Name: an immunohistopathologic study to profile the folate receptor beta macrophage and vascular immune microenvironment in giant cell arteritis
Uploaded: 2019-02-08T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Immunohistopathologic Study to Profile the Folate Receptor Beta Macrophage and Vascular Immune Microenvironment in Giant Cell Arteritis at JoVE.com

Dette arbejde blev muliggjort med støtte fra Dr. Douglas Stairs, Marianne Klinger, Ann Benko, Division for reumatologi/Institut for medicin og molekylær og histopatologisk Core laboratorium, Penn State University College of Medicine, Hershey PA.

Alle metoder beskrevet blev godkendt af Penn State institutionelle Review Board.
1. histopatologiske forberedelse og behandling efter at have indhentet tidsmæssige arterie biopsi
Bemærk: Den tidsmæssige arterie biopsi (FANE) er udført under lokalbedøvelse og sterile forhold af en certificeret kirurg. Efter kirurgisk opnå en 3 cm arteriel sektion på den mere ramte side, modellen er fastsat i formalin straks for 24 h, opdelt i 3-4 mm sektioner, ...

<ol>
	<li>Klippel, J. H., Stone, J. H., White, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Primer on the rheumatic diseases. , (2008).</li><li>Weyand, C. M., Goronzy, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+mechanisms+in+medium+and+large-vessel+vasculitis.">Immune mechanisms in medium and large-vessel vasculitis.</a> Nature Reviews Rheumatol. 9 (12), 731-740 (2013).</li><li>Weyand, C. M., Liao, Y. J., Goronzy, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunopathology+of+giant+cell+arteritis:+diagnostic+and+therapeutic+implications.">The immunopathology of giant cell arteritis: diagnostic and therapeutic implications.</a> Journal of Neuro-ophthalmology. 32 (3), 259-265 (2012).</li><li>Deng, J., Younge, B., Olshen, R., Goronzy, J., Weyand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th17+and+Th1+T-cell+responses+in+giant+cell+arteritis.">Th17 and Th1 T-cell responses in giant cell arteritis.</a> Circulation. 121, 906-915 (2010).</li><li>Mahr, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjunctive+methotrexate+for+treatment+of+giant+cell+arteritis:+an+individual+patient+data+meta-analysis.">Adjunctive methotrexate for treatment of giant cell arteritis: an individual patient data meta-analysis.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 56 (8), 2789-2797 (2007).</li><li>Hoffman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicenter,+randomized,+double-blind,+placebo-controlled+trial+of+adjuvant+methotrexate+treatment+for+giant+cell+arteritis.">A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled trial of adjuvant methotrexate treatment for giant cell arteritis.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 46 (5), 1309-1318 (2002).</li><li>Stone, J. H., Klearman, M., Collinson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trial+of+Tocilizumab+in+Giant-Cell+Arteritis.">Trial of Tocilizumab in Giant-Cell Arteritis.</a> New England Journal of Medicine. 377 (15), 1494-1495 (2017).</li><li>Milman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tocilizumab+increased+sustained+glucocorticoid-free+remission+from+giant+cell+arteritis.">Tocilizumab increased sustained glucocorticoid-free remission from giant cell arteritis.</a> Annals of Internal Medicine. 167 (12), JC63 (2017).</li><li>Xia, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+folate+receptor+is+induced+during+macrophage+activation+and+can+be+used+to+target+drugs+to+activated+macrophages.">A functional folate receptor is induced during macrophage activation and can be used to target drugs to activated macrophages.</a> Blood. 113 (2), 438-446 (2009).</li><li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folate+receptor-beta+constitutes+a+marker+for+human+proinflammatory+monocytes.">Folate receptor-beta constitutes a marker for human proinflammatory monocytes.</a> Journal of Leukocyte Biology. 96 (4), 563-570 (2014).</li><li>Salazar, M. D., Ratnam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+folate+receptor:+what+does+it+promise+in+tissue-targeted+therapeutics.">The folate receptor: what does it promise in tissue-targeted therapeutics.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 26 (1), 141-152 (2007).</li><li>Low, P. S., Henne, W. A., Doorneweerd, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+development+of+folic-acid-based+receptor+targeting+for+imaging+and+therapy+of+cancer+and+inflammatory+diseases.">Discovery and development of folic-acid-based receptor targeting for imaging and therapy of cancer and inflammatory diseases.</a> Accounts of Chemical Research. 41 (1), 120-129 (2008).