Name: an immunohistopathologic study to profile the folate receptor beta macrophage and vascular immune microenvironment in giant cell arteritis
Uploaded: 2019-02-08T12:30:00
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Diese Arbeit wurde durch die Unterstützung von Dr. Douglas Stairs, Marianne Klinger, Ann Benko, der Abteilung Rheumatologie/Abteilung Medizin und Molekularbiologie und histologischen Zentrallabor, Penn State University College of Medicine, Hershey PA.

Alle beschriebene Methoden wurden von der Penn State Institutional Review Board genehmigt.
(1) histopathologische Vorbereitung und Verarbeitung nach Erhalt Schläfenarterie Biopsie
Hinweis: Die Schläfenarterie Biopsie (TAB) wird durch einen qualifizierten Chirurgen unter örtlicher Betäubung und sterilen Bedingungen durchgeführt. Nach chirurgisch Erhalt einen 3 cm arteriellen Abschnitt auf der mehr betroffenen Seite, die Probe ist in Formalin sofo...

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GCA ist die häufigste Vaskulitis bei Erwachsenen, und pathologische Wahrzeichen steht beispielhaft für eine wirkungsvolle Kombination von T-Helfer-Lymphozyten und aktiviert Makrophagen, die auch in andere granulomatöse Erkrankungen oder Vasculopathies wie Sarkoidose gefunden werden können und granulomatöse Polyangiitis2,3. In GCA, die Schläfenarterie bietet eine gute Darstellung einer Mittel-groß dimensionierte Arterie und die TA-Biopsie gibt eine große P...

