicional o short hairpin RNA (shRNA). Mientras que los ratones knockout ofrecen un sofisticado sistema de control espacio-temporal de la canceladura del gene, generación de ratones knockout de genes es mano de obra intensiva, desperdiciador de tiempo y costoso. Por otra parte, gene knockouts utilizando estrategias de recombinación no es fácilmente escalable; Estas estrategias no se prestan bien al interrogatorio de varios genes en paralelo. Tras el descubrimiento de métodos de interferencia RNA mRNAs endógena de precipitación mediante ARN interferente pequeño (siRNA) o shRNA, muchos grupos comenzaron a utilizar técnicas de interferencia de RNA para investigar el papel de genes específicos en AML. Desde murinas y humanas células AML son notoriamente difíciles de transfectar utilizando métodos tradicionales de base de lípidos la transfección, la mayoría estudios shRNA empleada lentivirally o retrovirally codificadas para el estudio de funciones de los genes en las células de la AML. El reciente descubrimiento de agrupadas regularmente otro corto repite palindrómico (CRISPR) y las nucleasas Cas asociadas (CRISPR-Cas9) ha revolucionado gene targeting tecnologías1,2,3. Usando CRISPR Cas9, determinados genes o regiones genómicas pueden ser eliminadas, editadas o etiquetadas con eficacia y facilidad. Basado en el Cas9 CRISPR gene-edición surge ahora como el método de elección para investigar la relación genotipo-fenotipo en tipos de células diferentes debido a la simplicidad, eficacia y amplia aplicabilidad de esta técnica. También se están convirtiendo CRISPR Cas9-métodos basados en el método de elección en la AML, no sólo para interrogar a los genes individuales, sino también como una manera de objetivo de múltiples genes en pantallas genéticas vestidas o combinados destinado a investigar varios genes en paralelo como potencial AML-dependencias4,5,6.
En este manuscrito, describimos un análisis simple crecimiento competitivo para la medición del impacto de la gene-interrupción en el crecimiento de las células de la AML, basado en estable mediada por Cas9 CRISPR gene-edición seguida por citometría de flujo de alto rendimiento. Este método es simple, eficiente y escalable a medio rendimiento experimentos para investigar el papel de varios genes en paralelo en las células de la AML.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>FLAG-M2 Antibody</td>
			<td>sigma-aldrich</td>
			<td>F3165, lot # SLBS3530V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31446, lot # TA2514341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>34095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imaging System</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>17001401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend RT centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S34859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>SAFC</td>
			<td>12303C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>single gRNA vector</td>
			<td>Addgene #67974</td>
			<td>pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CelLytic Nuclear extraction kit</td>
			<td>sigma-alorich</td>
			<td>NXTRACT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XtremeGENE 9</td>
			<td>sigma-alorich</td>
			<td>6365787001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retronectin</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>NEBioLabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligation buffer</td>
			<td>NEBioLabs</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase enzyme</td>
			<td>NEBioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP9724-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP9731-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen mini-prep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IL-3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IL-6</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>216-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stable competent cells</td>
			<td>NEBiolabs</td>
			<td>C3040I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Tissue Culture dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lysis solution</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein precipitation solution</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA hydration solution</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbSI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0539S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APEX 2.0 X Taq Red Master Mix Kit</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>42-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP2956100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene conical tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>1495949A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene conical tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>1495970C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of genetic dependencies using crispr-cas9-based competition assays

Estudios de perturbación del gene se han utilizado para investigar el papel de los genes individuales en la patogenesia de la AML. Para lograr la interrupción del gen completo, muchos de estos estudios han hecho uso de modelos de complejos gene knockout. Si bien estos estudios con ratones knockout ofrecen un sistema elegante y comprobado para investigar relaciones genotipo a fenotipo, un método rápido y escalable para la evaluación de genes candidatos que juegan un papel en la proliferación de células AML o supervivencia en modelos AML le ayudará a acelerar el interrogatorio paralelo de múltiples genes candidatos. Los avances recientes en tecnologías de la edición del genoma han mejorado considerablemente nuestra capacidad para llevar a cabo las perturbaciones genéticas en una escala sin precedentes. Tal sistema de la edición del genoma es el método basado en el Cas9 CRISPR que puede utilizarse para hacer rápidas y eficaces alteraciones en el genoma de la célula blanco. La facilidad y la escalabilidad de la canceladura del gene CRISPR/Cas9-mediada, es una de las técnicas más atractivas para el interrogatorio de un gran número de genes en los ensayos fenotípicos. Aquí, presentamos un ensayo simple utilizando CRISPR/Cas9 mediada gen-interrupción combinada con ensayos de alto rendimiento basado en la citometría de flujo competencia para investigar el papel de los genes que pueden desempeñar un papel importante en la proliferación o la supervivencia del ser humano y líneas celulares de ratón AML.

