Name: investigation of genetic dependencies using crispr-cas9-based competition assays
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays at JoVE.com

PCW-Cas9 plazmid Eric Lander & David Sabatini (Addgene plazmid # 50661) ve pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - hediyesiydi W plazmid Yusa laboratuarından (Addgene plazmid #67974. Akış Sitometresi çekirdek SBP tıbbi Discovery Enstitüsü'nde akışı analizi ve sıralama ile zamanında yardım için teşekkür etmek istiyorum. Bayan Tata Anıtı Vakfı A.D. için destek kabul etmek istiyoruz Ayrıca aşağıdaki finansman kaynakları destek kabul etmek istiyoruz: NIH/ncı P30 CA030199 Kanser Merkezi Grant sponsorluğunda, V-Vakfı ve San Diego ncı kanser merkezleri (C3) #PTC2017to A.J.D.

1. üreten AML hücre satırı klonlar istikrarlı ve etkin Cas9 yüksek ifadesi ile
<ol><li>Cas9 lentivirus imalatı
	<ol>
<li>0. gün: 10 mL (BSL2) DMEM % 10 fetal Sığır serum (FBS) ve penisilin ve L-glutamin bir 10 cm doku kültürü tabak içinde bir Biyogüvenlik seviye 2 ile plaka 4 x 106 293T hücrelerde hücre kültür hood sertifikalı. Çanak 37 ° C kuluçka makinesine koyun.</li>
		<li>1. gün: Kaplama 293T hücreleri % 70 – 80 birleşmesi 1 gün olmalıdır. Öğleden sonra...

<ol>
	<li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology.">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nature Method. 10 (10), 957-963 (2013).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096 (2014).</li><li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+Genome+Editing+and+Beyond.">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+cancer+drug+targets+by+CRISPR-Cas9+screening+of+protein+domains.">Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains.</a> Nature Biotechnology. 33 (6), 661-667 (2015).</li><li>Kuhn, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Chromatin+Regulators+Inhibits+Leukemogenic+Gene+Expression+in+NPM1+Mutant+Leukemia.">Targeting Chromatin Regulators Inhibits Leukemogenic Gene Expression in NPM1 Mutant Leukemia.</a> Cancer Discovery. 6 (10), 1166-1181 (2016).</li><li>Erb, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+control+by+the+ENL+YEATS+domain+in+acute+leukaemia.">Transcription control by the ENL YEATS domain in acute leukaemia.</a> Nature. 543 (7644), 270-274 (2017).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Brinkman, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantification+of+template-directed+CRISPR/Cas9+editing.">Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing.</a> Nucleic Acids Research. 46 (10), 58 (2018).</li><li>Nguyen, A. T., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+functions+of+Dot1+and+H3K79+methylation.">The diverse functions of Dot1 and H3K79 methylation.</a> Genes &amp; Development. 25 (13), 1345-1358 (2011).</li><li>Vlaming, H., van Leeuwen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+upstreams+and+downstreams+of+H3K79+methylation+by+DOT1L.">The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L.</a> Chromosoma. 125 (4), 593-605 (2016).</li><li>Bernt, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MLL-rearranged+leukemia+is+dependent+on+aberrant+H3K79+methylation+by+DOT1L.">MLL-rearranged leukemia is dependent on aberrant H3K79 methylation by DOT1L.</a> Cancer Cell. 20 (1), 66-78 (2011).</li><li>Daigle, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+killing+of+mixed+lineage+leukemia+cells+by+a+potent+small-molecule+DOT1L+inhibitor.">Selective killing of mixed lineage leukemia cells by a potent small-molecule DOT1L inhibitor.</a> Cancer Cell. 20 (1), 53-65 (2011).</li><li>Jo, S. Y., Granowicz, E. M., Maillard, I., Thomas, D., Hess, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+Dot1l+in+murine+postnatal+hematopoiesis+and+leukemogenesis+by+MLL+translocation.">Requirement for Dot1l in murine postnatal hematopoiesis and leukemogenesis by MLL translocation.</a> Blood. 117 (18), 4759-4768 (2011).</li><li>Nguyen, A. T., Taranova, O., He, J., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DOT1L,+the+H3K79+methyltransferase,+is+required+for+MLL-AF9-mediated+leukemogenesis.">DOT1L, the H3K79 methyltransferase, is required for MLL-AF9-mediated leukemogenesis.</a> Blood. 117 (25), 6912-6922 (2011).</li><li>Zuber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toolkit+for+evaluating+genes+required+for+proliferation+and+survival+using+tetracycline-regulated+RNAi.">Toolkit for evaluating genes required for proliferation and survival using tetracycline-regulated RNAi.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 79-83 (2011).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+essential+genes+in+the+human+genome.">Identification and characterization of essential genes in the human genome.</a> Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).</li><li>Li, M. J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+transduction+of+hematopoietic+cells.">Lentivirus transduction of hematopoietic cells.</a> CSH Protocols. 2007, (2007).</li></ol>