Riesige Zelle Arterienentzündung (GCA) ist eine entzündliche Erkrankung des mittleren bis großen Arterien, targeting der Aorta und seine Niederlassungen und ältere Erwachsene betroffen. Es stellt mit leichten bis schweren ischämischen Komplikationen wie Kopfschmerzen, Kieferschmerzen, Verlust der Sehkraft, Schlaganfall und Gewebe Gangrän. Die Diagnose wird durch hohe Entzündungsmarker wie Erythrozyten Sedimentation Rate (ESR) und ein eindeutiges histologischen Muster auf der Schläfenarterie Biopsie (TAB)1bestätigt. GCA ist die häufigste Vaskulitis Erwachsenen, und die Zugänglichkeit der Schläfenarterie erhalten für die Diagnose stellt einen Vorteil gegenüber anderen Vasculopathies, so dass man seine Pathogenese leichter zu studieren. Die typische Ergebnisse auf Registerkarte "beinhalten ein Infiltrat von Makrophagen/Histiozyten und T-Lymphozyten über alle vaskulären Schichten der Tunica Intima, Media und Adventitia mit gleichzeitiger Zerstörung der elastischen Lamina, die normalerweise diese trennt gefunden Fächer2. Die aktuelle Beweise zeigt, dass GCA ein unbekanntes Antigen beinhaltet, die dendritische Zellen in der vaskulären Adventitia aktiviert, gefolgt von der Einstellung des Helfers T (Th) Zellen, insbesondere Th1 und Th17-Subtypen, die absondern Interleukin-17 und Interferon-Gamma (IFG) beziehungsweise. IFG dann rekrutiert und aktiviert Makrophagen produzieren Zytokine und Proteasen. Dazu gehören Pro-inflammatorischen Zytokinen; einschließlich der IL-12, die wechselseitig Th1 Zellen, wodurch eine positive Rückkopplung aktiviert; Tumor-Nekrose-Faktor und Interleukin-6, die Arthritis und Fieber und Metalloproteasen, die verursachen Schäden der elastischen Lamina. Glukokortikoide (GC), die die Standardtherapie der chronischen darstellen, Steuern die Cytokine Bahnen teilweise mildernde Th17/IL-17, aber nicht die Th1/IFG Arm der Immunantwort3,4. Leider führt Absetzen des GC Rückfall der Erkrankung. Als alternative Modalität Methotrexat hat für GCA Behandlung umgewidmet worden, aber die gewünschte klinische Endpunkte wurden nicht konsequent erreicht, obwohl empfindlicher Biomarker für therapeutischen Überwachung5,6 nicht verwendet worden sein . Im Jahr 2017 wurde die Interleukin 6-Blocker, Tocilizumab, für die Behandlung von GCA genehmigt, wie effektiv Krankheitskontrolle und schonende Wirkung7,8Steroid nachgewiesen.
Bisher gibt es keine guten Biomarker für GCA. Infolgedessen ist es schwierig, zur Überwachung der Krankheitsaktivität und titrieren Dosen von verfügbaren Medikamenten, um negative Auswirkungen zu vermeiden und reduzieren die Belastung der Kosten für die Gesellschaft. Daher ist es unerlässlich, ein Kandidat Biomarker, dass korreliert mit Krankheitsaktivität, bieten neue Einblicke über die Pathogenese und Hilfe bei therapeutischen Entscheidungen suchen.
Die Dysregulation der Makrophagen Aktivierung ist ein kritischer Faktor in der Pathogenese der GCA. So kann ein wirksames Mittel zur Behandlung von GCA sein die gezielte Ausrichtung der aktivierten Makrophagen. Die Folsäure-Rezeptor-Beta (FRB) ist ein a1-Phosphatidylinositol-Glykoprotein, das auf der Zellmembran verankert ist in normalen Myelomonocytic Zellen, myeloische Leukämie-Zellen exprimiert und aktiviert Makrophagen. Die Liganden, Folsäure, ist ein wichtiges Vitamin in seiner reduzierten Form, der zelluläre DNA-Synthese, Methylierung und Reparatur9ermöglicht. FRB-Ausdruck wird in Autoimmunerkrankung und während der Karzinogenese induziert. Ihr Ausdruck ist auf der Oberfläche von Monozyten oder Pro-inflammatorischen M1 Makrophagen bei rheumatoider Arthritis oder auf entzündungshemmende M2-Makrophagen beschränkt in festen Orgel und myeloischen malignen Erkrankungen10,11,12 , 13. neben ihrer möglichen Rolle als Biomarker der aktivierten Makrophagen, FRB können selektive Drug Transport durch einen mehrstufigen Prozess, der mit die Rezeptorbindung, Folsäure, Antifolates oder Folat konjugiert Drogen an der Zelle beginnt Oberfläche, gefolgt von Verinnerlichung, Freigabe und eventuelle Lieferung des gewünschten Medikaments an die interne Zelle Maschinen12,14,15,16. Im Gegensatz zu FRB in Krebszellen exprimiert und aktiviert Makrophagen, FRB in normalen blutbildenden Zellen exprimiert ist nicht in der Lage zu binden Folate damit FRB/Folat-vermittelten Drug-Delivery FRB-positiven entzündlichen oder Krebszellen beschränkt.
In unserem vorangegangenen Studie zeigten wir zum ersten Mal, das FRB in GCA Makrophagen zum Ausdruck bringt und seinen Ausdruck korreliert mit CD68 + und Endothelin Rezeptor Beta-Makrophagen, die GCA Pathogenese17beitragen. In diesem Bericht beschreiben wir die histopathologische und immunhistochemische Methoden zur Beurteilung der FRB Makrophagen und analysiert den gesamten Lymphozyten und Makrophagen zählt, um Einblick in die FRB Position in der GCA vaskulären Landschaft.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Reichert-Jung</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plain and frosted microscope slides and cover slips</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical rack</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Olympus BX60&#160; microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone in distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>concentrations 100%, 90%, 70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered saline solution (TBS)&#160;</td>
			<td>Dako Wash BufferS3006</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% hydrogen peroxide in TBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaminobenzidine (DAB)</td>
			<td>Sigma Fast Tablet set</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical Permount&#160; Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>SP-15-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harleco Gill&#39;s III Hematoxylin</td>
			<td>Fiisher Scientific 23-750-019</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harleco Eosin Y 1% Alcoholic Stock Solution</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>23-749-977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM citric acid monohydrate (pH 6.0)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-folate receptor beta&#160;</td>
			<td>Manohar Ratnam</td>
			<td></td>
			<td>optimized at 1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-human CD68</td>
			<td>Dako&#160;</td>
			<td>M071801</td>
			<td>optimized at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-CD3</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>A0452</td>
			<td>optimized at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymer goat anti- rabbit/mouse secondary antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Placental tissue</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#160;for FRB positive control</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an immunohistopathologic study to profile the folate receptor beta macrophage and vascular immune microenvironment in giant cell arteritis

