Name: an immunohistopathologic study to profile the folate receptor beta macrophage and vascular immune microenvironment in giant cell arteritis
Uploaded: 2019-02-08T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Immunohistopathologic Study to Profile the Folate Receptor Beta Macrophage and Vascular Immune Microenvironment in Giant Cell Arteritis at JoVE.com

이 작품 박사 더글러스 계단, 마리 안 Klinger, 앤 Benko, 사단의 류 마티스/학과 의학 그리고 분자 조직 핵심 연구소, 펜 주립 대학 대학의과 대학, 허쉬 실바의 지원에 의해 가능 하 게 되었다

설명 된 모든 방법은 펜 주 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었다.
1. histopathological 준비, 그리고 측 두 엽 동맥 생 검 후 처리
참고: 측 두 엽 동맥 생 검 (탭) 로컬 마 취 및 무 균 상태에서 인증 된 외과 의사에 의해 수행 됩니다. 후 수술 더 영향을 받는 쪽에 3 cm 동맥 섹션, 표본 즉시 24 h에 대 한 포 르 말린에 고정, 3 ~ 4 m m 섹션으로 나누어 이며 ...

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GCA는 성인에서 가장 흔한 맥 그리고 그것의 pathologic 특징 T 조 수 세포의 강력한 조합을 보여준다 또한 다른 granulomatous 질병 또는 sarcoidosis 같은 vasculopathies에서 찾을 수 있는 대 식 세포를 활성화 하 고 granulomatous polyangiitis2,3. GCA, 측 두 엽 동맥 매체-큰 크기의 동맥의 좋은 표시를 제공 합니다 및 조교 생 저장 될 수 있는 파라핀 블록에 년, 따라서 진단 신...