</li><li>Puig-Kroger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folate+receptor+beta+is+expressed+by+tumor-associated+macrophages+and+constitutes+a+marker+for+M2+anti-inflammatory/regulatory+macrophages.">Folate receptor beta is expressed by tumor-associated macrophages and constitutes a marker for M2 anti-inflammatory/regulatory macrophages.</a> Cancer Research. 69 (24), 9395-9403 (2009).</li><li>Nakashima-Matsushita, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+expression+of+folate+receptor+beta+and+its+possible+role+in+methotrexate+transport+in+synovial+macrophages+from+patients+with+rheumatoid+arthritis.">Selective expression of folate receptor beta and its possible role in methotrexate transport in synovial macrophages from patients with rheumatoid arthritis.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 42 (8), 1609-1616 (1999).</li><li>vander Heijden, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folate+receptor+beta+as+a+potential+delivery+route+for+novel+folate+antagonists+to+macrophages+in+the+synovial+tissue+of+rheumatoid+arthritis+patients.">Folate receptor beta as a potential delivery route for novel folate antagonists to macrophages in the synovial tissue of rheumatoid arthritis patients.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 60 (1), 12-21 (2009).</li><li>Jansen, G., Peters, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+in+folate+receptors+and+transporters:+implications+for+disease+and+treatment+of+immune+diseases+and+cancer.">Novel insights in folate receptors and transporters: implications for disease and treatment of immune diseases and cancer.</a> Pteridines. 26 (2), 41-53 (2015).</li><li>Albano-Aluquin, S., Malysz, J., Aluquin, V. R., Ratnam, M., Olsen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunohistochemical+analysis+of+folate+receptor+beta+expression+and+distribution+in+giant+cell+arteritis+-+a+pilot+study.">An immunohistochemical analysis of folate receptor beta expression and distribution in giant cell arteritis - a pilot study.</a> American Journal of Clinical and Experimental Immunology. 6 (6), 107-114 (2017).</li><li>Ross, J. F., Chaudhuri, P. K., Ratnam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+folate+receptor+isoforms+in+normal+and+malignant+tissues+in+vivo+and+in+established+cell+lines.+Physiologic+and+clinical+implications.">Differential regulation of folate receptor isoforms in normal and malignant tissues in vivo and in established cell lines. Physiologic and clinical implications.</a> Cancer. 73 (9), 2432-2443 (1994).</li><li>Reiner, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+molecular+biology.+Macrophages+and+dendritic+cells.+Methods+and+protocols.+Preface.">Methods in molecular biology. Macrophages and dendritic cells. Methods and protocols. Preface.</a> Methods in Molecular Biology. 531, (2009).</li><li>Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunofluorescence+labelling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+tissue.">Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BMC Cell Biology. 9, 13 (2008).</li><li>Pawlina, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histology: A text and atlas with correlated cell and molecular biology. , (2016).</li><li>Kumar, V., Abbas, A., Robbins Aster, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Robbins and Cotran pathologic basis of disease. , (2015).</li><li>Dabbs, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Diagnostic immunohistochemistry. , (2019).</li><li>Ross, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folate+receptor+type+beta+is+a+neutrophilic+lineage+marker+and+is+differentially+expressed+in+myeloid+leukemia.">Folate receptor type beta is a neutrophilic lineage marker and is differentially expressed in myeloid leukemia.</a> Cancer. 85 (2), 348-357 (1999).</li><li>Holzapfel, G. A., Fratzl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+in+arterial+walls:+biomechanical+aspects.">Collagen in arterial walls: biomechanical aspects.</a> Collagen. Structure and Mechanics. , 285-324 (2008).</li><li>Sultan, H., Smith, S. V., Lee, A. G., Chevez-Barrios, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathologic+Markers+Determining+Prognosis+in+Patients+with+Treated+or+Healing+Giant+Cell+Arteritis.">Pathologic Markers Determining Prognosis in Patients with Treated or Healing Giant Cell Arteritis.</a> American Journal of Ophthalmology. , (2018).</li></ol>

GCA er den mest almindelige vaskulitis hos voksne, og dens patologiske hallmark eksemplificerer en potent kombination af T helper lymfocytter og aktiveret makrofager, der kan også findes i andre granulomatøs sygdomme eller vasculopathies som sarcoidose og granulomatøs polyangiitis2,3. I GCA, den tidsmæssige arterie giver en god repræsentation af en medium til large størrelse arterie og TA biopsi giver en betragtelig stikprøve, der kan gemmes i paraffinblok...

