Name: investigation of genetic dependencies using crispr-cas9-based competition assays
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays at JoVE.com

PCW-Cas9 plasmiden var en present från Eric Lander & David Sabatini (Addgene plasmid # 50661) och den pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W plasmid från Yusa lab (Addgene plasmid #67974. Vi vill tacka flödescytometri kärnan på SBP medicinsk Discovery Institute för snabb hjälp med Flödesanalys och sortering. Vi skulle vilja erkänna stöd av stiftelsen Lady Tata Memorial till e.Kr. Vi vill också erkänner stöd av de följande finansieringskällorna: NIH/NCI P30 CA030199 Cancer Center sponsrade Grant, V-stiftelsen och San Diego NCI Cancer Centers (C3) #PTC2017to A.J.D.

1. generera AML Cell linje kloner med hög uttryck för stabil och aktiv Cas9
<ol><li>Produktion av Cas9 lentivirus
	<ol>
<li>Dag 0: Plåt 4 x 106 293T celler i 10 mL DMEM med 10% fetalt bovint serum (FBS) och penicillin och L-glutamin i ett 10 cm vävnadsodling skålen i en biosäkerhet nivå 2 (BSL2) certifierade cell kultur huva. Placera skålen i en 37 ° C inkubator.</li>
		<li>Dag 1: Förkromad 293T cellerna ska vara 70 – 80% konfluenta på dag 1. Utföra den transfection använder f...

<ol>
	<li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology.">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nature Method. 10 (10), 957-963 (2013).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096 (2014).</li><li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+Genome+Editing+and+Beyond.">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+cancer+drug+targets+by+CRISPR-Cas9+screening+of+protein+domains.">Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains.</a> Nature Biotechnology. 33 (6), 661-667 (2015).</li><li>Kuhn, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Chromatin+Regulators+Inhibits+Leukemogenic+Gene+Expression+in+NPM1+Mutant+Leukemia.">Targeting Chromatin Regulators Inhibits Leukemogenic Gene Expression in NPM1 Mutant Leukemia.</a> Cancer Discovery. 6 (10), 1166-1181 (2016).</li><li>Erb, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+control+by+the+ENL+YEATS+domain+in+acute+leukaemia.">Transcription control by the ENL YEATS domain in acute leukaemia.</a> Nature. 543 (7644), 270-274 (2017).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Brinkman, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantification+of+template-directed+CRISPR/Cas9+editing.">Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing.</a> Nucleic Acids Research. 46 (10), 58 (2018).</li><li>Nguyen, A. T., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+functions+of+Dot1+and+H3K79+methylation.">The diverse functions of Dot1 and H3K79 methylation.</a> Genes &amp; Development. 25 (13), 1345-1358 (2011).</li><li>Vlaming, H., van Leeuwen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+upstreams+and+downstreams+of+H3K79+methylation+by+DOT1L.">The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L.</a> Chromosoma. 125 (4), 593-605 (2016).</li><li>Bernt, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MLL-rearranged+leukemia+is+dependent+on+aberrant+H3K79+methylation+by+DOT1L.">MLL-rearranged leukemia is dependent on aberrant H3K79 methylation by DOT1L.</a> Cancer Cell. 20 (1), 66-78 (2011).</li><li>Daigle, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+killing+of+mixed+lineage+leukemia+cells+by+a+potent+small-molecule+DOT1L+inhibitor.">Selective killing of mixed lineage leukemia cells by a potent small-molecule DOT1L inhibitor.</a> Cancer Cell. 20 (1), 53-65 (2011).</li><li>Jo, S. Y., Granowicz, E. M., Maillard, I., Thomas, D., Hess, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+Dot1l+in+murine+postnatal+hematopoiesis+and+leukemogenesis+by+MLL+translocation.">Requirement for Dot1l in murine postnatal hematopoiesis and leukemogenesis by MLL translocation.</a> Blood. 117 (18), 4759-4768 (2011).</li><li>Nguyen, A. T., Taranova, O., He, J., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DOT1L,+the+H3K79+methyltransferase,+is+required+for+MLL-AF9-mediated+leukemogenesis.">DOT1L, the H3K79 methyltransferase, is required for MLL-AF9-mediated leukemogenesis.</a> Blood. 117 (25), 6912-6922 (2011).</li><li>Zuber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toolkit+for+evaluating+genes+required+for+proliferation+and+survival+using+tetracycline-regulated+RNAi.">Toolkit for evaluating genes required for proliferation and survival using tetracycline-regulated RNAi.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 79-83 (2011).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+essential+genes+in+the+human+genome.">Identification and characterization of essential genes in the human genome.</a> Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).</li><li>Li, M. J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+transduction+of+hematopoietic+cells.">Lentivirus transduction of hematopoietic cells.</a> CSH Protocols. 2007, (2007).</li></ol>