거 대 세포 동맥 (GCA)의 매체-큰 동맥, 대동맥 및 그것의 분 지를 대상으로 하 고 노인에 영향을 미치는 염증 성 질환 이다. 그것은 온화한 두통, 턱 통증, 시력 손상, 뇌졸중과 조직 괴 저 등 심각한 허 혈 성 합병증을 선물 한다. 진단은은 적혈구 침 강 속도 (ESR)와 측 두 엽 동맥 생 검 (탭)1에 별개 조직 패턴 같은 높은 염증 성 마커에 의해 확인 된다. GCA는 가장 일반적인 성인 맥 고 진단에 대 한 얻은 측 두 엽 동맥의 내게 필요한 옵션 하나 더 쉽게 그것의 병 인 연구를 활성화 하는 다른 vasculopathies에 비해 우위를 선물 한다. 탭에 일반적인 연구 결과 세포/histiocytes 및 일반적으로이 구분 하는 탄력 있는 lamina의 동시 파괴 tunica intima, 미디어, 그리고 adventitia의 모든 혈관 층에 걸쳐 발견 하는 T 세포의 침투를 포함 구획2. 도우미의 채용 다음 T (Th) 세포, 특히 Th1과 Th17 하위 인터 루 킨-17 분 비는, 현재 증거 보여줍니다 GCA 혈관 adventitia에 수지상 세포를 활성화 하는 알 수 없는 항을 포함 하 고 인터페론-감마 (IFG) 각각. IFG 다음 신병 고 cytokines 및 프로 테아 제를 생산 하는 세포를 활성화 합니다. 이러한 프로 염증 성 cytokines; 포함 IL-12, 상호 긍정적인 피드백 루프; 제공 Th1 세포 활성화를 포함 하 여 종양 괴 사 인자와 인터 루 킨-6, 관절염과 열과 metalloproteases는 원인이 손상 탄력 있는 lamina. 스테로이드 제제 (GC), 표준 만성 치료를 구성 하는 부분적으로 약하게 Th17/IL-17 하지만 면역 반응3,4의 Th1/IFG 팔 하지 여 cytokine 경로 제어 합니다. 불행히도, GC의 중지 질병 재발 발생합니다. 대체 양식 적임으로 토트 GCA 치료 용도가 변경 하지만 더 민감한 생체 치료 모니터링5,6에 대 한 활용 하지는 않지만 원하는 임상 끝점 일관 되 게 달성 하지 했다 . 2017 년, 인터 류 킨 6 차단기, tocilizumab, 같이 그것은 효과적으로 질병 관리 및 스테로이드 효과7,8살려주는 GCA의 치료를 위해 승인 되었다.
날짜 하려면, GCA에 대 한 더 좋은 생체 있다. 결과적으로, 그것은 질병 활동을 모니터링 하 고 부작용을 방지 하 고 사회 비용의 부담을 줄이기 위해 사용할 수 있는 약물의 복용량을 적정 어렵다. 따라서, 질병 활동 상호 병 인 및 치료 결정에 있는 원조에 새로운 통찰력을 제공 하는 후보 biomarker에 대 한 보고는 것이 필수적 이다.
대 식 세포 활성화의 dysregulation GCA 병 인에 중요 한 요소 이다. 따라서, GCA 치료의 효과적인 수단 활성화 된 대 식 세포의 선택적 대상 수 있습니다. Folate 수용 체 베타 (FRB)는 세포 막에 정박 glycosyl phosphatidylinositol 당단백질 정상적인 myelomonocytic 셀, 골수성 백혈병 세포에에서 표현 하 고 대 식 세포를 활성화. 그것의 ligand, 엽 산, 세포질 DNA 합성, 메 틸 화 및 수리9수 감소 형태로 필수적인 비타민 이다. 자가 면역 질환 및 발암 중 FRB 식이 유도 된다. 그 식이 고체 기관 및 골수성 악성10,,1112 monocytes 또는 류 마티스 관절염, 프로-염증 성 M1 세포의 표면에 또는 항 염증 제 M2 세포에 제한 , 13. 활성화 된 대 식 세포의 biomarker로 그것의 잠재적인 역할, FRB는 엽 산, antifolates 또는 셀에서 folate 활용 약물 수용 체 바인딩으로 시작 하는 다단계 프로세스를 통해 선택적 약물 전송 가능 표면, 국제화, 릴리스 및 내부 셀 기계12,14,,1516원하는 약물의 최종 배달 합니다. 대조적으로 FRB 암 세포에 표현 하 고 대 식 세포 활성화, 정상 조 혈 세포에 표현 하는 FRB는 FRB/엽 산 중재 약물 전달 FRB 양성 염증 성 또는 암 세포가 되도록 folates 바인딩할 수.
우리의 이전 연구에서 우리는 FRB GCA 대 식 세포에 표현 되는 처음으로 시연 하 고 표현 연관 CD68 + 및 endothelin 수용 체 베타 세포, GCA pathogenesis17을. 이 보고서에서 우리는 histopathological 설명 및 immunohistochemical 방법 FRB macrophage를 평가 하는 데 사용 총 림프 구 분석 그리고 macrophage GCA 혈관에 FRB의 위치에 대 한 통찰력을 얻기 위해 계산.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Reichert-Jung</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plain and frosted microscope slides and cover slips</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical rack</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Olympus BX60&#160; microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone in distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>concentrations 100%, 90%, 70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered saline solution (TBS)&#160;</td>
