Name: an immunohistopathologic study to profile the folate receptor beta macrophage and vascular immune microenvironment in giant cell arteritis
Uploaded: 2019-02-08T12:30:00
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Questo lavoro è stato reso possibile dal supporto del Dr. Douglas Stairs, Marianne Klinger, Ann Benko, il divisione di reumatologia/dipartimento di medicina e molecolare e istopatologici Core laboratorio, Penn State University College of Medicine, Hershey PA.

Tutti i metodi descritti sono stati approvati da Penn State Institutional Review Board.
1. istopatologico preparazione ed elaborazione previa biopsia dell'arteria temporale
Nota: La biopsia dell'arteria temporale (scheda) viene eseguita in anestesia locale e condizioni sterili di un chirurgo certificato. Dopo aver ottenuto chirurgicamente una sezione arteriosa di 3 cm dal lato più commovente, l'esemplare è fissato in formalina immediatamente per 24...

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GCA è la vasculite più comune negli adulti, e relativo marchio di garanzia patologico esemplifica una potente combinazione di linfociti T helper e macrofagi che possono essere trovati anche in altre malattie granulomatose o vasculopatie come sarcoidosi attivati e granulomatosa polyangiitis2,3. Nel GCA, l'arteria temporale fornisce una buona rappresentazione di un'arteria di dimensione medio-grandi e la biopsia TA dà un esempio considerevole che possa essere me...