En nuestro estudio, nosotros primero transduced la MOLM13 humana AML línea celular que lleva a la translocación MLL-AF9 con virus de alto título codificación el plásmido lentivirales Cas9-blasticidin. En nuestras manos, a granel sin clasificar MOLM13 Cas9 células no muestran el alto nivel Cas9 expresión por borrar occidental y también no se realizó bien cuando ensayaron por edición-el método eficaz de genes descritos7. Por lo tanto, se procedió a establ...

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Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

Este manuscrito describe un método de CRISPR Cas9 basado en cluster regularmente otro corto palindrómico repite (CRISPR) simple y expedita investigación del papel de varios genes candidatos en la proliferación de células de leucemia mieloide aguda (AML) en paralelo. Esta técnica es escalable y puede ser aplicada en otras líneas celulares de cáncer así.

Investigación de las dependencias genéticas usando análisis CRISPR Cas9 basado en competencia

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

Este video demostrará un método simple para investigar múltiples genes candidatos en AML en paralelo, utilizando el sistema Crisper-Cas9 combinado con el ensayo de crecimiento competitivo basado en citometría de flujo. La principal ventaja de esta técnica es que es rápida y escalable. Demostrando el procedimiento estará Bo Rui Chen, un postdoctorado de nuestro laboratorio.Un software de diseño CRISPR basado en la web se utiliza para diseñar de cuatro a seis ARN de guía única para el gen de interés. Para empezar, rellene la información adecuada en los campos con asteriscos. A continuación, seleccione el genoma objetivo para el diseño de ARN de guía única.Pegue la secuencia de destino en el cuadro de secuencia y haga clic en el botón Enviar. Para la clonación en el plásmido de expresión de ARN guía único deseado, anteponga los nucleótidos CACC al sentido oglionucleótido y AAAC al oligonucleótido antisocio complementario inverso. Los oligonucleótidos antisoque y antisoquerones premezclados se ordenan a una empresa en una placa de 96 pozos, etiquetada Oligo Mix.Establezca una placa de pozo U-Bottom 96 separada, etiquetada placa de recocido. Preparar una mezcla maestra de un microlitro de polinucleótido quinasa T4, un microlitro de 10x tampón de ligadura de ADN T4 y seis microlitros de agua por reacción de recocido. Añadir 8 microlitros de la mezcla maestra a cada pozo de la placa de recocido, seguido de 2 microlitros de sentido premezclado y oligonucleótidos antisosales.Pipetear dos o tres veces suavemente para mezclar bien, y luego girar la placa brevemente para conseguir las mezclas a la parte inferior de los pozos. Utilice el siguiente programa de recocido en una máquina PCR. 37 grados Celsius durante 30 minutos, 95 grados Celsius durante dos minutos y 30 segundos, seguido de enfriamiento lento a 22 grados Celsius a una velocidad de 0.1 grados Celsius por segundo.Cuando el recocido esté completo, prepare una placa fresca de 96 pozos, etiquetada Diluted Oligo Mix, diluyendo los oligonucleótidos fosforilados y recocidos de la reacción de recocido de uno a 200 con agua. Linealice el vector de expresión de ARN guía único digiriendo cinco microgramos del vector con 1,5 microlitros de enzima de restricción BBS1, utilizando un tampón adecuado a 37 grados centígrados durante dos horas. A continuación, tome una placa de 96 bien etiquetada con la placa de ligadura, y agregue 20 nanogramos del vector de expresión de ARN de guía única digerido BBS1 a una ligadura de ARN de guía única bien deseada.A esto, añadir 2 microlitros de oligonucleótidos recocidos fosforilados de la placa Oligo Mix diluida. Añadir a cada pozo, un microlitro de 10X T4 tampón de ligasa, y un microlitro de enzima ligasa T4, y pipetear suavemente para mezclar. Incubar la placa a temperatura ambiente durante dos horas.Unos 10 minutos antes de que se realice la reacción de ligadura, Llene 90 microlitros de células de E.coli químicamente competentes sobre hielo. Transfiera 10 microlitros alícuotas de las células competentes a cada pozo de una placa separada de 96 pozos individualmente. Añadir la mezcla de ligadura en los potes que contienen las células competentes.Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo, e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Pipetear cinco microlitros de la bacteria MEZCLA de ADN de cada reacción de transformación directamente en un pozo de una placa de 6 pozos, que contiene agar LB con 100 miligramos por mililitro de ampicilina. Agregue aproximadamente cinco a ocho cuentas de vidrio a cada pozo, y agite la placa de 6 pozos de ocho a 10 veces en un movimiento circular.Incubar las placas a 37 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, escoge de una a dos colonias individuales de cada pozo, con una punta estéril de pipeta de 20 microlitro, y raya en un punto etiquetado en un plato estéril de 10 centímetros de petri, con agar LB y 100 miligramos por mililitro de ampicilina Después de rayar la placa LB, expulsa la punta en tres mililitros de medio de ampicilina en un tubo inferior redondo de 14 mililitros , marcado con el número de clon bacteriano correspondiente. La placa bacteriana se envía directamente para la secuenciación de Sanger.Después de una confirmación de secuencia de los ARN de guía individual clonados, purifique el ADN del tubo de 14 mililitros correspondiente, utilizando un kit de miniprep de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las partículas lentivirales de ARN de guía única se producen en un formato de 96 pozos, como se describe en el protocolo de texto. Y el sobrenadante viral se congela inmediatamente a menos 80 grados centígrados.Un día antes de la transducción de ARN de guía único en células AML Cas9, recubr un cultivo de fondo plano no tejido tratado 96 placa de pozo, con 100 mililitros de fragmento de fibronectina humana recombinante a una concentración de 10 microgramos por mililitro. Envuelva la placa con envoltura de adherencia para evitar la pérdida de evaporación, y déjela en el banco durante la noche. Al día siguiente, retire el fragmento de fibronectina humana recombinante de cada pozo de la placa de 96 pozos.Descongelar el sobrenadante viral de cada ARN guía individual a temperatura ambiente. Añadir 50 microlitros de sobrenadante viral de cada tubo a cada pozo recubierto de la placa de transducción. Envuelva la placa con envoltura de adherencia para evitar la posible contaminación durante la centrifugación.Gire la placa a 1.300 veces g a 35 grados Celsius durante 90 minutos. Hacia el final de la espinfección, cuente las células B3 clon altas de Cas9 desde el matraz de cultivo. Después de contar, gire hacia abajo el número requerido de células, y resuspend en medio fresco.Después de la espinfección de 90 minutos, utilice una pipeta multicanal ajustada a 50 microlitros para quitar el sobrenadante de todos los pozos lentamente inclinando la placa. Añadir 100 microlitrotro del cultivo de células clon B3 a cada pozo lentamente, deslizándose hacia abajo desde el borde. Gire la placa a 1.300 veces g a 35 grados Celsius durante dos minutos para dejar que las células se asienten hasta el fondo.Transfiera la placa a una incubadora de grado de cultivo de tejido de 37 grados Celsius. Al día siguiente, añada 100 microlitros de medio fresco a cada célula transducida de ARN guía único, de modo que el volumen medio final sea de 200 microlitros. Devuelva la placa a la incubadora.72 horas después de la transducción, compruebe el porcentaje de ARN guía único que contiene células positivas BFP en cada pozo por citometría de flujo. Utilice un tinte de viabilidad celular para marcar y excluir las células muertas del análisis. Continúe re-encotando una proporción de las células en nuevos pozos con medio fresco después de cada análisis de hechos para evitar el crecimiento excesivo durante el ensayo.Cada dos o tres días, repita el análisis de los hechos para verificar la proporción relativa de células positivas de BFP en comparación con las contrapartes negativas de BFP. Analice el porcentaje de celdas positivas de BFP para cada punto de tiempo, utilizando un software de análisis de hechos. La clave del éxito del ensayo de proliferación competitiva es utilizar las técnicas de medición adecuadas para garantizar que los números de células vivas eventuales sean precisos.Arrastre archivos