Name: an immunohistopathologic study to profile the folate receptor beta macrophage and vascular immune microenvironment in giant cell arteritis
Uploaded: 2019-02-08T12:30:00
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Ce travail a été rendu possible grâce au soutien du Dr. Douglas Stairs, Marianne Klinger, Ann Benko, la Division de rhumatologie du département de médecine et le moléculaire et histopathologique Core laboratoire, Penn State University College of Medicine, Hershey ' s PA.

Toutes les méthodes décrites ont été approuvées par le Conseil d’examen institutionnel Penn State.
1. histopathologique préparation et le traitement après l’obtention de biopsie de l’artère temporale
Remarque : La biopsie de l’artère temporale (onglet) est réalisée sous anesthésie locale et en conditions stériles par un chirurgien. Après l’obtention d’une section artérielle de 3 cm sur le côté plus affecté chirurgicalem...

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	<li>Klippel, J. H., Stone, J. H., White, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Primer on the rheumatic diseases. , (2008).</li><li>Weyand, C. M., Goronzy, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+mechanisms+in+medium+and+large-vessel+vasculitis.">Immune mechanisms in medium and large-vessel vasculitis.</a> Nature Reviews Rheumatol. 9 (12), 731-740 (2013).</li><li>Weyand, C. M., Liao, Y. J., Goronzy, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunopathology+of+giant+cell+arteritis:+diagnostic+and+therapeutic+implications.">The immunopathology of giant cell arteritis: diagnostic and therapeutic implications.</a> Journal of Neuro-ophthalmology. 32 (3), 259-265 (2012).</li><li>Deng, J., Younge, B., Olshen, R., Goronzy, J., Weyand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th17+and+Th1+T-cell+responses+in+giant+cell+arteritis.">Th17 and Th1 T-cell responses in giant cell arteritis.</a> Circulation. 121, 906-915 (2010).</li><li>Mahr, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjunctive+methotrexate+for+treatment+of+giant+cell+arteritis:+an+individual+patient+data+meta-analysis.">Adjunctive methotrexate for treatment of giant cell arteritis: an individual patient data meta-analysis.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 56 (8), 2789-2797 (2007).</li><li>Hoffman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicenter,+randomized,+double-blind,+placebo-controlled+trial+of+adjuvant+methotrexate+treatment+for+giant+cell+arteritis.">A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled trial of adjuvant methotrexate treatment for giant cell arteritis.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 46 (5), 1309-1318 (2002).</li><li>Stone, J. H., Klearman, M., Collinson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trial+of+Tocilizumab+in+Giant-Cell+Arteritis.">Trial of Tocilizumab in Giant-Cell Arteritis.</a> New England Journal of Medicine. 377 (15), 1494-1495 (2017).</li><li>Milman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tocilizumab+increased+sustained+glucocorticoid-free+remission+from+giant+cell+arteritis.">Tocilizumab increased sustained glucocorticoid-free remission from giant cell arteritis.</a> Annals of Internal Medicine. 167 (12), JC63 (2017).</li><li>Xia, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+folate+receptor+is+induced+during+macrophage+activation+and+can+be+used+to+target+drugs+to+activated+macrophages.">A functional folate receptor is induced during macrophage activation and can be used to target drugs to activated macrophages.</a> Blood. 113 (2), 438-446 (2009).</li><li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folate+receptor-beta+constitutes+a+marker+for+human+proinflammatory+monocytes.">Folate receptor-beta constitutes a marker for human proinflammatory monocytes.</a> Journal of Leukocyte Biology. 96 (4), 563-570 (2014).</li><li>Salazar, M. D., Ratnam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+folate+receptor:+what+does+it+promise+in+tissue-targeted+therapeutics.">The folate receptor: what does it promise in tissue-targeted therapeutics.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 26 (1), 141-152 (2007).</li><li>Low, P. S., Henne, W. A., Doorneweerd, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+development+of+folic-acid-based+receptor+targeting+for+imaging+and+therapy+of+cancer+and+inflammatory+diseases.">Discovery and development of folic-acid-based receptor targeting for imaging and therapy of cancer and inflammatory diseases.</a> Accounts of Chemical Research. 41 (1), 120-129 (2008).