Kæmpe celle arteritis (GCA) er en inflammatorisk sygdom i mellemstore til store arterier, målretning aorta og dens grene og påvirker ældre voksne. Det præsenterer med mild til svær iskæmiske komplikationer såsom hovedpine, kæbesmerter, synstab, slagtilfælde og væv koldbrand. Diagnosen er bekræftet af høje inflammatoriske markører som blodsænkning (ESR) og en særskilt histopatologisk mønster på den tidsmæssige arterie biopsi (FANE)1. GCA er den mest almindelige voksne vaskulitis, og tilgængeligheden af den tidsmæssige arterie opnået for diagnose præsenterer en fordel over andre vasculopathies, således at en til at studere dens patogenese lettere. De typiske fund på fanen omfatte en infiltrere makrofager/histiocytes og T-lymfocytter, der findes på tværs af alle vaskulære lag af tunica intima, media og adventitia med samtidige ødelæggelse af det elastiske lamina, der normalt adskiller disse rum2. Den nuværende dokumentation viser, GCA indebærer en ukendt antigen, der aktiverer dendritiske celler i det vaskulære adventitia, efterfulgt af ansættelse af hjælper T (Th) celler, specielt Th1 og Th17 undertyper, som udskiller interleukin-17 og interferon-gamma (IFG) henholdsvis. IFG så rekrutter og aktiverer makrofager at producere cytokiner og proteaser. Disse omfatter pro-inflammatoriske cytokiner; herunder IL-12, som gensidigt aktiverer Th1 celler giver dermed en positiv feedback loop; tumor nekrose faktor og interleukin-6, som forårsager gigt og feber og metalloproteases, der skader den elastiske lamina. Glukokortikoider (GC), som udgør den standard kronisk terapi, styre delvist cytokin veje af formildende Th17/IL-17 men ikke Th1/IFG armen af immunrespons3,4. Desværre, seponering af GC resulterer i sygdom tilbagefald. Som en alternativ modalitet, methotrexat har været repurposed GCA behandling, men de ønskede kliniske endepunkter var ikke konsekvent opnået selv om mere følsomme biomarkører ikke har blevet udnyttet for terapeutisk overvågning5,6 . I 2017, blev interleukin 6 blocker, tocilizumab, godkendt til behandling af GCA som det effektivt demonstreret sygdomsbekæmpelse og steroid besparende effekter7,8.
Til dato, er der ingen gode biomarkører for GCA. Som følge heraf er det vanskeligt at overvåge sygdomsaktivitet og titreres doser af tilgængelige lægemidler til at undgå negative virkninger og mindske byrden af omkostninger for samfundet. Det er således bydende nødvendigt at lede efter en kandidat biomarkør, korrelerer med sygdomsaktivitet, giver nye indsigter om patogenese og støtte i terapeutiske beslutninger.
Dysregulering af makrofag aktivering er en kritisk faktor i GCA patogenese. Et effektivt middel til behandling af GCA kan således selektiv målretning af aktiverede makrofager. Folat receptor beta (FRB) er en glycosyl-phosphatidylinositol glykoprotein, der er forankret på cellemembranen udtrykt i normal myelomonocytic celler, myeloid leukæmiceller og aktiverede makrofager. Dets ligand, folinsyre, er et vigtigt vitamin i sin reduceret form, som giver cellulære DNA syntese, methylering og reparation9. FRB udtryk er induceret i autoimmun sygdom og under carcinogenese. Dens udtryk er begrænset til overfladen af monocytter eller pro-inflammatoriske M1 makrofager i reumatoid artritis, eller til anti-inflammatoriske M2 makrofager i solid orgel og myeloide maligniteter10,11,12 , 13. ud over dens potentielle rolle som en biomarkør for aktiverede makrofager, FRB kan aktivere selektive stof transport gennem en multi-trins proces, der starter med receptor binding til folinsyre, antifolates eller folat-konjugeret narkotika på cellen overflade, efterfulgt af internalisering, udgivelse og eventuel levering af ønskede stof til de indre celle maskiner12,14,15,16. I modsætning til FRB udtrykt i kræftceller og aktiverede makrofager, FRB udtrykt i normal hæmatopoietisk celler er i stand til at binde folater, hvorved det sikres, at FRB/folat-medieret medicinafgivelse er begrænset til FRB-positive inflammatoriske eller kræftceller.
I vores tidligere undersøgelse, vi viste for første gang, at FRB udtrykkes i GCA makrofager og sit udtryk korreleret med CD68 + og endothelin receptor beta makrofager, som bidrager til GCA patogenese17. I denne betænkning, vi beskrive den histopatologiske og immunhistokemiske metoder anvendt til at vurdere FRB makrofag, og analyseret den samlede lymfocytter og makrofager tæller for at få indsigt i FRB'S position i GCA vaskulære landskab.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Reichert-Jung</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plain and frosted microscope slides and cover slips</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical rack</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Olympus BX60&#160; microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone in distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>concentrations 100%, 90%, 70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered saline solution (TBS)&#160;</td>
			<td>Dako Wash BufferS3006</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% hydrogen peroxide in TBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaminobenzidine (DAB)</td>
			<td>Sigma Fast Tablet set</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical Permount&#160; Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>SP-15-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harleco Gill&#39;s III Hematoxylin</td>
			<td>Fiisher Scientific 23-750-019</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harleco Eosin Y 1% Alcoholic Stock Solution</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>23-749-977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM citric acid monohydrate (pH 6.0)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-folate receptor beta&#160;</td>
			<td>Manohar Ratnam</td>
			<td></td>
			<td>optimized at 1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-human CD68</td>
			<td>Dako&#160;</td>
			<td>M071801</td>
			<td>optimized at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-CD3</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>A0452</td>
			<td>optimized at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymer goat anti- rabbit/mouse secondary antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Placental tissue</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#160;for FRB positive control</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an immunohistopathologic study to profile the folate receptor beta macrophage and vascular immune microenvironment in giant cell arteritis