FCS para cada muestra al software. Haga doble clic en cualquier archivo de muestra y trace una gráfica de puntos de dispersión hacia delante frente frente a dispersión lateral, con dispersión hacia delante en el eje X y dispersión lateral en el eje Y. Puerta a todas las celdas.Haga doble clic en las celdas cerradas y trace la mancha de viabilidad en el eje Y frente a la altura de dispersión hacia adelante o la gráfica de puntos de área. Puerta de la viabilidad mancha las células negativas. Haga doble clic en las celdas vivas cerradas y trace BFP en el eje Y frente a la dispersión hacia adelante en el eje X.Puerta de las celdas positivas BFP. Aplique todas estas puertas a todos los ejemplos arrastrando la muestra seleccionada a todas las muestras bajo la pestaña de grupo. Haga clic en el editor de tablas para crear una tabla de análisis de todos los ejemplos.Arrastre el recuento positivo de BFP de una muestra a la tabla y haga clic en el botón de visualización en el editor de tablas para crear un informe por lotes de todos los ejemplos, con la tabla que muestra el porcentaje de celdas positivas de BFP. Guarde la tabla como un archivo de Excel. Este sistema se utilizó para investigar el papel de los genes que pueden desempeñar un papel en la proliferación o supervivencia de las líneas celulares AML humanas y murinas.Dirigirse al locus de puerto seguro AAVS1 con dos ARN de guía único separados no tuvo ningún efecto en la proliferación de células humanas MOM13 Cas9 En contraste, cuando se apuntó al gen asociado a la replicación del ADN, RPA3, se observó una disminución progresiva y significativa en el porcentaje de células positivas de la BFP en comparación con las contrapartes negativas notransducidas de la BFP. Del mismo modo, los efectos de los ARN de guía única dirigidos a Dot1l, un regulador epigenético, y Rhodopsin, el gen de pigmentación ocular, se probaron en células MLL-AF9 Cas9 de ratón. Los ARN de guía única dirigidos a Dot1l, mostraron una disminución dramática y progresiva de la proliferación competitiva en contraste con los ARN de guía única dirigidos a Rhodopsin.Estos resultados demuestran la vulnerabilidad de las células de leucemia de masa MLL-AF9 al agotamiento de Dot1l, confirmando resultados publicados anteriormente. Suponiendo de cuatro a seis ARN guía por gen, este método es adecuado para ser utilizado para probar al menos 16 a 24 genes en paralelo, y también se puede aplicar para probar las dependencias genéticas en cualquier línea celular de cáncer. En el caso de un mayor número de genes, como una vía molecular completa que necesita ser probada en células AML, las pantallas basadas en CRISPR-Cas9 de la reserva serán más útiles.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Cocultivo Los ensayos para Estudiar macrófagos y microglia Estimulación de Glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

Desarrollo y mantenimiento de un tumor del paciente preclínicos Derivado modelo de xenoinjerto para la Investigación de Novela Anti-Cancer Therapies

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

los<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal modelo de tumor de disco: visualización y cuantificación de la expresión génica y la invasividad tumoral Uso Genético Mosaicos

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Análisis de imágenes de células vivas para estudio Glioblastoma cerebral Tumor células madre migración y la invasión

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digital de la reacción en cadena de polimerasa para la variación genética en un paciente de la poliposis adenomatosa familiar esporádico con el formato de Chip en tubo

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Evaluación del perfil metabólico de las células leucémicas primarias

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

Levadura como chasis para el desarrollo de ensayos funcionales para estudiar P53 humanos

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Modelo de xenoinjerto heterogéneo derivado del paciente del cáncer de páncreas utilizando larvas de pez cebra como anfitriones para la evaluación comparativa de fármacos

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...