</li><li>Puig-Kroger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folate+receptor+beta+is+expressed+by+tumor-associated+macrophages+and+constitutes+a+marker+for+M2+anti-inflammatory/regulatory+macrophages.">Folate receptor beta is expressed by tumor-associated macrophages and constitutes a marker for M2 anti-inflammatory/regulatory macrophages.</a> Cancer Research. 69 (24), 9395-9403 (2009).</li><li>Nakashima-Matsushita, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+expression+of+folate+receptor+beta+and+its+possible+role+in+methotrexate+transport+in+synovial+macrophages+from+patients+with+rheumatoid+arthritis.">Selective expression of folate receptor beta and its possible role in methotrexate transport in synovial macrophages from patients with rheumatoid arthritis.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 42 (8), 1609-1616 (1999).</li><li>vander Heijden, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folate+receptor+beta+as+a+potential+delivery+route+for+novel+folate+antagonists+to+macrophages+in+the+synovial+tissue+of+rheumatoid+arthritis+patients.">Folate receptor beta as a potential delivery route for novel folate antagonists to macrophages in the synovial tissue of rheumatoid arthritis patients.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 60 (1), 12-21 (2009).</li><li>Jansen, G., Peters, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+in+folate+receptors+and+transporters:+implications+for+disease+and+treatment+of+immune+diseases+and+cancer.">Novel insights in folate receptors and transporters: implications for disease and treatment of immune diseases and cancer.</a> Pteridines. 26 (2), 41-53 (2015).</li><li>Albano-Aluquin, S., Malysz, J., Aluquin, V. R., Ratnam, M., Olsen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunohistochemical+analysis+of+folate+receptor+beta+expression+and+distribution+in+giant+cell+arteritis+-+a+pilot+study.">An immunohistochemical analysis of folate receptor beta expression and distribution in giant cell arteritis - a pilot study.</a> American Journal of Clinical and Experimental Immunology. 6 (6), 107-114 (2017).</li><li>Ross, J. F., Chaudhuri, P. K., Ratnam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+folate+receptor+isoforms+in+normal+and+malignant+tissues+in+vivo+and+in+established+cell+lines.+Physiologic+and+clinical+implications.">Differential regulation of folate receptor isoforms in normal and malignant tissues in vivo and in established cell lines. Physiologic and clinical implications.</a> Cancer. 73 (9), 2432-2443 (1994).</li><li>Reiner, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+molecular+biology.+Macrophages+and+dendritic+cells.+Methods+and+protocols.+Preface.">Methods in molecular biology. Macrophages and dendritic cells. Methods and protocols. Preface.</a> Methods in Molecular Biology. 531, (2009).</li><li>Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunofluorescence+labelling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+tissue.">Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BMC Cell Biology. 9, 13 (2008).</li><li>Pawlina, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histology: A text and atlas with correlated cell and molecular biology. , (2016).</li><li>Kumar, V., Abbas, A., Robbins Aster, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Robbins and Cotran pathologic basis of disease. , (2015).</li><li>Dabbs, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Diagnostic immunohistochemistry. , (2019).</li><li>Ross, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folate+receptor+type+beta+is+a+neutrophilic+lineage+marker+and+is+differentially+expressed+in+myeloid+leukemia.">Folate receptor type beta is a neutrophilic lineage marker and is differentially expressed in myeloid leukemia.</a> Cancer. 85 (2), 348-357 (1999).</li><li>Holzapfel, G. A., Fratzl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+in+arterial+walls:+biomechanical+aspects.">Collagen in arterial walls: biomechanical aspects.</a> Collagen. Structure and Mechanics. , 285-324 (2008).</li><li>Sultan, H., Smith, S. V., Lee, A. G., Chevez-Barrios, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathologic+Markers+Determining+Prognosis+in+Patients+with+Treated+or+Healing+Giant+Cell+Arteritis.">Pathologic Markers Determining Prognosis in Patients with Treated or Healing Giant Cell Arteritis.</a> American Journal of Ophthalmology. , (2018).</li></ol>

GCA est la vascularite plus courante chez les adultes, et sa caractéristique pathologique illustre une combinaison puissante des lymphocytes de T helper et activé macrophages que l'on retrouve également dans d’autres maladies granulomateuses ou vasculopathies comme la sarcoïdose et Polyangéite granulomateuse2,3. En GCA, l’artère temporale fournit une bonne représentation d’une artère de taille moyenne à grande, et la biopsie TA donne un échantillo...