Kæmpe celle arteritis (GCA) er en kronisk immun-medieret sygdom af mellemstore til store mellemstore arterier, der påvirker ældre voksne. GCA manifester med gigt og okklusiv symptomer af hovedpine, slagtilfælde eller vision tab. Makrofager og T-hjælper lymfocytter infiltrere vaskulære væggen og producere en pro-inflammatoriske respons, der fører til fartøj skade og iskæmi. Til dato, er der ingen GCA biomarkør, der kan overvåge sygdom aktivitet og guide terapeutisk respons.
Folat receptor beta (FRB) er et glycosylphosphatidylinositol protein, der er forankret på cellemembraner og normalt udtrykt i myelomonocytic afstamning og i fleste myeloid leukæmiceller så godt som i tumor og reumatoid synovial makrofager, hvor dens udtryk korrelerer med sygdommens sværhedsgrad. FRB evne til at binde folat forbindelser, folinsyre-konjugater og antifolate narkotika har gjort det et druggable mål i kræft og inflammatorisk sygdom forskning. Denne rapport beskriver de histopatologiske og immunhistokemiske metoder anvendt til at vurdere udtryk og distribution af FRB i forhold til GCAimmunopathology.
Formalin-fast og paraffin-embedded tidsmæssige arterie biopsier fra GCA og normal kontrol var plettet med hæmatoxylin og Eosin gennemgå væv histologi og identificere patognomoniske funktioner. Immunhistokemi blev brugt til at registrere FRB, CD68 og CD3 udtryk. En mikroskopisk analyse blev udført for at kvantificere antallet af positivt farvede celler på 10 udvalgte høj-power-felt sektioner og deres respektive placeringer i arterievæggen.
Lymphohistiocytic (LH) inflammation ledsaget af intima hyperplasi og forstyrret elastisk lamina blev set i GCA med ingen fundet i kontrolelementer. LH infiltrere var sammensat af ca 60% lymfocytter og 40% makrofager. FRB udtryk var begrænset til makrofager, bestående af 31% af den samlede CD68 + makrofag befolkning og lokaliseret til de medier og adventitia. Ingen FRB blev set i kontrolelementer.
Denne protokol viste en tydelig numeriske og rumlige mønster af FRB makrofag i forhold til de vaskulære immun mikromiljø i GCA.