			<td>Dako Wash BufferS3006</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% hydrogen peroxide in TBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaminobenzidine (DAB)</td>
			<td>Sigma Fast Tablet set</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical Permount&#160; Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>SP-15-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harleco Gill&#39;s III Hematoxylin</td>
			<td>Fiisher Scientific 23-750-019</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harleco Eosin Y 1% Alcoholic Stock Solution</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>23-749-977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM citric acid monohydrate (pH 6.0)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-folate receptor beta&#160;</td>
			<td>Manohar Ratnam</td>
			<td></td>
			<td>optimized at 1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-human CD68</td>
			<td>Dako&#160;</td>
			<td>M071801</td>
			<td>optimized at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-CD3</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>A0452</td>
			<td>optimized at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymer goat anti- rabbit/mouse secondary antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Placental tissue</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#160;for FRB positive control</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an immunohistopathologic study to profile the folate receptor beta macrophage and vascular immune microenvironment in giant cell arteritis

거 대 세포 동맥 (GCA) 만성 면역 중재 매체-큰 크기의 동맥의 영향을 미치는 질병 노인 이다. GCA 매니페스트 관절염과 두통의 폐색 증상, 뇌졸중 또는 손실 비전. 대 식 세포 및 T-헬퍼 세포 혈관 벽에 침투 하 고 선박 손상 및 허 혈 이어질 프로 염증 반응을 생산. 날짜 하려면, 아무 GCA 바이오 마커 질병 활동 및 가이드 치료 응답을 감시할 수 있는 있다.
Folate 수용 체 베타 (FRB)는 glycosylphosphatidylinositol 단백질을 세포 막에 정박 하 고 일반적으로 myelomonocytic 혈통 및 또한 종양 및 류 마티스 활 액 세포, 골수성 백혈병 세포의 대부분을 표현 어디의 식을 질병의 심각도와 상관 한다. FRB의 능력 화합물 엽 산, 엽 산-어원이 같은 말 및 antifolate 마약을 했다 druggable 대상을 암 및 염증 성 질환 연구. 이 보고서 식 및 GCAimmunopathology에 관하여 FRB의 배포를 평가 하는 데 사용 하는 조직 및 immunohistochemical 방법을 설명 합니다.
GCA 및 일반 컨트롤에서 포 르 말린 고정 파라핀 포함 및 측 두 엽 동맥 biopsies Hematoxylin 및 오신 조직 조직학을 검토 하 여 pathognomonic 기능 스테인드 했다. Immunohistochemistry는 FRB, CD68 CD3 식 감지 하 사용 되었다. 현미경 분석 척도 10 선택 된 고 전력 필드 섹션 및 동맥 벽에 그들의 각각 위치에 긍정적으로 얼룩진된 셀의 수를 수행 했다.
Lymphohistiocytic (LH) 염증 내 증식 동반 및 방해 탄력 있는 lamina 컨트롤에 없음 GCA에 보였다. LH 침투는 약 60% 40%와 세포 대 식 세포의 구성 되었다. FRB 식 세포, CD68 + macrophage 총인구의 31%를 구성 하 고 미디어와 adventitia로 제한 했다. 아니 FRB 컨트롤에서 보였다.
이 프로토콜 GCA에 혈관 면역 microenvironment 기준으로 FRB macrophage의 고유한 숫자 및 공간 패턴을 보여주었다.