Bu makale, biz aday genler akış sitometresi insan/antikorundan AML hücrelerinde (Şekil 5) kullanarak AML hücre hatlarında rolünü araştırmak için bir CRISPR-Cas9-tabanlı rekabet büyüme tahlil yürütmek için detaylı bir protokol tanımlamak. Testin amacı iki ya da üç hafta boyunca bir orta-den geçerek ölçekte bakım gen silinmesiyle AML hücre çoğalması etkisini belirlemektir. Bazı kritik adımlar dikkatle açıklanan protokolünden yükseltme kolaylaştırmak için ...

Son birkaç on yıl çok sayıda araştırma çabalarının anahtar moleküler yolları akut miyeloid lösemi (AML) patogenezinde katkısı belirlenmesi üzerinde duruldu gördüm. Geleneksel olarak, gen-bozulma AML hücrelerdeki koşullu nakavt fareler veya kısa saç tokası RNA (shRNA) kullanılarak yapılmıştır. Nakavt fareler gen-silme spatio-temporal kontrolü için gelişmiş bir sistem sunarken, gen nakavt fareler üreten emek, zaman alıcı ve pahalı. Ayrıca, gen-knockouts rekombinasyon stratejileri kullanarak kolayca ölçeklenebilir; değildir Bu stratejileri kendilerini de paralel olarak çeşitli genler sorgulama için borç yoktur. RNA müdahale yöntemleri için küçük müdahale RNA (siRNA) veya shRNA kullanarak knock-down endojen mRNA'ların keşfi sonra birçok grup AML belirli genlerin rolünü araştırmak için RNA müdahale teknikleri kullanmaya başladı. Fare ve insan AML hücreleri geleneksel transfection lipid tabanlı yöntemleri kullanarak transfect Rootkitler zor olduğundan, çoğu gen işlevi AML hücrelerinde çalışmak için lentivirally istihdam veya retrovirally kodlanmış shRNA çalışmalar. Son keşfi düzenli olarak interspaced kısa palindromik yineler (CRISPR) kümelenmiş ve ilişkili Cas enzimler (CRISPR-Cas9) teknolojileri1,2,3gen hedefleme devrim. CRISPR-Cas9 kullanarak, belirli genler ve genomik bölgeler silinmiş, düzenlenemez veya verimliliği ve kolaylığı ile etiketlenmiş. CRISPR-Cas9-esaslı gen-düzenleme şimdi genotip fenotip ilişkileri farklı hücre tipleri basitlik, etkinlik ve bu tekniğin geniş uygulanabilirliği nedeniyle soruşturma için seçtiğiniz yöntemi olarak ortaya çıkıyor. CRISPR-Cas9-tabanlı yöntemleri da yönteminin seçimi AML, sadece bireysel genler sorguluyor, ama birden çok gen dizilmiş veya havuza alınan genetik ekranlarda hedef için bir yol amaçlı olarak da paralel potansiyel olarak birkaç genleri araştıran hale geliyor AML-bağımlılıkları4,5,6.
Bu makale, gen-bozulma istikrarlı CRISPR-Cas9-aracılı gen-yüksek üretilen iş akış sitometresi tarafından takip düzenleme temel alan AML hücrelerinin büyümesini üzerinde etkisini ölçmek için bir basit rekabetçi büyüme tahlil açıklar. Bu yöntem basit, verimli ve ölçeklenebilir paralel AML hücrelerinde birkaç genlerin rolünün araştırılması için orta-den geçerek deneyler için kullanılabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>FLAG-M2 Antibody</td>
			<td>sigma-aldrich</td>
			<td>F3165, lot # SLBS3530V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31446, lot # TA2514341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>34095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imaging System</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>17001401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend RT centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S34859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>SAFC</td>
			<td>12303C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>single gRNA vector</td>
			<td>Addgene #67974</td>
			<td>pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CelLytic Nuclear extraction kit</td>
			<td>sigma-alorich</td>
			<td>NXTRACT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XtremeGENE 9</td>
			<td>sigma-alorich</td>
			<td>6365787001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retronectin</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>NEBioLabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligation buffer</td>
			<td>NEBioLabs</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase enzyme</td>
			<td>NEBioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP9724-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP9731-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen mini-prep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IL-3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IL-6</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>216-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stable competent cells</td>
			<td>NEBiolabs</td>
			<td>C3040I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Tissue Culture dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lysis solution</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein precipitation solution</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA hydration solution</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbSI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0539S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APEX 2.0 X Taq Red Master Mix Kit</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>42-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP2956100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene conical tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>1495949A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene conical tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>1495970C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of genetic dependencies using crispr-cas9-based competition assays