Artérite à cellules géantes (GCA) est une maladie inflammatoire des artères moyennes à grandes, ciblant l’aorte et ses branches et qui touchent les personnes âgées. Il présente avec légère à des complications ischémiques sévères tels que maux de tête, douleur à la mâchoire, une perte de vision, accidents vasculaires cérébraux et les tissus de la gangrène. Le diagnostic est confirmé par les marqueurs de l’inflammation élevées comme la vitesse de sédimentation globulaire (VSG) et un modèle histopathologique distinct sur l’artère temporale biopsie (onglet)1. GCA est la vascularite adulte plus commun, et l’accessibilité de l’artère temporale obtenu pour le diagnostic présente un avantage sur les autres vasculopathies, ce qui permet à on d’étudier sa pathogenèse plus facilement. Les résultats typiques dans onglet incluent un infiltrat des macrophages/histiocytes et des lymphocytes T dans toutes les couches vasculaires de l’intima de tunica, média et adventice avec destruction simultanée de la lame élastique qui sépare normalement ces compartiments2. L’évidence actuelle démontre que GCA implique un antigène inconnu qui active les cellules dendritiques dans l’adventitia vasculaire, suivi par le recrutement d’assistant des cellules T (Th), spécifiquement les sous-types Th1 et Th17 qui sécrètent l’interleukine-17 et l’interféron-gamma (IFG) respectivement. IFG puis recrute et active les macrophages pour produire des cytokines et des protéases. Il s’agit de cytokines pro-inflammatoires ; notamment IL-12, qui réciproquement active les cellules Th1 offrant ainsi une boucle de rétroaction positive ; facteur de nécrose tumorale et l’interleukine-6, qui provoquent l’arthrite et les fièvres et les métalloprotéases qui endommagent la lame élastique. Glucocorticoïdes (GC), qui constituent la norme de traitement chronique, contrôlent partiellement les voies des cytokines en atténuant la Th17/IL-17 mais pas le bras Th1/IFG de la réponse immunitaire3,4. Malheureusement, abandon du GC se traduit par la rechute de la maladie. Comme une modalité alternative, le méthotrexate a été réaffecté pour le traitement de la GCA, mais les critères d’évaluation cliniques désirés n’étaient pas toujours atteint bien que biomarqueurs plus sensibles n’ont pas été utilisés pour la surveillance thérapeutique5,6 . En 2017, l’inhibiteur de l’interleukine 6, tocilizumab, a été approuvé pour le traitement de GCA, comme l’a démontré efficacement contre la maladie et stéroïde épargnant les effets7,8.
A ce jour, il n’y a aucune bonnes biomarqueurs de GCA. En conséquence, il est difficile de surveiller l’activité de la maladie et titrer les doses de médicaments disponibles afin d’éviter les effets indésirables et de réduire le fardeau du coût pour la société. Ainsi, il est impératif de chercher un biomarqueur candidat qu’est en corrélation avec l’activité de la maladie, éclairerait roman sur la pathogenèse et l’aide aux décisions thérapeutiques.
Le dérèglement de l’activation des macrophages est un facteur critique dans la pathogenèse de la GCA. Ainsi, un moyen efficace de traiter la GCA peut-être le ciblage sélectif des macrophages activés. L’acide folique récepteurs bêta (FRB) est une glycoprotéine glycosyl-phosphatidylinositol qui est ancrée sur la membrane cellulaire exprimée dans les cellules normales myélomonocytaire, cellules de leucémie myéloïde et activé macrophages. Son ligand, l’acide folique est une vitamine essentielle dans sa forme réduite, ce qui permet à l’ADN cellulaire synthèse, méthylation et réparation9. L’expression FRB est induite dans les maladies auto-immunes et au cours de la cancérogenèse. Son expression est limitée à la surface des monocytes ou macrophages pro-inflammatoires de M1 dans la polyarthrite rhumatoïde, ou aux anti-inflammatoires M2 macrophages dans les organes pleins et myéloïde10,11,12 , 13. en plus de son rôle potentiel comme biomarqueur des macrophages activés, la FRB pouvez activer le transport de drogue sélective à travers un processus en plusieurs étapes qui commence par la fixation du récepteur de l’acide folique, antifolates ou médicaments folate conjugué à la cellule surface, suivie d’intériorisation, de libération et de livraison éventuelle de drogue souhaitée à la cellule interne machines12,14,15,16. Contrairement aux FRB exprimée dans les cellules cancéreuses et activé macrophages, FRB exprimée dans les cellules hématopoïétiques normales ne peut lier les folates assurant que FRB/folate-mediated medicaments se limite à FRB séropositifs inflammatoire ou de cellules cancéreuses.
Dans notre étude précédente, nous avons démontré pour la première fois que FRB s’exprime dans les macrophages de GCA et son expression corrélée avec CD68 + et l’endothéline macrophages de récepteurs bêta, qui contribuent à la GCA pathogenèse17. Dans ce rapport, nous décrivons la histopathologiques et méthodes immunohistochimiques pour évaluer le macrophage FRB et analysé le total de lymphocytes et macrophages compte pour avoir un aperçu de la position de la FRB dans le paysage vasculaire de GCA.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Reichert-Jung</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plain and frosted microscope slides and cover slips</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical rack</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Olympus BX60&#160; microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone in distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>concentrations 100%, 90%, 70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered saline solution (TBS)&#160;</td>
			<td>Dako Wash BufferS3006</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% hydrogen peroxide in TBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaminobenzidine (DAB)</td>
			<td>Sigma Fast Tablet set</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical Permount&#160; Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>SP-15-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harleco Gill&#39;s III Hematoxylin</td>
			<td>Fiisher Scientific 23-750-019</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harleco Eosin Y 1% Alcoholic Stock Solution</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>23-749-977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM citric acid monohydrate (pH 6.0)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-folate receptor beta&#160;</td>
			<td>Manohar Ratnam</td>
			<td></td>
			<td>optimized at 1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-human CD68</td>
			<td>Dako&#160;</td>
			<td>M071801</td>
			<td>optimized at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-CD3</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>A0452</td>
			<td>optimized at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymer goat anti- rabbit/mouse secondary antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Placental tissue</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#160;for FRB positive control</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an immunohistopathologic study to profile the folate receptor beta macrophage and vascular immune microenvironment in giant cell arteritis