Arteritis gigante delle cellule (GCA) è una malattia infiammatoria delle medio-grandi arterie, l'aorta ed i relativi rami di targeting e che interessa gli adulti più anziani. Si presenta con lievi a gravi complicanze ischemiche quali mal di testa, perdita della vista, dolore alla mascella, gangrene del colpo e del tessuto. La diagnosi è confermata dall'alti indicatori infiammatori come tasso di sedimentazione dell'eritrocito (ESR) e un modello istopatologico distinto sull'arteria temporale biopsia (scheda)1. GCA è la più comune vasculite adulta, e l'accessibilità dell'arteria temporale ottenuta per diagnosi presenta un vantaggio rispetto altre vasculopatie, così permettendo ad uno di studiare la relativa patogenesi più prontamente. I risultati tipici nella scheda includono un'infiltrazione dei macrofagi/istiociti e linfociti T trovati attraverso tutti gli strati vascolari della tonaca intima, media e avventizia con concomitante distruzione della lamina elastica che normalmente separa questi vani2. L'evidenza attuale dimostra che GCA comporta un antigene sconosciuto che attiva le cellule dendritiche nel adventitia vascolare, seguita dall'assunzione di helper cellule di T (Th), in particolare Th1 e Th17 sottotipi che secernono interleuchina-17 e interferone-gamma (IFG) rispettivamente. IFG poi recluta e attiva i macrofagi a produrre citochine e proteasi. Questi includono le citochine pro-infiammatorie; compreso IL-12, che reciprocamente si attiva le cellule Th1, fornendo così un ciclo di feedback positivo; fattore di necrosi tumorale e l'interleuchina-6, che causano artrite e febbri e metalloproteasi che danneggiare la lamina elastica. I glucocorticoidi (GC), che costituiscono la terapia cronica standard, controllano parzialmente le vie di citochina attenuando Th17/IL-17, ma non il braccio Th1/IFG di risposta immunitaria3,4. Purtroppo, l'interruzione del GC provoca in ricaduta di malattia. Come modalità alternativa, metotrexato è stato reimpiegato per trattamento di GCA, ma il desiderato endpoint clinici non sono stati raggiunti costantemente anche se biomarcatori più sensibili non sono stati utilizzati per il monitoraggio terapeutico5,6 . Nel 2017, il blocco di interleuchina 6, tocilizumab, è stato approvato per il trattamento del GCA quanto dimostrato efficacemente il controllo delle malattie e con parsimonia effetti7,8steroide.
Fin qui, non ci sono nessun buoni biomarcatori per GCA. Di conseguenza, è difficile monitorare l'attività di malattia e titolare di dosi di farmaci disponibili per evitare gli effetti negativi e ridurre l'onere del costo per la società. Pertanto, è imperativo per cercare un biomarcatore di candidato che correla con attività di malattia, fornire nuove conoscenze sulla patogenesi e l'aiuto nelle decisioni terapeutiche.
La disregolazione dell'attivazione macrofagica è un fattore critico nella patogenesi di GCA. Quindi, un mezzo efficace di trattare GCA può essere il targeting selettivo dei macrofagi attivati. La versione beta del recettore di folato (FRB) è una glicoproteina di glicosil fosfatidilinositolo che è ancorata sulla membrana cellulare espressa in cellule myelomonocytic normale, le cellule di leucemia mieloide e macrofagi attivati. Suo ligando, acido folico, è una vitamina essenziale nella sua forma ridotta, che consente la sintesi, la metilazione e la riparazione del DNA cellulare9. FRB espressione è indotta nella malattia autoimmune e durante la carcinogenesi. La sua espressione è limitata alla superficie dei monociti o pro-infiammatorie M1 macrofagi nell'artrite reumatoide, o a antinfiammatori M2 macrofagi in organo solido e neoplasie mieloidi10,11,12 , 13. oltre al suo ruolo potenziale come biomarcatore di macrofagi attivati, FRB può abilitare il trasporto del farmaco selettivo attraverso un processo a più fasi che inizia con l'associazione del recettore per l'acido folico, antifolici o folato-coniugati di droga dalla cella superficie, seguita da interiorizzazione, rilascio e consegna eventuale di farmaco desiderata per l'interno cella macchinari12,14,15,16. A differenza di FRB espressi su cellule tumorali e macrofagi attivati, FRB espresso in cellule emopoietiche normali è in grado di associare i folati assicurando che FRB/folato-ha mediato la consegna della droga è limitata a FRB-positiva infiammatoria o cellule tumorali.
Nel nostro studio precedente, abbiamo dimostrato per la prima volta che FRB è espresso nei macrofagi GCA e sua espressione correlata con CD68 + ed endotelina macrofagi beta del recettore, che contribuiscono alla patogenesi di GCA17. In questo rapporto, descriviamo l'istopatologico e immunohistochemical metodi utilizzati per valutare il macrofago FRB e analizzato il totale dei linfociti e macrofago conta per guadagnare la comprensione nella posizione di FRB nel paesaggio vascolare GCA.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Reichert-Jung</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plain and frosted microscope slides and cover slips</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical rack</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Olympus BX60&#160; microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone in distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>concentrations 100%, 90%, 70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered saline solution (TBS)&#160;</td>
			<td>Dako Wash BufferS3006</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% hydrogen peroxide in TBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaminobenzidine (DAB)</td>
			<td>Sigma Fast Tablet set</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical Permount&#160; Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>SP-15-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harleco Gill&#39;s III Hematoxylin</td>
			<td>Fiisher Scientific 23-750-019</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harleco Eosin Y 1% Alcoholic Stock Solution</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>23-749-977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM citric acid monohydrate (pH 6.0)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-folate receptor beta&#160;</td>
			<td>Manohar Ratnam</td>
			<td></td>
			<td>optimized at 1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-human CD68</td>
			<td>Dako&#160;</td>
			<td>M071801</td>
			<td>optimized at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-CD3</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>A0452</td>
			<td>optimized at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymer goat anti- rabbit/mouse secondary antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Placental tissue</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#160;for FRB positive control</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an immunohistopathologic study to profile the folate receptor beta macrophage and vascular immune microenvironment in giant cell arteritis