I detta manuskript beskriver vi ett detaljerat protokoll för att bedriva en CRISPR-Cas9-baserade konkurrenskraftiga tillväxt analys för att undersöka betydelsen av kandidatgener i AML cellinjer med flödescytometri i mänskliga/murin AML celler (figur 5). Målet med analysen är att identifiera effekten av genen radering på underhåll av AML cell spridning över två till tre veckor på en medium-genomströmning skala. Vissa kritiska steg måste följas noggrant för att underlätta upp...

De senaste decennierna har sett många forskningsinsatser inriktad på att identifiera viktiga molekylära vägar i akut myeloisk leukemi (AML) patogenes bidrag. Traditionellt, har gen-störningar i AML celler utförts med villkorlig knockoutmöss eller kort-hårnål RNA (shRNA). Medan knockoutmöss erbjuder ett sofistikerat system för plats och tid kontroll av gen-strykningen, är generera gen knockoutmöss arbetsintensiva, tidskrävande och dyrt. Dessutom gen-knockouts använda rekombination strategier är inte enkelt skalbar; dessa strategier lämpar inte sig väl till förhör av flera gener parallellt. Efter upptäckten av RNA interferens metoder att knock-down endogena mRNA med små störande RNA (siRNA) eller shRNA, började många grupper använder RNA interferens tekniker för att undersöka betydelsen av specifika gener i AML. Eftersom både murina och mänskliga AML celler är notoriskt svårt att transfect med traditionella lipid-baserade transfection metoder, de flesta studier anställd lentivirally eller retrovirally-kodade shRNA för att studera geners funktion i AML celler. Den senaste upptäckten av klustrade regelbundet mellanliggande kort palindromic repetitioner (CRISPR) och de associerade Cas nukleaser (CRISPR-Cas9) har revolutionerat gen-inriktning teknik1,2,3. Använda CRISPR-Cas9, specifika gener eller genomisk regioner kan tas bort, redigeras eller märkta med effektivitet och lätthet. CRISPR-Cas9-baserade genredigering växer nu fram som metod för val för att utreda genotyp-till-fenotyp relationer i olika celltyper på grund av den enkelhet, effektivitet och bred tillämpligheten av denna teknik. CRISPR-Cas9-baserade metoder blir också metoden för val i AML, inte bara för förhör enskilda gener, men också som ett sätt att rikta flera gener i klädd eller poolade genetiska skärmar som syftar till att undersöka flera gener parallellt som potentiell AML-beroenden4,5,6.
I detta manuskript beskriver vi en enkel konkurrenskraftig tillväxt test för att mäta effekterna av gen-störningar på tillväxten av AML-celler, baserat på stabil CRISPR-Cas9-medierad genredigering följt av hög genomströmning flödescytometri. Denna metod är enkel, effektiv och skalbar till medium-genomströmning experiment för att undersöka rollen av flera gener parallellt i AML celler.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>FLAG-M2 Antibody</td>
			<td>sigma-aldrich</td>
			<td>F3165, lot # SLBS3530V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31446, lot # TA2514341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>34095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imaging System</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>17001401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend RT centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S34859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>SAFC</td>
			<td>12303C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>single gRNA vector</td>
			<td>Addgene #67974</td>
			<td>pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CelLytic Nuclear extraction kit</td>
			<td>sigma-alorich</td>
			<td>NXTRACT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XtremeGENE 9</td>
			<td>sigma-alorich</td>
			<td>6365787001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retronectin</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>NEBioLabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligation buffer</td>
			<td>NEBioLabs</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase enzyme</td>
			<td>NEBioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP9724-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP9731-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen mini-prep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IL-3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IL-6</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>216-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stable competent cells</td>
			<td>NEBiolabs</td>
			<td>C3040I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Tissue Culture dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lysis solution</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein precipitation solution</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA hydration solution</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbSI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0539S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APEX 2.0 X Taq Red Master Mix Kit</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>42-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP2956100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene conical tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>1495949A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene conical tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>1495970C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of genetic dependencies using crispr-cas9-based competition assays