Artérite à cellules géantes (GCA) est une chronique auto-immune maladie des artères de tailles moyenne à grande qui affecte les personnes âgées. GCA manifestes souffrant d’arthrite et symptômes occlusifs de maux de tête, accident vasculaire cérébral ou de perte de vision. Les macrophages et les lymphocytes T-helper s’infiltrer dans la paroi vasculaire et produisent une réponse pro-inflammatoire qui mènent à une lésion vasculaire et une ischémie. A ce jour, il n’y a aucun biomarqueur de GCA qui peut surveiller la maladie activité et guide de réponse thérapeutique.
Acide folique récepteurs bêta (FRB) est une protéine glycosylphosphatidylinositol ancrée sur les membranes cellulaires et normalement exprimée dans la lignée de myélomonocytaire et dans la majorité des cellules de leucémie myéloïde, ainsi que dans la tumeur et les macrophages synoviaux rhumatoïdes, où son expression est corrélée avec la sévérité de la maladie. La capacité de la FRB pour lier des composés de l’acide folique, acide folique-conjugués et médicaments antifoliques a fait une cible thérapeutiques dans le cancer et la recherche sur les maladies inflammatoires. Ce rapport décrit les méthodes histopathologiques et immunohistochemical utilisés pour évaluer l’expression et la distribution de FRB en ce qui concerne les GCAimmunopathology.
Biopsies de l’artère temporale fixés au formol et inclus en paraffine de GCA et témoins normaux ont été colorées à l’hématoxyline et éosine revue histologie du tissu et identifier les fonctionnalités pathognomoniques. L’immunohistochimie a été utilisé pour détecter l’expression FRB, CD68 et CD3. Une analyse microscopique a été réalisée afin de quantifier le nombre de cellules colorées positivement sur les 10 sections de high-power-champ sélectionnées et leurs emplacements respectifs dans la paroi artérielle.
L’inflammation des Lymphohistiocytes (LH) accompagné de l’hyperplasie intimale et limitante élastique perturbé chez GCA avec aucun trouvé chez les témoins. L’infiltrat LH se composait d’environ 60 % de lymphocytes et 40 % de macrophages. L’expression FRB était restreinte aux macrophages, composée de 31 % de la population totale de macrophage CD68 + et localisée à la média et l’adventice. Aucun FRB a été observée chez les témoins.
Ce protocole a démontré une nette tendance numérique et spatiale du macrophage FRB par rapport au micro-environnement immunitaire vasculaire de GCA.