Arteritis gigante delle cellule (GCA) è un'immuno-mediata malattia cronica delle arterie di dimensioni medio-grandi che colpisce gli adulti più anziani. GCA manifesti con artrite e occlusivi sintomi di mal di testa, colpo o perdita della vista. Macrofagi e linfociti T-helper infiltrano nella parete vascolare e producono una risposta pro-infiammatoria che conducono a danno del vaso e ischemia. Ad oggi, non c'è nessun biomarcatore di GCA che può controllare la malattia attività e guida risposta terapeutica.
Folato del recettore beta (FRB) è una proteina di glicosilfosfatidilinositolo che è ancorata sulle membrane cellulari e normalmente espressi nella stirpe myelomonocytic e nella maggior parte delle cellule di leucemia mieloide pure come nel tumore e macrofagi sinoviali reumatoidi, dove la sua espressione correla con la severità di malattia. La capacità di associare composti di folati, acido folico-coniugati e droghe antifolati FRB ha reso una destinazione trattabili in cancro e la malattia infiammatoria ricerca. Questo rapporto descrive i metodi istopatologici e immunohistochemical, utilizzati per valutare l'espressione e la distribuzione di FRB in relazione GCAimmunopathology.
Le biopsie dell'arteria temporale formalina-fisso e paraffina-incastonati da GCA e comandi normali erano macchiate con ematossilina ed eosina per rivedere l'istologia del tessuto e identificare caratteristiche patognomoniche. Immunohistochemistry è stato usato per rilevare l'espressione FRB, CD68 e CD3. Stata effettuata un'analisi microscopica per quantificare il numero di celle positivamente macchiate in 10 sezioni selezionate di high-power-campo e nelle rispettive posizioni nella parete arteriosa.
L'infiammazione lymphohistiocytic (LH) accompagnato da iperplasia intimale e perturbata lamina elastica è stata veduta nel GCA con nessuno trovato nei controlli. L'infiltrazione di LH era composta di circa il 60% di linfociti e il 40% di macrofagi. Espressione di FRB era limitata ai macrofagi, che comprende il 31% della popolazione di macrofagi CD68 + totale e localizzato ai media e avventizia. Nessun FRB è stato visto nei controlli.
Questo protocollo ha dimostrato un modello distinto di numerico e spaziale del macrofago FRB rispetto al microambiente immune vascolare nel GCA.

Risultati istopatologici
La H & E macchie in anatomia arteriosa normale dimostrata di esemplari normali con le cellule endoteliali in tonaca intima, cellule di muscolo liscio nella tunica media, e una matrice di collagene eterogenea che fibroblasti e vasi dell'alimentatore sono chiamati vasa vasorum nel adventitia di tunica. Non c'è nessun infiltrato infiammatorio identificato. Arterie temporali positive GCA ha...

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An Immunohistopathologic Study to Profile the Folate Receptor Beta Macrophage and Vascular Immune Microenvironment in Giant Cell Arteritis

Il protocollo viene illustrato l'utilizzo dell'esame istopatologico e immunohistochemistry al profilo il macrofago di folato recettore beta e il suo rapporto con il totale delle cellule immuni infiltrarsi in biopsie temporali dell'arteria in arteritis gigante delle cellule.

Uno studio di Immunohistopathologic per profilare il folato recettore Beta macrofago e microambiente vascolare immuni nella arterite a cellule giganti

Giant cell arteritis (GCA) is a chronic immune-mediated disease of medium-to-large sized arteries that affects older adults. GCA manifests with arthritis ...