Histopatologiske fund
H & E pletter i normale prøver demonstreret normal arteriel anatomi med endotelceller i tunica intima, glatte muskelceller i tunica media, og en heterogene kollagen matrix, der omfatter fibroblaster og feeder fartøjer kaldet vasa vasorum i tunica adventitia. Der er ikke inflammatoriske infiltrere identificeret. GCA positive tidsmæssige arterier viste moderat til svær betændelse med agg...

Watch this Scientific Journal Video about An Immunohistopathologic Study to Profile the Folate Receptor Beta Macrophage and Vascular Immune Microenvironment in Giant Cell Arteritis at JoVE.com

An Immunohistopathologic Study to Profile the Folate Receptor Beta Macrophage and Vascular Immune Microenvironment in Giant Cell Arteritis

Protokollen illustrerer brugen af histopatologisk undersøgelse og Immunhistokemi til folat receptor beta makrofag og dens forhold til den samlede immun celle infiltrere i tidsmæssige arterie biopsier i kæmpe celle arteritis-profil.

En Immunohistopathologic undersøgelse at profilere folat Receptor Beta makrofag og vaskulære immun mikromiljø i kæmpe celle Arteritis

Giant cell arteritis (GCA) is a chronic immune-mediated disease of medium-to-large sized arteries that affects older adults. GCA manifests with arthritis ...