Constatations histopathologiques
H & E les taches en anatomie artérielle normale démontrée de spécimens normaux avec des cellules endothéliales dans l’intima de tunica, cellules musculaires lisses dans les médias de tunica, et une matrice de collagène hétérogènes incluent des fibroblastes et navires feeder appelé vasa vasorum dans l’adventitia tunica. Il n’y a aucun infiltrat inflammatoire ident...

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An Immunohistopathologic Study to Profile the Folate Receptor Beta Macrophage and Vascular Immune Microenvironment in Giant Cell Arteritis

Le protocole illustre l’utilisation de l’examen histopathologique et immunohistochimie à profil macrophage folate récepteurs bêta et sa relation avec la cellule immunitaire totale s’infiltrent dans les biopsies de l’artère temporale dans l’artérite à cellules géantes.

Une étude Immunohistopathologic pour profiler le Folate récepteurs bêta Macrophage et vasculaire microenvironnement immunitaire dans l’artérite à cellules géantes

Giant cell arteritis (GCA) is a chronic immune-mediated disease of medium-to-large sized arteries that affects older adults. GCA manifests with arthritis ...

Ce protocole immunohistochimique et histopathologique peut être employé pour examiner la bêta de récepteur de folate, qui est une protéine candidate avec la valeur pronostique et thérapeutique potentielle au microenvironnement vasculaire dans l’artérite géante de cellules. Ce protocole est testé dans le temps et largement utilisé et peut être utilisé pour explorer les attributs bêta des récepteurs foliques dans les tissus de l’artère temporelle, même après un stockage à long terme. Pour acquérir des sections tissulaires, utilisez une microtome pour trancher quatre à cinq sections micromètres d’épaisseur d’artères temporelles intégrées à la paraffine, flottant chaque section dans un bain d’eau de 40 degrés Celsius au fur et à mesure qu’elles sont obtenues, afin d’éliminer les rides.Utilisez des toboggans au microscope en verre pour capturer trois sections par glissière et réchauffer les glissières sur une plaque chauffante, dans un four de 60 degrés Celsius pendant 60 minutes. Lorsque les sections ont adhéré aux glissières, placez les glissières dans un support vertical pour le séchage à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Le lendemain, transférez les glissières dans un contenant de glissière pour les entreposer à quatre degrés Celsius pendant au moins 12 heures.Ensuite, la charge glisse dans un support de diapositives et hydrate les tissus avec deux immersions de cinq minutes, 100% xylène et une descente, cinq minutes par concentration série d’immersion d’éthanol, avec 10 secondes d’agitation toutes les 30 secondes. Après l’immersion de 70 % d’éthanol, rincer les diapositives deux fois à l’eau double-distillée pendant cinq minutes, avec 10 secondes d’agitation toutes les 30 secondes. Pour la récupération des antigènes, transférer la grille dans un récipient en verre avec 200 microlitres de 95 degrés Celsius, 10 millimolaire par litre tampon de citrate pendant 30 minutes.À la fin de l’incubation, laisser refroidir les toboggans à température ambiante pendant 20 minutes avant de les rincer à l’eau courante pendant cinq minutes. Pour éliminer l’activité endogène de la peroxyde, utilisez d’abord un marqueur hydrophobe pour dessiner un cercle autour de chaque échantillon de tissu, avant d’incuber les échantillons dans 200 microlitres de peroxyde d’hydrogène à 3 % pendant 10 minutes, suivi de 3 lavages dans 200 micolitres de solution saline tamponnée de tris, ou TBSS, par lavage. Après le dernier lavage, tamponnez doucement chaque glissière pour enlever tout excès de tampon et ajoutez 200 microlitres du cocktail d’anticorps primaire d’intérêt et un glissement de couvercle à chaque glissière pour une incubation d’une heure dans une chambre humide à température ambiante.