Questo protocollo immunoistochimico e istopatologico può essere utilizzato per esaminare il recettore del folato beta, che è una proteina candidata con potenziale valore prognostico e terapeutico per il microambiente vascolare nell'arterite cellulare gigante. Questo protocollo è testato nel tempo e ampiamente utilizzato e può essere utilizzato per esplorare gli attributi beta del recettore del folato nei tessuti dell'arteria temporale, anche dopo la conservazione a lungo termine. Per acquisire sezioni tissutali, utilizzare un microtomo per tagliare sezioni spesse da quattro a cinque micrometri di arterie temporali incorporate in paraffina, galleggiando ogni sezione in un bagno d'acqua Celsius di 40 gradi man mano che si ottengono, per rimuovere le rughe.Utilizzare diapositive al microscopio in vetro per catturare tre sezioni per diapositiva e riscaldare le diapositive su una piastra riscaldante, in un forno a 60 gradi Celsius per 60 minuti. Quando le sezioni hanno aderito alle diapositive, posizionare gli scivoli in un rack verticale per asciugare a 37 gradi Celsius per 24 ore. Il giorno successivo trasferire le diapositive in un contenitore di diapositive per l'archiviazione a quattro gradi Celsius per almeno 12 ore.Successivamente, caricare le diapositive in un portasci e idratare i tessuti con due immersioni in xilene di cinque minuti e al 100% e una serie di immersione in etanolo discendente di cinque minuti per concentrazione, con 10 secondi di agitazione ogni 30 secondi. Dopo l'immersione al 70% di etanolo, sciacquare gli scivoli due volte in acqua doppia distillata per cinque minuti, con 10 secondi di agitazione ogni 30 secondi. Per il recupero dell'antigene, trasferire il rack in un contenitore di vetro con 200 microlitri di 95 gradi Celsius, 10 millimolare per litro tampone di citrato per 30 minuti.Al termine dell'incubazione, lasciare raffreddare i vetrine a temperatura ambiente per 20 minuti prima di risciacquare con acqua corrente per cinque minuti. Per rimuovere l'attività endogena della perossidasi, utilizzare prima un marcatore idrofobico per disegnare un cerchio attorno a ciascun campione di tessuto, prima di incubare i campioni in 200 microlitri di perossido di idrogeno al 3% per 10 minuti, seguito da 3 lavaggi in 200 micoliter di soluzione salina tris-tamponata, o TBSS, per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, tamponare delicatamente ogni diapositiva per rimuovere qualsiasi tampone in eccesso e aggiungere 200 microlitri del cocktail di anticorpi primari di interesse e una scivolata di copertura ad ogni diapositiva per un'incubazione di un'ora in una camera umida a temperatura ambiente.Al termine dell'incubazione, scartare le foglietti di copertura e risciacquare gli scivoli con tre lavaggi di due minuti in TBSS fresco. Dopo aver rimosso il tampone in eccesso, aggiungere 200 microlitri di un'appropriata soluzione anticorpale secondaria biotinilata e uno slittamento di copertura ad ogni diapositiva per un'incubazione di 45 minuti nella camera umida a temperatura ambiente. Dopo aver scartato le foglietti di copertura, sciacquare le diapositive con TBSS come dimostrato.Rimuovere eventuali buffer in eccesso. Ed etichettare le sezioni con 200 microlitri di tampone di substrato DAB per 10 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, lavare gli scivoli con TBSS e acqua corrente del rubinetto per 10 minuti, prima di contrastare con ematossilina per tre minuti.Quindi, aggiungere 70 microlitri di un mezzo di montaggio appropriato a ogni diapositiva e puntare lentamente una striscia di copertura in vetro sul supporto di montaggio per evitare di creare bolle man mano che lo scivolo del coperchio viene abbassato in posizione. Per l'analisi istopatologica, posizionare lo scivolo sullo stadio di un microscopio luminoso e valutare l'architettura vascolare della prima sezione tissutale. Quindi, quantificare il numero di macrofagi rispetto al numero di linfociti per sezione.Per l'analisi immunoistochimica, esaminare il modello di colorazione beta del recettore del folato su ogni sezione tissutale e quantificare il numero di cellule beta positive del recettore del folato, positive CD68 e CD3 in 10 campi ad alta potenza selezionati casualmente per sezione. La colorazione di ematossilina ed eosina in campioni normali rivela una normale anatomia arteriosa, con cellule endoteliali nell'intima tunica, cellule muscolari lisce nel supporto di tunica e una matrice di collagene eterogenea, che includono fibroblasti e vasi di alimentazione chiamati vasa vasorum nella tunica adventitia. Arterite cellulare gigante arterie temporali positive dimostrano un'infiammazione da moderata a grave, con aggregati e macrofagi, o istiociti, linfociti, cellule plasmatiche occasionali e cellule giganti multi-nucleate.Si nota anche un restringimento luminale, accompagnato da ispessimento intimale e una rottura del 90% della lamina elastica interna. I linfociti positivi cd3 e i macrofagi positivi cd68 sono presenti anche in tutti gli esemplari positivi all'arterite cellulare gigante, con modelli di colorazione simili osservati in tutte le biopsie. La colorazione per il recettore del folato beta è limitata ai macrofagi e alle cellule giganti multi-nucleate che si localizzano preferenzialmente all'adventitia e ai media.In particolare, il recettore beta del folato comprendeva circa il 30% dei macrofagi totali. La lavorazione, il taglio e la decessiazione dell'arteria temporale richiedono un'attenta destrezza per eseguire i passaggi successivi. L'interpretazione della diapositiva richiede l'esperienza di un patologo cardiovascolare esperto.Ricordare agli spettatori di utilizzare precauzioni di contatto e respiratorie, come guanti e cappe ventilate, quando maneggiano campioni e reagenti.

Research

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