조직 결과
H & E tunica intima, tunica 매체에 있는 평활 근 세포에서에서 내 피 세포와 함께 정상 표본 시연된 정상적인 동맥 해부학에 얼룩과 섬유 아 세포와 피더 선박 등 이기종 콜라겐 매트릭스 라는 바사 vasorum tunica adventitia에서. 없는 염증 성 침투 식별 있다. GCA 긍정적인 일시적인 동맥 보통 심한 염증 세포/histiocyte...

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An Immunohistopathologic Study to Profile the Folate Receptor Beta Macrophage and Vascular Immune Microenvironment in Giant Cell Arteritis

프로토콜은 조직 검사 및 immunohistochemistry folate 수용 체 베타 macrophage와 총 면역 세포와의 관계는 거 대 세포 동맥 생 검 측 두 엽 동맥에에서 침투 하는 프로 파일의 사용을 보여 줍니다.

Folate 수용 체 베타 대 식 세포와 거 대 세포 동맥에서 혈관 면역 Microenvironment를 프로 파일링 하는 Immunohistopathologic 연구

Giant cell arteritis (GCA) is a chronic immune-mediated disease of medium-to-large sized arteries that affects older adults. GCA manifests with arthritis ...

이러한 면역조직화학및 조직병리학 프로토콜은 엽산 수용체 베타를 검사하는 데 사용될 수 있는데, 이는 거대 세포 동맥염의 혈관 미세 환경에 대한 잠재적 예후 및 치료적 가치를 가진 후보 단백질이다. 이 프로토콜은 시간 테스트 및 널리 사용 되 고 임시 동맥 조직에서 엽산 체 베타 속성을 탐구 하는 데 사용할 수 있습니다., 장기 저장 후. 조직 섹션을 획득하려면 마이크로토메를 사용하여 파라핀임베디드 측두동맥의 4~5마이크로미터 두께의 부분을 슬라이스하고, 각 섹션을 40도 의 수조에 띄우고 주름을 제거합니다.유리 현미경 슬라이드를 사용하여 슬라이드 당 3 개의 섹션을 캡처하고 60 분 동안 섭씨 60도 오븐에서 온전한 접시에 슬라이드를 데우십시오. 섹션이 슬라이드를 부착하면 슬라이드를 수직 랙에 넣고 24시간 동안 섭씨 37도에서 건조합니다. 다음 날 슬라이드를 슬라이드 컨테이너로 전송하여 섭씨 4도에서 최소 12시간 동안 보관합니다.다음으로, 슬라이드 랙에 로드 슬라이드를 로드하고 2 개의 5 분, 100 % 자일렌 몰입 및 내림차순으로 조직을 수화하고, 농도 에탄올 몰입 시리즈당 5 분, 30 초마다 10 초의 교반을 합니다. 70%에탄올침림 후, 슬라이드를 5분간 양적 증류수로 두 번 헹구고 30초마다 10초의 교반을 합니다. 항원 회수의 경우 랙을 섭씨 95도의 200 마이크로리터, 리터당 10 밀리미터가 30분 동안 유리 용기에 옮기습니다.인큐베이션이 끝나면 슬라이드가 실온으로 20분 간 식히고 5분 동안 흐르는 물로 헹구십시오. 내인성 과산화효소 활성을 제거하기 위해, 먼저 각 조직 샘플 주위에 원을 그리는 소수성 마커를 사용하여 10 분 동안 과산화수소 3 %의 200 마이크로 리터로 샘플을 배양한 다음 3 개의 세척당 3 개의 미콜리터에 3 개의 세척이 뒤따릅니다. 마지막 세척 후, 각 슬라이드를 부드럽게 두드려 여분의 버퍼를 제거하고 관심있는 1 차 항체 칵테일의 200 마이크로 리터를 추가하고 실온에서 습한 챔버에서 1 시간 배양을 위해 각 슬라이드에 커버 슬립을 넣습니다.인큐베이션이 끝나면 커버 슬립을 버리고 슬라이드를 신선한 TBSS에서 2분 동안 세번 으로 헹립니다. 초과 버퍼를 제거한 후 적절한 바이오타이니드 이차 항체 용액의 200마이크로리터와 각 슬라이드에 커버 슬립을 추가하여 실온에서 습한 챔버에서 45분 간 배양합니다. 커버 슬립을 폐기한 후, 입증된 대로 TBSS로 슬라이드를 헹돌립니다.초과 버퍼를 제거합니다. 그리고 실온에서 10 분 동안 DAB 기판 버퍼의 200 마이크로 리터로 섹션을 레이블. 인큐베이션이 끝나면 슬라이드를 TBSS와 흐르는 수돗물로 10분 간 세척한 후 헤마톡슬린과 3분간 대응합니다.그런 다음 각 슬라이드에 적절한 장착 매체의 70 마이크로리터를 추가하고 천천히 유리 커버 스트립을 장착 매체에 팁을 주어 커버 슬립이 제자리에 낮아질 때 거품을 만들지 않도록 합니다. 조직 병리학 적 분석을 위해, 가벼운 현미경의 단계에 슬라이드를 배치하고 첫 번째 조직 섹션의 혈관 아키텍처를 평가한다. 그런 다음 섹션당 림프구 수에 비해 대식세포의 수를 정량화합니다.면역조직화학적 분석을 위해, 각 조직 섹션에서 엽산 수용체 베타 염색 패턴을 검사하고 엽산 수용체 베타 양성, CD68 양성 및 CD3 양성 세포의 수를 섹션당 무작위로 선택된 10개에서 정량화한다. 정상적인 표본에서 헤마톡린과 에신 염색은 투니카 내티카내내피나 내피 세포, 튜니카 미디어의 매끄러운 근육 세포, 그리고 투아의 바사 혈관이라고 불리는 섬유아세포및 피더 혈관을 포함하는 이질성 콜라겐 매트릭스와 함께 정상적인 동맥 해부학을 나타낸다. 거대 세포 동맥염 양성 측두동맥은 중등도에서 중증 염증, 또는 히시오시테, 림프구, 간헐적인 혈장 세포 및 다중 핵거대 세포를 보여줍니다.발광 협개도 지적되며, 내부 탄성 라미나(lamina)의 90%의 내장 및 방해가 수반됩니다. CD3 양성 림프구 및 CD68 양성 대식세포는 모든 거대 세포 동맥염 양성 표본에도 존재하며, 모든 생검에서 유사한 염색 패턴이 관찰된다. 엽산 수용체 베타를 위한 염색은 대식세포 및 다핵거대 세포로 제한되며, 이는 재래시 및 미디어에 우선적으로 국한된다.특히 엽산 수용체 베타는 전체 대식세포의 약 30%를 구성하였다. 측두동맥 생검 처리, 절단 및 탈왁스는 후속 단계를 수행하기 위해서는 신중한 손재주가 필요합니다. 슬라이드 해석은 숙련 된 심장 혈관 병리학자의 전문 지식을 필요로합니다.표본과 시약을 취급할 때 장갑과 통풍후드와 같은 접촉 및 호흡 예방 조치를 사용하도록 시청자에게 상기시킵니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Seven Steps to Stellate Cells

셀을 별 모양으로 일곱 단계

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

연구

면역학 및 감염병학

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

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의 기생충 말벌에 대한 소개<em&gt; Drosophila</em&gt; 그리고 Antiparasite 면역 반응

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

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<em&gt; 체외</em인간 대식 세포의 분화와 양극화의 이질성을 연구&gt; 모델

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

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생체 외 및 생체 내 모델에서 혈관 벽에서 흐름 조건에 세균 부착을 연구하기 위해

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

호중구의 분리 및 분석 치료제에 림프종 세포 감도에서 자신의 역할을 확인하는 방법

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

인간 호중구 유래 거 식세포의 소설 모집단의 개발 및 식별<em&gt; 체외</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Fabricating Optical-quality Glass Surfaces to Study Macrophage Fusion

대 식 세포 융합 연구 품질 광학 유리 표면 조작

Visualizing the formation of multinucleated giant cells (MGCs) from living specimens has been challenging due to the fact that most live imaging ...

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

과일 파리, 초파리 melanogaster에 비보 먹어서 분석 결과 사용 하 여의 세포 면역 반응 평가

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are ...