À la fin de l’incubation, jeter les feuillets de couverture et rincer les glissières à l’aide de trois lavages de deux minutes dans le SCT frais. Après avoir enlevé l’excès de tampon, ajouter 200 microlitres d’une solution appropriée d’anticorps secondaires biotinylés et un glissement de couvercle à chaque glissière pour une incubation de 45 minutes dans la chambre humide à température ambiante. Après avoir jeté les feuillets de couverture, rincez les glissières avec le SCT comme démontré.Supprimez tout tampon excédentaire. Et étiquetez les sections avec 200 microlitres de tampon de substrat DAB pendant 10 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, laver les toboggans avec le SCT et faire fonctionner l’eau du robinet pendant 10 minutes, avant de les contre-tacher avec de l’hématoxyline pendant trois minutes.Ensuite, ajoutez 70 microlitres d’un milieu de montage approprié à chaque glissière et inclinez lentement une bande de couverture en verre sur le milieu de montage pour éviter de créer des bulles pendant que le glissement de couverture est abaissé en place. Pour l’analyse histopathologique, placez la diapositive sur la scène d’un microscope léger et évaluez l’architecture vasculaire de la première section tissulaire. Ensuite, quantifier le nombre de macrophages par rapport au nombre de lymphocytes par section.Pour l’analyse immunohistochimique, examinez le modèle de coloration bêta des récepteurs foliques sur chaque section tissulaire et quantifiez le nombre de cellules bêta positives, cd68 positives et CD3 du récepteur folique dans 10 champs de haute puissance choisis au hasard par section. La coloration de l’hématoxyline et de l’éosine dans les spécimens normaux révèle une anatomie artérielle normale, avec des cellules endothéliales dans la tunica intima, des cellules musculaires lisses dans le média tunica, et une matrice hétérogène de collagène, qui incluent des fibroblastes et des vaisseaux d’alimentation appelés vasa vasorum dans l’adventitia de tunica. Les artères temporelles positives d’arteritis de cellules géantes démontrent une inflammation modérée à grave, avec des agrégats et des macrophages, ou des histiocytes, des lymphocytes, des cellules occasionnelles de plasma, et des cellules géantes multinucléées.Le rétrécissement luminal est également noté, et accompagné d’épaississement intimal et d’une perturbation de 90% du lamina élastique interne. Les lymphocytes positifs CD3 et les macrophages positifs CD68 sont également présents dans tous les spécimens positifs d’artérite cellulaire géante, avec des modèles de coloration similaires observés dans toutes les biopsies. La coloration pour la bêta des récepteurs foliques est limitée aux macrophages et aux cellules géantes multinucléées qui se localisent préférentiellement à l’adventitia et aux médias.Notamment, la bêta des récepteurs foliques représentait environ 30 % du total des macrophages. Le traitement, la coupe, et le déwaxing de biopsie d’artère temporelle exigent la dextérité soignante afin d’exécuter des étapes suivantes. L’interprétation de la diapositive requiert l’expertise d’un pathologiste cardiovasculaire expérimenté.Rappelez aux spectateurs d’utiliser des précautions de contact et respiratoires, comme des gants et des capuchons ventilés, lors de la manipulation des spécimens et des réhabilités.

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