Gene pertürbasyon çalışmalar yoğun bireysel gen AML patogenezinde rol araştırmak için kullanılmaktadır. Tam gene bozulma ulaşmak için birçok bu çalışmalar yapmış karmaşık gen nakavt modelleri kullanın. Bu çalışmalar nakavt fareler ile genotip fenotip ilişkileri araştıran bir zarif ve zaman test sistemi sunarken, aday genler değerlendirmek için hızlı ve ölçeklenebilir bir yöntem bu AML hücre çoğalması bir rol veya AML modelleri hayatta kalma oynamak paralel sorgu birden fazla aday gen hızlandırmak yardımcı olacaktır. Genom düzenleme teknolojileri son gelişmeler önemli ölçüde bizim yeteneği benzeri görülmemiş ölçekte bir genetik tedirginlikler gerçekleştirmek için gelişmiş var. Genom düzenleme bir tür hedef hücre genom hızlı ve etkili değişiklik yapma için kullanılan yöntemi CRISPR Cas9 göre sistemidir. Kolaylık ve CRISPR/Cas9-aracılı gen-silme ölçeklenebilirliğini yapar çok sayıda gen sorgulama için en cazip tekniklerden birini fenotipik deneyleri. Burada, nükleer silahların yayılmasına karşı önemli bir rol oynayabilir genlerin rolünün veya insan yaşama araştırmak için CRISPR/Cas9 aracılı gen-kesinti yüksek üretilen iş akış sitometresi-tabanlı rekabet deneyleri ile kombine kullanarak basit bir tahlil mevcut ve fare AML hücre hatları.

Bizim çalışmada, ilk MLL-AF9 translocation Cas9-blasticidin lentiviral plazmid kodlama yüksek titresi virüs taşıyan MOLM13 insan AML hücre kültürünü transduced. Elimizde, sıralanmamış MOLM13-Cas9 hücreleri yüksek düzey Cas9 ifade Western blot tarafından göstermedi ve aynı zamanda ne zaman de verimli gen için düzenleme yöntemi kullanılarak denenecektir gerçekleştirmedi toplu7daha önce açıklanan. Bu nedenle, tek hücre klonlar kurmak ve ...

Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays at JoVE.com

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

Bu el yazması için basit ve ivedi soruşturma akut miyeloid lösemi (AML) hücre çoğalması içinde birden çok aday genlerin rolünün bir kümelenmiş düzenli olarak Interspaced kısa palindromik yineler (CRISPR) CRISPR-Cas9-tabanlı yöntemi açıklar paralel. Bu teknik ölçeklenebilir ve de diğer kanser hücre hatlarında uygulanabilir.