Riesige Zelle Arterienentzündung (GCA) ist eine chronische immunvermittelte Erkrankung des Mittel-groß dimensionierte Arterien, die ältere Erwachsenen betrifft. GCA Manifeste mit Arthritis und okklusive Symptome von Kopfschmerzen, Schlaganfall oder vision Verlust. Makrophagen und T-Helfer-Lymphozyten die Gefäßwand zu infiltrieren und eine Pro-inflammatorische Reaktion, die zu Schiff Schaden und Ischämie führen zu produzieren. Bisher gibt es keine GCA-Biomarker, die Krankheit Aktivität und Guide therapeutische Reaktion überwachen können.
Folat-Rezeptor-Beta (FRB) ist ein Glycosylphosphatidylinositole Protein, das auf Zellmembranen verankert ist und normalerweise ausgedrückt in der Myelomonocytic Linie und in der Mehrzahl der myeloischen Leukämie-Zellen sowie in Tumor und rheumatoide synovialen Makrophagen, wo seinen Ausdruck mit der Schwere der Erkrankung korreliert. Die Fähigkeit der FRB, Folat Verbindungen, Folsäure-Konjugate und Strukturähnliche Medikamente binden hat es ein druggable Ziel in Krebs und entzündliche Erkrankung Forschung gemacht. Dieser Bericht beschreibt die histologischen und immunhistochemische Methoden verwendet, um Ausdruck und Verteilung der FRB in Bezug auf GCAimmunopathology zu bewerten.
Formalin fixiert und Paraffin-eingebetteten Schläfenarterie Biopsien von GCA und normalen Kontrollen waren voller Flecken mit Hämatoxylin und Eosin prüfen Gewebe Histologie und pathognomonische Funktionen ermitteln. Immunohistochemistry diente, FRB, CD68 und CD3 Ausdruck zu erkennen. Eine mikroskopische Analyse wurde durchgeführt, um die Anzahl der positiv gefärbten Zellen auf 10 ausgewählten high-power-Bereich Sektionen und ihre jeweiligen Standorte in der Arterienwand zu quantifizieren.
Lymphohistiocytic (LH) Entzündung begleitet von Intima-Hyperplasie und gestörten elastischen Lamina galt in GCA mit keine Kontrollen gefunden. Das LH Infiltrat bestand aus ca. 60 % Lymphozyten und 40 % Makrophagen. FRB Ausdruck beschränkte sich auf Makrophagen, bestehend aus 31 % der CD68 + Makrophagen Gesamtbevölkerung und in der Media und Adventitia lokalisiert. Keine FRB wurde in Steuerelementen gesehen.
Dieses Protokoll zeigt ein eindeutiges numerisches und räumliche Muster der FRB Makrophagen im Verhältnis zu der vaskulären immun Mikroumgebung in GCA.

Histologischen Befunde
Der H & E Flecken in normalen Proben nachgewiesen normale arterielle Anatomie mit Endothelzellen in der Tunica Intima, glatten Muskelzellen in der Tunica Media und eine heterogene Kollagen-Matrix die Fibroblasten und Feeder Schiffe gehören genannt Vasa vasorum in Tunica Adventitia. Es gibt keine entzündlichen Infiltrat identifiziert. GCA positive zeitliche Arterien zeigte mäßige bis sc...

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An Immunohistopathologic Study to Profile the Folate Receptor Beta Macrophage and Vascular Immune Microenvironment in Giant Cell Arteritis

Das Protokoll zeigt die Verwendung der histologischen Untersuchung und immunhistochemische Profil Folat Rezeptor Beta-Makrophagen und seine Beziehung zu der gesamten Immunzelle Schläfenarterie Biopsien in riesige Zelle Arterienentzündung zu infiltrieren.

Eine Immunohistopathologic Untersuchung der Folat-Rezeptor Beta Makrophagen und vaskuläre immun Mikroumgebung in riesige Zelle Arterienentzündung Profil

Giant cell arteritis (GCA) is a chronic immune-mediated disease of medium-to-large sized arteries that affects older adults. GCA manifests with arthritis ...