Denne immunohistokemiske og histopatologiske protokol kan bruges til at undersøge folatreceptor beta, som er et kandidatprotein med potentiel prognostisk og terapeutisk værdi for det vaskulære mikromiljø i gigantisk cellearteritis. Denne protokol er tidstestet og bredt anvendt og kan bruges til at udforske folat receptor beta attributter i tidsmæssige arterie væv, selv efter langvarig opbevaring. For at erhverve væv sektioner, bruge en mikrotom til at skære fire til fem mikrometer tykke dele af paraffin-indlejrede tidsmæssige arterier, flydende hver sektion i en 40 grader Celsius vandbad, som de er opnået, for at fjerne rynker.Brug glasmikroskop dias til at fange tre sektioner pr dias, og varm dias på en opvarmning plade, i en 60 grader Celsius ovn i 60 minutter. Når sektionerne har holdt sig til objektglassene, skal du placere objektglassene i en lodret rack til tørring ved 37 grader celsius i 24 timer. Den næste dag, overføre dias til en slide beholder til opbevaring ved fire grader Celsius i mindst 12 timer.Dernæst indlæses dias i en slideholder og fugter vævene med to fem minutter, 100% xylennedsæmninger og en faldende, fem minutters pr koncentration ethanol nedsænkning serie, med 10 sekunder af agitation hver 30 sekunder. Efter 70% ethanol nedsænkning skylles objektglassene to gange i dobbeltdestilleret vand i fem minutter med 10 sekunders omrøring hvert 30. For antigenhentning, overføre rack i en glasbeholder med 200 mikroliter på 95 grader Celsius, 10 millimolar per liter citrat buffer i 30 minutter.Ved inkubationens afslutning skal objektglassene køle af til stuetemperatur i 20 minutter, før de skylles med rindende vand i fem minutter. For at fjerne den endogene peroxidaseaktivitet skal du først bruge en hydrofobe markør til at tegne en cirkel rundt om hver vævsprøve, før prøverne inkuberes i 200 mikroliter på 3 % hydrogenperoxid i 10 minutter efterfulgt af 3 vaske i 200 micoliters af tris-buffered saltvandsopløsning eller TBSS pr. vask. Efter den sidste vask, dab hver slide forsigtigt for at fjerne eventuelle overskydende buffer og tilføje 200 mikroliter af den primære antistof cocktail af interesse og et dæksel slip til hvert dias for en times inkubation i et fugtigt kammer ved stuetemperatur.Ved inkubationens afslutning kasseres dækslet, og objektglassene skylles med tre to minutters vask i frisk TBSS. Efter fjernelse af overskydende buffer tilsættes 200 mikroliter af en passende biotinyleret sekundær antistofopløsning og en dækselseddel til hvert dias for en 45-minutters inkubation i det fugtige kammer ved stuetemperatur. Efter at dækslet er kasseret, skylles objektglassene med TBSS som påvist.Fjern eventuel overskydende buffer. Og mærk sektionerne med 200 mikroliter DAB-substratbuffer i 10 minutter ved stuetemperatur. Ved slutningen af inkubationen vaskes rutsjebanerne med TBSS og rindende vand fra hanen i 10 minutter, før du tæller med hæmatoxylin i tre minutter.Derefter tilsættes 70 mikroliter af et passende monteringsmedium til hvert dias, og tip langsomt en glasdækstrimmel på monteringsmediet for at undgå at skabe bobler, da dækslet sænkes på plads. For histopatologisk analyse, placere dias på scenen af et lys mikroskop og vurdere den vaskulære arkitektur af det første væv sektion. Derefter kvantificere antallet af makrofager i forhold til antallet af lymfocytter pr sektion.Til immunhisemisk analyse skal folatreceptorens betafarvningsmønster undersøges på hvert vævssektion, og antallet af folatreceptor-beta-positive, CD68-positive og CD3-positive celler i 10 tilfældigt udvalgte højeffektfelter pr. sektion kvantificeres. Hæmatoxylin og eosin farvning i normale prøver afslører en normal arteriel anatomi, med endotelceller i tunica intima, glatte muskelceller i tunica medierne, og en heterogen kollagen matrix, der omfatter fibroblaster og feeder fartøjer kaldet vasa vasorum i tunica adventitia. Giant celle arteritis positive tidsmæssige arterier demonstrere en moderat til svær inflammation, med aggregater og makrofager, eller histiocytter, lymfocytter, lejlighedsvisplasmaceller, og multi-nucleated gigantiske celler.Luminal indsnævring er også bemærket, og ledsaget af intimal fortykkelse og en 90% afbrydelse af den interne elastiske lamina. CD3 positive lymfocytter og CD68 positive makrofager er også til stede i alle gigantiske celle arteritis positive prøver, med lignende farvning mønstre observeret i alle biopsier. Farvning for folat receptor beta er begrænset til makrofager og multi-nucleated gigantiske celler, der fortrinsrelig lokalisere til adventitia og medier.Især folatreceptor beta bestod ca 30% af den samlede makrofager. Den tidsmæssige arterie biopsi behandling, skæring, og dewaxing kræver omhyggelig dexteriety for at udføre efterfølgende trin. Diasfortolkningen kræver ekspertise fra en erfaren hjerte-kar-patolog.Mind seerne om at bruge kontakt- og åndedrætsværn, såsom handsker og ventilerede emhætter, når de håndterer prøver og reagenser.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

En<em&gt; In vitro</em&gt; Model til Studieinformationen Heterogeneity for Human Makrofag Differentiering og polarisering

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

Generering af lymfeknuder-fedt Pad kimærer for Studiet af lymfeknuder stromacelle Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In vitro og in vivo model til at studere bakteriel adhæsion til karvæggen Under strømningsforhold

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofil Isolering og analyse for at fastslå deres rolle i lymfom Cell Følsomhed til terapeutiske midler

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Udvikling og Identifikation af en roman underpopulation af human neutrofil-afledte Giant fagocytter<em&gt; In vitro</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Fabricating Optical-quality Glass Surfaces to Study Macrophage Fusion

Opdigte optisk kvalitet glasoverflader for at studere makrofag Fusion

Visualizing the formation of multinucleated giant cells (MGCs) from living specimens has been challenging due to the fact that most live imaging ...

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

Vurdering af cellulære immunrespons i frugtflue Drosophila melanogaster, ved hjælp af en i Vivo fagocytose Assay

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are ...