CRISPR-Cas9-tabanlı rekabet deneyleri kullanarak genetik bağımlılıkları incelenmesi

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

Bu video paralel olarak AML birden fazla aday genleri araştırmak için basit bir yöntem gösterecektir, akış sitometri dayalı rekabetçi büyüme tsay ile birlikte Crisper-Cas9 sistemi kullanarak. Bu tekniğin en büyük avantajı hızlı ve ölçeklenebilir olmasıdır. Prosedürü gösteren Bo Rui Chen, laboratuarımızdan bir post doc olacaktır.Bir web tabanlı CRISPR tasarım yazılımı ilgi geni için dört ila altı tek kılavuz RNA tasarlamak için kullanılır. Başlamak için, alanlardaki uygun bilgileri yıldız işaretleriyle doldurun. Daha sonra tek kılavuz RNA tasarımı için hedef genomu seçin.Hedef sırasını sıra kutusuna yapıştırın ve gönder düğmesine tıklayın. İstenilen tek kılavuz RNA ekspresyonu plazmid klonlama için, ters ücretsiz antisense oligonükleotid anlamda oglionükleotid ve AAAC nükleotid CACC prepend. Premix anlamda ve antisense oligonükleotidler sonra bir şirketten sipariş edilir 96 iyi plaka, Oligo Mix etiketli.Ayrı bir U-Bottom 96 kuyu plakası, Annealing Plaka etiketli ayarlayın. T4 polinükleotid kizaz bir mikrolitre ana karışımını hazırlayın, 10x T4 DNA ligasyon tampon bir mikrolitre, ve annealing reaksiyon başına su altı mikrolitre. Annealing Plaka her kuyuya ana karışımı 8 mikrolitre ekleyin, premix anlamda ve antisense oligonükleotid2 mikrolitre takip.Pipet iki ila üç kez yavaşça iyice karıştırın ve sonra kuyuların dibine karışımları almak için kısa bir süre plaka spin. Bir PCR makinesinde aşağıdaki annealing programını kullanın. 30 dakika boyunca 37 santigrat derece, iki dakika ve 30 saniye boyunca 95 santigrat derece, saniyede 0.1 santigrat derece hızında 22 santigrat derece yavaş soğutma izledi.Annealing tamamlandığında, su ile 200 annealing reaksiyon1-200 fosforlu ve annealed oligonükleotidseyrelterek, Seyreltilmiş Oligo Mix etiketli taze bir 96 kuyu plaka sıyrık. Tek kılavuz RNA ekspresyon vektörü, 1,5 mikrolitre BBS1 restriksiyon enzimi ile vektörün beş mikrogramını sindirerek, 37 santigrat derecede iki saat boyunca uygun bir tampon kullanarak doğrusallaştırın. Sonra, yeni bir almak 96 iyi plaka Ligation Plaka etiketli, ve BBS1 sindirilmiş tek kılavuz RNA ifade vektörü 20 nanogram eklemek bir iyi her istenilen tek kılavuz RNA ligasyon.Buna seyreltilmiş Oligo Mix plakasından 2 mikrolitre fosforilasyonlu annealize oligonükleotid ekleyin. Her kuyuya, bir mikrolitre 10X T4 ligaz tamponu ve bir mikrolitre T4 ligaz enzimi ekleyin ve yavaşça pipet karıştırın. Tabağı oda sıcaklığında iki saat kuluçkaya yatırın.Ligasyon reaksiyonu bitmeden yaklaşık 10 dakika önce, 90 mikrolitre kimyasal olarak yetkin E.coli hücrelerini buz üzerinde doldurun. Ayrı bir 96 kuyu plakasının her bir kuyuya yetkili hücrelerin 10 mikrolitre aliquots aktarın. Yetkili hücreleri içeren kuyulara ligasyon karışımı ekleyin.Pipet yavaşça yukarı ve aşağı, ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka. Pipet bakteri DNA karışımı her dönüşüm reaksiyondoğrudan bir kuyu içine 6 kuyu plaka, ampisilin mililitre başına 100 miligram lb agar içeren. Her kuyuya yaklaşık 5-8 cam boncuk ekleyin ve dairesel bir hareketle 6 kuyu plakasını 8-10 kez sallayın.Plakaları bir gecede 37 derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, steril 20 mikrolitre lik pipet ucu ile