Gen störning studier har använts i stor utsträckning att undersöka betydelsen av enskilda gener i AML patogenes. För att uppnå fullständig gen störningar, många av dessa studier har gjort användningen av komplexa gen knockout modeller. Medan dessa studier med knockoutmöss erbjuder ett elegant och beprövade system för att undersöka genotyp-till-fenotyp relationer, en snabb och skalbar metod för att bedöma kandidatgener som spelar en roll i AML cellproliferation eller överlevnad i AML modeller hjälper påskynda parallell förhör av flera kandidatgener. Senaste framstegen inom editering teknik har dramatiskt förbättrat vår förmåga att utföra genetiska störningar på en aldrig tidigare skådad omfattning. Ett sådant system av gen editering är metoden CRISPR-Cas9-baserad som kan användas för att göra snabba och effektiva förändringar i målet cellen genomet. Den lätthet och skalbarhet av CRISPR/Cas9-medierad gen-strykningen gör det en av de mest attraktiva teknikerna för förhör av ett stort antal gener i fenotypisk analyser. Här presenterar vi en enkel test som använder CRISPR/Cas9 medierad gen-störningar i kombination med hög genomströmning flöde-flödescytometri-baserade konkurrens-analyser för att undersöka rollen av gener som kan spela en viktig roll i spridningen eller överlevnad av mänskliga och murina AML cellinjer.

I vår studie sensorik vi först de MOLM13 mänskliga AML cellinje som bär på MLL-AF9 flyttning med hög-titer virus kodning Cas9-blasticidin lentiviral Plasmiden. I våra händer beskrivs bulk osorterade MOLM13-Cas9 celler visade ingen hög nivå Cas9 uttryck av Western blotting och också inte utföra väl när analyseras för effektiv gen redigering-metoden tidigare7. Därför fortsatte vi att upprätta enda cell kloner och bara välja klonerna med höga nivå...

Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays at JoVE.com

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

Detta manuskript beskriver en klustrad regelbundet mellanliggande kort Palindromic upprepas (CRISPR) CRISPR-Cas9-baserade metod för enkel och snabb undersökning av flera kandidatgener i akut myeloisk leukemi (AML) cellproliferation i roll parallellt. Denna teknik är skalbar och kan appliceras i andra cancer cellinjer samt.