Dieses immunhistochemische und histopathologische Protokoll kann verwendet werden, um Folatrezeptor Beta zu untersuchen, das ein Kandidatenprotein mit potenziellem prognostischen und therapeutischen Wert für die vaskuläre Mikroumgebung bei Riesenzellarteritis ist. Dieses Protokoll ist bewährt und weit verbreitet und kann verwendet werden, um die Folatrezeptor-Beta-Attribute in zeitlichen Arteriengeweben zu erforschen, auch nach langzeitlagerung. Um Gewebeabschnitte zu erhalten, verwenden Sie ein Mikrotome, um vier bis fünf Mikrometer dicke Abschnitte von paraffineingebetteten temporalen Arterien zu schneiden, die jeden Abschnitt in einem 40 Grad Celsius Wasserbad schweben, wie sie erhalten werden, um Falten zu entfernen.Verwenden Sie Glasmikroskop-Dias, um drei Abschnitte pro Rutsche zu erfassen, und wärmen Sie die Dias auf einer wärmenden Platte, in einem 60-Grad-Celsius-Ofen für 60 Minuten. Wenn die Abschnitte an den Dias kleben haben, legen Sie die Dias in ein vertikales Rack zum Trocknen bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden. Übertragen Sie die Dias am nächsten Tag für mindestens 12 Stunden in einen Diabehälter zur Lagerung bei vier Grad Celsius.Als nächstes gleitet die Last in ein Diaregal und hydratisiert das Gewebe mit zwei fünfminütigen, 100%xylen-Tauchionen und einer absteigenden, fünfminütigen Ethanol-Tauchserie pro Konzentration, mit 10 Sekunden Erregung alle 30 Sekunden. Nach dem 70%Ethanol-Eintauchen die Dias zweimal in doppelt destilliertem Wasser für fünf Minuten abspülen, mit 10 Sekunden Aufrührer alle 30 Sekunden. Für die Antigen-Retrieval, übertragen Sie das Rack in einen Glasbehälter mit 200 Mikroliter 95 Grad Celsius, 10 Millimolar pro Liter Citratpuffer für 30 Minuten.Lassen Sie die Dias am Ende der Inkubation 20 Minuten lang auf Raumtemperatur abkühlen, bevor Sie sie fünf Minuten lang mit fließendem Wasser abspülen. Um die endogene Peroxidase-Aktivität zu entfernen, verwenden Sie zunächst einen hydrophoben Marker, um einen Kreis um jede Gewebeprobe zu ziehen, bevor Sie die Proben in 200 Mikroliter 3%Wasserstoffperoxid für 10 Minuten inkubieren, gefolgt von 3 Waschungen in 200 Micolitern Tris-gepufferter Salzlösung, oder TBSS, pro Wäsche. Nach der letzten Wäsche, tab jede Rutsche sanft, um überschüssigepuffer zu entfernen und fügen Sie 200 Mikroliter des primären Antikörper-Cocktail von Interesse und eine Abdeckung Rutschen zu jeder Rutsche für eine einstündige Inkubation in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur.Am Ende der Inkubation die Deckelschlüpfer entsorgen und die Dias mit drei zweiminütigen Wäbungen in frischem TBSS spülen. Nach dem Entfernen des überschüssigen Puffers 200 Mikroliter einer geeigneten biotinylierten Sekundärantikörperlösung und einen Deckelschlupf zu jedem Schlitten für eine 45-minütige Inkubation in der feuchten Kammer bei Raumtemperatur hinzufügen. Nachdem Sie die Deckelbelege verworfen haben, spülen Sie die Dias wie gezeigt mit TBSS ab.Entfernen Sie alle überschüssigen Puffer. Und beschriften Sie die Abschnitte mit 200 Mikroliter DAB-Substratpuffer für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation die Dias mit TBSS und fließendem Leitungswasser für 10 Minuten waschen, bevor Sie drei Minuten lang mit Hämatoxylin kontern.Fügen Sie dann 70 Mikroliter eines geeigneten Montagemediums zu jedem Schlitten hinzu und kippen Sie langsam einen Glasabdeckstreifen auf das Montagemedium, um Blasen zu vermeiden, wenn der Deckelschlupf eingelassen wird. Legen Sie das Dia für die histopathologische Analyse auf die Bühne eines Lichtmikroskops und bewerten Sie die Gefäßarchitektur des ersten Gewebeabschnitts. Quantifizieren Sie dann die Anzahl der Makrophagen relativ zur Anzahl der Lymphozyten pro Abschnitt.Für die immunhistochemische Analyse untersuchen Sie das Folatrezeptor-Beta-Färbungsmuster auf jedem Gewebeabschnitt und quantifizieren die Anzahl der Folatrezeptor-Beta-positiven, CD68-positiven und CD3-positiven Zellen in 10 zufällig ausgewählten Hochleistungsfeldern pro Abschnitt. Hämatoxylin- und Eosinfärbungen in normalen Proben zeigen eine normale arterielle Anatomie mit Endothelzellen in der Tunika-Intima, glatten Muskelzellen in den Tunika-Medien und einer heterogenen Kollagenmatrix, die Fibroblasten und Feedergefäße namens Vasa vasorum in der Tunika-Adventitia umfasst. Riesenzellarteritis positive zeitliche Arterien zeigen eine mittelschwere bis schwere Entzündung, mit Aggregaten und Makrophagen, oder Histiozyten, Lymphozyten, gelegentlichen Plasmazellen und multinukleierten Riesenzellen.Luminal Verengung ist auch festgestellt, und begleitet von intimverdickung und eine 90%Störung der internen elastischen Lamina. CD3-positive Lymphozyten und CD68-positive Makrophagen sind auch in allen riesenzellartibilisierenden Proben vorhanden, wobei ähnliche Färbungsmuster in allen Biopsien beobachtet werden. Die Färbung für Folatrezeptor-Beta ist auf Makrophagen und multinukleierte Riesenzellen beschränkt, die bevorzugt auf die Adventitia und medienlokalisieren.Bemerkenswert ist, dass die Folatrezeptor-Beta etwa 30 % der gesamten Makrophagen ausmachte. Die zeitliche ArterienbiopsieVerarbeitung, Schneiden und Entwachsung erfordern sorgfältige Geschicklichkeit, um nachfolgende Schritte durchzuführen. Die Diainterpretation erfordert die Expertise eines erfahrenen kardiovaskulären Pathologen.Erinnern Sie die Betrachter daran, kontakt- und Atemschutzvorkehrungen wie Handschuhe und belüftete Kapuzen beim Umgang mit Proben und Reagenzien zu verwenden.

Research

JoVE Journal

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