her kuyudan bir ila iki tek koloni seçin ve steril 10 santimetre petri kabında etiketli bir noktaya çizgi, LB agar ve mililitre başına 100 miligram ampisilin ile LB plakaüzerine streaking sonra, 14 mililitre yuvarlak alt tüp içinde ampicillin orta üç mililitre içine ucu çıkarmak , ilgili bakteriyel klon numarası ile işaretlenir. Bakteriyel plaka daha sonra doğrudan Sanger sıralama için gönderilir.Klonlanmış tek kılavuz RNA'ların sıralı bir teyidinden sonra, üreticinin talimatlarına uygun bir miniprep kiti kullanarak, ilgili 14 mililitrelik tüpten DNA'yı arındırın. Tek kılavuz RNA lentiviral parçacıklar metin protokolünde açıklandığı gibi, 96 iyi formatta üretilmektedir. Ve viral süpernatant hemen eksi 80 derecede dondurulur.AML Cas9 hücrelerinde tek kılavuz RNA'ların transdüksiyonundan bir gün önce, mililitrede 10 mikrogram konsantrasyonda 100 mililitre rekombinant insan fibronektin parçası ile düz bir alt doku dışı kültür 96 iyi plaka tedavi edilir. Buharlaşma kaybını önlemek için plakayı sargı sargı ile sarın ve bir gece boyunca bankta bırakın. Ertesi gün, 96 kuyu plaka her kuyudan rekombinant insan fibronektin parçası çıkarın.Oda sıcaklığında her bir kılavuz RNA viral supernatant çözülme. Transdüksiyon plakasının her kaplanmış kuyusu için her tüpten 50 mikrolitre viral süpernatant ekleyin. Santrifüj sırasında olası kirlenmeyi önlemek için plakayı yapışkan sargı ile sarın.90 dakika boyunca 35 santigrat derece de 1, 300 kez g plaka spin. Spenfeksiyon sonuna doğru, kültür şişesinden klon B3 hücrelerini ifade eden yüksek Cas9'u sayın. Saydıktan sonra, gerekli sayıda hücreaşağı spin ve taze ortamda resuspend.90 dakikalık spinfection'ten sonra, plakayı yavaşça yatırarak süpernatantı tüm kuyulardan çıkarmak için 50 mikrolitreye ayarlanmış çok kanallı bir pipet kullanın. Her iyi yavaş yavaş, jant aşağı kayan, klon B3 hücrelerinin kültürünün 100 mikrolitre ekleyin. Hücreleri dibe yerleşmek için iki dakika boyunca 35 santigrat derece de 1, 300 kez g plaka spin.Plakayı 37 santigrat derece doku kültürü sınıfı kuluçka makinesine aktarın. Ertesi gün, tek kılavuz Lure transduced hücreleri içeren her kuyuya 100 mikrolitre taze ortam ekleyin, böylece son orta hacmi 200 mikrolitredir. Tabağı kuvöze geri ver.Transdüksiyondan 72 saat sonra, akış sitometrisi ile her kuyuda BFP pozitif hücreler içeren tek kılavuz RNA yüzdesini kontrol edin. Ölü hücreleri analizden işaretlemek ve dışlamak için hücre canlılığı boyası kullanın. Tahlil sırasında aşırı büyümeyi önlemek için her olgu analizinden sonra hücrelerin bir kısmını taze ortamla yeni kuyulara yeniden kaplamaya devam edin.Her iki ila üç günde bir, BFP pozitif hücrelerin bfp negatif karşıtlarına göre göre göreli oranını kontrol etmek için gerçekler analizini tekrarlayın. Olgu analizi yazılımını kullanarak her zaman noktası için BFP pozitif hücrelerinin yüzdesini analiz edin. Rekabetçi çoğalma tsay başarısının anahtarı nihai canlı hücre numaraları doğru olduğundan emin olmak için uygun gating teknikleri kullanmaktır.Her örnek için FCS dosyalarını yazılıma sürükleyin. Herhangi bir örnek dosyaya çift tıklayın ve x ekseninde ileri dağılım ve y ekseninde yan dağılım ile ileri dağılım ayarı çizin. Tüm hücreleri kapıla.Kapılı hücrelere çift tıklayın ve y ekseninde canlılık lekesini öne doğru dağılım yüksekliğine veya alan nokta çizimine göre