Utredning av genetiska beroenden med CRISPR-Cas9-baserade konkurrens analyser

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

Denna video kommer att visa en enkel metod för att undersöka flera kandidat gener i AML parallellt, med crisper-Cas9 systemet i kombination med flödet cytometri baserad konkurrenskraftig tillväxt analys. Den största fördelen med denna teknik är att den är snabb och skalbar. Demonstrerar proceduren blir Bo Rui Chen, en post doc från vårt labb.En webbaserad CRISPR design programvara används för att utforma fyra till sex enda guide RNAs för genen av intresse. Börja, fyll i lämplig information i fälten med asterisker. Välj sedan målgenomet för enkel guide RNA-design.Klistra in målsekvensen i sekvensrutan, och klicka på skicka-knappen. För kloning i önskad enda guide RNA uttryck plasmid, prepend nukleotiderNA CACC till avkänningen oglionucleotide och AAAC till den omvända gratis antisense oligonucleotide. Färdigblandad känsla och antisense oligonukleotider beställs sedan från ett företag i en 96 brunnsplatta, märkt Oligo Mix.Ställ ut en separat U-Bottom 96 väl platta, märkt Glödgning Plate. Förbered en master mix av en mikroliter av T4 polynukleotid kinas, en mikroliter av 10x T4 DNA-ligation buffert, och sex mikroliter vatten per glödgning reaktion. Tillsätt 8 mikroliter av mastermixen till varje brunn av glödgningsplattan, följt av 2 mikroliter av färdigblandad mening och antisense oligonukleotider.Pipett två till tre gånger försiktigt för att blanda väl, och sedan snurra plattan kort för att få mixarna till botten av brunnarna. Använd följande glödgningsprogram i en PCR-maskin. 37 grader Celsius i 30 minuter, 95 grader Celsius i två minuter och 30 sekunder, följt av långsam kylning till 22 grader Celsius med en hastighet av 0,1 grader Celsius per sekund.När glödgningen är klar, bered en färsk 96 brunnsplatta, märkt Diluted Oligo Mix, genom att späda fosforylerade och glödgade oligonukleotider från glödgningsreaktionen en till 200 med vatten. Linjärisera den enda guide RNA-uttryck vektor genom att smälta fem mikrogram av vektorn med 1,5 mikroliter av BBS1 begränsningsenzym, med hjälp av en lämplig buffert vid 37 grader Celsius i två timmar. Därefter tar du en ny 96 välplatta märkt Ligation Plate, och tillsätt 20 nanogram av BBS1 rötad enda guide RNA-uttrycksvektor till en brunn per önskad enda guide RNA-ligering.Till detta, tillsätt 2 mikroliter av fosforylerade glödgat oligonukleotider från den utspädda Oligo Mix-plattan. Lägg till varje brunn, en mikroliter av 10X T4 ligase buffert, och en mikroliter av T4 ligase enzym, och försiktigt pipetter att blanda. Inkubera plattan i rumstemperatur i två timmar.Om 10 minuter innan ligering reaktion görs, Fyll 90 mikroliter av kemiskt behöriga E.coli celler på is. Överför 10 mikroliter alikvoter av de behöriga cellerna i varje brunn av en separat 96 brunnsplatta individuellt. Tillsätt ligeringsblandningen i brunnarna som innehåller de kompetenta cellerna.Pipett upp och ner försiktigt, och inkubera i rumstemperatur i 10 minuter. Pipetter fem mikroliter av bakterierna DNA blanda från varje omvandling reaktion direkt till en brunn av en 6 väl platta, som innehåller LB agar med 100 milligram per milliliter ampicillin. Tillsätt ungefär fem till åtta glaspärlor i varje brunn, och skaka 6 brunnsplattan åtta till tio gånger i en cirkelrörelse.Inkubera plattorna vid 37 grader Celsius över natten. På följande dag, välj en till två enda kolonier från varje brunn, med en steril 20 microliter pipett spets, och strimma den på en märkt plats på en steril 10 centimeter petriskål, med LB agar och 100 milligram per milliliter ampicillin Efter ränder på LB-plattan, mata ut spetsen i tre milliliter ampicillin medium i en 14 milliliter runda bottenrör , märkt med motsvarande bakteriella klonnummer. Bakterieplattan skickas sedan direkt för Sanger-sekvensering.Efter en sekvensbekräftelse av den klonade enkelguiden RNAs, rena DNA:t från motsvarande 14 milliliterrör, med hjälp av en miniprepsats enligt tillverkarens anvisningar. Single guide RNA lentiviral partiklar produceras i ett 96 brunnsformat, som beskrivs i textprotokollet. Och den virala supernatanten fryses omedelbart vid minus 80 grader Celsius.En dag före transduktion av enda guide RNAs i AML Cas9 celler, päls en platt botten icke vävnad kultur behandlas 96 väl plattan, med 100 milliliter av rekombinanta mänskliga fibronectin fragment vid en koncentration av 10 mikrogram per milliliter. Linda plattan med klängande wrap för att undvika avdunstning förlust, och lämna den på bänken över natten. På följande dag, ta bort rekombinant mänskliga fibronectin fragment från varje brunn av 96 väl plattan.Tina viral supernatant av varje enskild guide RNA vid rumstemperatur. Tillsätt 50 mikroliter av viral supernatant från varje rör till varje bestruken brunn av transduktionsplattan. Linda plattan med plastplast för att undvika potentiell kontaminering vid centrifugeringen.Snurra plattan på 1, 300 gånger g vid 35 grader Celsius i 90 minuter. Mot slutet av spinfection, räkna den höga Cas9 uttrycker klon B3 celler från odlingskolven. Efter att ha räknat, snurra ner det erforderliga antalet celler, och återanvända i färskt medium.Efter 90 minuters spinfection, använd en flerkanalig pipett justerad till 50 mikroliter för att ta bort supernatanten från alla brunnarna långsamt genom att luta plattan. Lägg till 100 mikroliter av kulturen av klon B3 celler till varje väl långsamt, glida ner från fälgen. Snurra plattan på 1, 300 gånger g vid 35 grader Celsius i två minuter för att låta cellerna bosätta sig till botten.