çizin. Canlılık lekesi negatif hücreleri kapa. Geçitli canlı hücrelere çift tıklayın ve x ekseninde y ekseninde ve ileri dağılıma karşı BFP'yi çizin.BFP pozitif hücreleri açın. Seçili örneği grup sekmesi altındaki tüm örneklere sürükleyerek tüm bu kapıları tüm örneklere uygulayın. Tüm örneklerin analiz tablosunu yapmak için tablo düzenleyicisine tıklayın.BFP pozitif sayısını bir örnekten tabloya sürükleyin ve tablo düzenleyicisi'ndeki ekran düğmesini tıklatarak tüm örneklerin toplu raporunu oluşturun ve tablo BFP pozitif hücrelerin yüzdesini görüntüler. Tabloyu excel dosyası olarak kaydedin. Bu sistem, insan ve murine AML hücre hatlarının yayılmasında veya hayatta kalmasında rol oynayabilecek genlerin rolünü araştırmak için kullanılmıştır.AAVS1 güvenli liman lokusunun iki ayrı tek kılavuz lu RNA'ların insan MOM13 Cas9 hücrelerinin çoğalması üzerinde hiçbir etkisi olmadığı, buna karşılık, DNA replikasyonu ile ilişkili gen RPA3 hedeflendiğinde, BFP pozitif hücrelerinin yüzdesinde BFP negatif untransduced muadillerine göre ilerleyici ve anlamlı bir düşüş gözlenmiştir. Benzer şekilde, bir epigenetik regülatör olan Dot1l'i ve göz pigmentasyon geni Rodopsin'i hedefleyen tek kılavuz RNA'ların etkileri fare MLL-AF9 Cas9 hücrelerinde test edildi. Dot1l hedefleyen tek kılavuz RNA'lar, Rodopsin'i hedefleyen tek kılavuz RNA'ların aksine rekabetçi çoğalmada dramatik ve ilerici bir düşüş göstermiştir.Bu sonuçlar, daha önce yayınlanmış sonuçları doğrulayan, Dot1l tükenmesine kitle lösemi hücrelerini ifade eden MLL-AF9'un savunmasızlığını göstermektedir. Gen başına dört ila altı kılavuz RNA varsayarsak, bu yöntem de paralel olarak en az 16-24 gentest için kullanılmak üzere uygundur, ve aynı zamanda herhangi bir kanser hücresi hattında gen bağımlılıkları test etmek için uygulanabilir. AML hücrelerinde test edilmesi gereken moleküler yol gibi daha fazla sayıda gen olması durumunda, CRISPR-Cas9 tabanlı ekranlar daha yararlı olacaktır.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Coculture Tahliller Glioblastoma Invasion Makrofaj ve Mikroglia Stimülasyon Eğitim için

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

Bir Klinik öncesi Hasta Türetilmiş Tümör Roman Anti-Kanser Tedaviler Soruşturma Xenograftlarında Modeli Geliştirilmesi ve Bakımı

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

<em&gt; Drosophila</em&gt; Hayali Disk Tümör Modeli: Genetik Mozaikler kullanma Gen İfade ve Tümör invazivliğinin Görselleştirme ve

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Canlı hücre görüntüleme deneyleri için çalışma Glioblastoma Beyin tümör kök hücre göç ve işgali

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Dijital polimeraz zincir reaksiyonu tahlil için tüp içinde çip biçimini kullanarak bir sporadik ailesel Adenomatous poliposis hastada genetik varyasyon

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Birincil lösemi hücrelerinin metabolik profili değerlendirilmesi

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

Insan p53 çalışma fonksiyonel Assays geliştirmek için bir şasi olarak Maya

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Karşılaştırmalı Ilaç değerlendirmesi için ev sahipleri olarak zebrafish larvaları kullanarak pankreas kanserinin hasta türevi heterojen xenograft modeli

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...