Överför plattan till en 37 grader Celsius vävnad kultur grade inkubator. På följande dag, tillsätt 100 mikroliter av färskt medium till varje brunn som innehåller enda guide RNA transduced celler, så att den slutliga medelhög volym är 200 mikroliter. Sätt tillbaka plattan till inkubatorn.72 timmar efter transduktion, kontrollera andelen enstaka guide RNA som innehåller BFP positiva celler i varje brunn genom flödescytometri. Använd en cell livskraft färgämne för att markera och utesluta döda celler från analysen. Fortsätt re-plätering en andel av cellerna i nya brunnar med färskt medium efter varje fakta analys för att undvika överväxt under analysen.Varannan till var tredje dag, upprepa faktaanalysen för att kontrollera den relativa andelen BFP positiva celler jämfört med BFP negativa motsvarigheter. Analysera andelen BFP positiva celler för varje tidpunkt, med hjälp av en faktaanalys programvara. Nyckeln till framgång för den konkurrensutsatta spridningen analysen är att använda rätt gating tekniker för att säkerställa att den eventuella levande cell nummer är korrekta.Dra FCS-filer för varje prov i programvaran. Dubbelklicka på någon en exempelfil, och rita en punkt tomt framåt scatter kontra sida scatter, med framåt scatter på x-axeln, och sidan scatter på y-axeln. Grind alla celler.Dubbelklicka på gated celler, och tomt livskraft fläck på y-axeln kontra framåt scatter höjd eller område punkt tomt. Grinda livskraften fläcken negativa celler. Dubbelklicka på gated live-celler, och rita BFP på y-axeln kontra framåt scatter på x-axeln.Grind BFP positiva celler. Tillämpa alla dessa grindar på alla proverna genom att dra det valda provet till alla prover under fliken grupp. Klicka på bordsredigeraren för att göra en analystabell över alla proverna.Dra BFP-positiva antalet från ett prov till bordet, och klicka på visningsknappen i tabellredigeraren för att skapa en batchrapport av alla samplingar, med tabellen som visar procentandelen BFP-positiva celler. Spara tabellen som en excel-fil. Detta system användes för att undersöka vilken roll gener som kan spela en roll i spridning eller överlevnad av mänskliga och murine AML cellinjer.Inriktning på AAVS1 safe-harbor locus med två separata enda guide RNAs hade ingen effekt på spridningen av mänskliga MOM13 Cas9 celler Däremot när DNA replikation associerade genen, RPA3, var riktade, en progressiv och betydande nedgång i andelen BFP positiva celler jämfört med BFP negativa oöverslämda motsvarigheter observerades. På samma sätt, effekterna av enda guide RNAs inriktning Dot1l, en epigenetiska regulator, och Rhodopsin, ögat pigmentering genen, testades i musen MLL-AF9 Cas9 celler. Single guide RNAs inriktning Dot1l, visade en dramatisk och progressiv nedgång i konkurrenskraftig spridning i motsats till enda guide RNAs inriktning Rhodopsin.Dessa resultat visar sårbarheten hos MLL-AF9 uttrycker massa leukemi celler till Dot1l utarmning, bekräftar tidigare publicerade resultat. Förutsatt att fyra till sex guide RNAs per gen, är denna metod väl lämpad att användas för att testa minst 16 till 24 gener parallellt, och det kan också tillämpas för att testa genberoenden i någon cancer cellinje. När det gäller ett större antal gener, såsom en hel molekylär väg som måste testas i AML-celler, pool CRISPR-Cas9 baserade skärmar kommer att vara mer användbar.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Coculture Analyser för att studera makrofager och mikroglia Stimulering av Glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

Utveckling och underhåll av en preklinisk patient Derived Tumör xenograft modell för undersökning av nya anti-cancerterapier

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal skiva Tumör Modell: Visualisering och kvantifiering av genuttryck och tumör invasiv använda genetiska mosaiker

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-Cell Imaging analyser för studien Glioblastoma hjärnan tumören Stem cellmigration och Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digitala polymeras Chain Reaction Assay för den genetiska variationen i en sporadisk familjär adenomatös polypos Patient med formatet Chip-i-ett-rör

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Bedömning av den metabola profilen av primära leukemiceller

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

Jäst som chassi för att utveckla funktionella analyser för att studera humant p53

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Patient-derived heterogena xenograft modell av pankreascancer med Zebrafish larver som värdar för jämförande drog bedömning

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...