Name: an immunohistopathologic study to profile the folate receptor beta macrophage and vascular immune microenvironment in giant cell arteritis
Uploaded: 2019-02-08T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Immunohistopathologic Study to Profile the Folate Receptor Beta Macrophage and Vascular Immune Microenvironment in Giant Cell Arteritis at JoVE.com

Dette arbeidet ble gjort mulig med støtte fra Dr. Douglas Stairs, Marianne Klinger, Ann Benko, avdeling av Rheumatology/Institutt for medisin og molekylære og Histopathologic kjernelaboratorium, Penn State University College of Medicine, Hershey PA.

Alle metodene beskrevet ble godkjent av Penn State institusjonelle Review Board.
1. histopathological forberedelser og behandling etter få timelige arterien biopsi
Merk: Den timelige arterie biopsy (TAB) utføres under lokalbedøvelse og sterile forhold av en sertifisert kirurg. Etter kirurgisk få 3 cm arteriell inndelinger på siden flere berørte, prøven er fast i formalin umiddelbart for 24 h, delt i 3 til 4 mm og innebygd i parafin, betale for...

<ol>
	<li>Klippel, J. H., Stone, J. H., White, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Primer on the rheumatic diseases. , (2008).</li><li>Weyand, C. M., Goronzy, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+mechanisms+in+medium+and+large-vessel+vasculitis.">Immune mechanisms in medium and large-vessel vasculitis.</a> Nature Reviews Rheumatol. 9 (12), 731-740 (2013).</li><li>Weyand, C. M., Liao, Y. J., Goronzy, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunopathology+of+giant+cell+arteritis:+diagnostic+and+therapeutic+implications.">The immunopathology of giant cell arteritis: diagnostic and therapeutic implications.</a> Journal of Neuro-ophthalmology. 32 (3), 259-265 (2012).</li><li>Deng, J., Younge, B., Olshen, R., Goronzy, J., Weyand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th17+and+Th1+T-cell+responses+in+giant+cell+arteritis.">Th17 and Th1 T-cell responses in giant cell arteritis.</a> Circulation. 121, 906-915 (2010).</li><li>Mahr, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjunctive+methotrexate+for+treatment+of+giant+cell+arteritis:+an+individual+patient+data+meta-analysis.">Adjunctive methotrexate for treatment of giant cell arteritis: an individual patient data meta-analysis.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 56 (8), 2789-2797 (2007).</li><li>Hoffman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicenter,+randomized,+double-blind,+placebo-controlled+trial+of+adjuvant+methotrexate+treatment+for+giant+cell+arteritis.">A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled trial of adjuvant methotrexate treatment for giant cell arteritis.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 46 (5), 1309-1318 (2002).</li><li>Stone, J. H., Klearman, M., Collinson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trial+of+Tocilizumab+in+Giant-Cell+Arteritis.">Trial of Tocilizumab in Giant-Cell Arteritis.</a> New England Journal of Medicine. 377 (15), 1494-1495 (2017).</li><li>Milman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tocilizumab+increased+sustained+glucocorticoid-free+remission+from+giant+cell+arteritis.">Tocilizumab increased sustained glucocorticoid-free remission from giant cell arteritis.</a> Annals of Internal Medicine. 167 (12), JC63 (2017).</li><li>Xia, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+folate+receptor+is+induced+during+macrophage+activation+and+can+be+used+to+target+drugs+to+activated+macrophages.">A functional folate receptor is induced during macrophage activation and can be used to target drugs to activated macrophages.</a> Blood. 113 (2), 438-446 (2009).</li><li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folate+receptor-beta+constitutes+a+marker+for+human+proinflammatory+monocytes.">Folate receptor-beta constitutes a marker for human proinflammatory monocytes.</a> Journal of Leukocyte Biology. 96 (4), 563-570 (2014).</li><li>Salazar, M. D., Ratnam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+folate+receptor:+what+does+it+promise+in+tissue-targeted+therapeutics.">The folate receptor: what does it promise in tissue-targeted therapeutics.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 26 (1), 141-152 (2007).</li><li>Low, P. S., Henne, W. A., Doorneweerd, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+development+of+folic-acid-based+receptor+targeting+for+imaging+and+therapy+of+cancer+and+inflammatory+diseases.">Discovery and development of folic-acid-based receptor targeting for imaging and therapy of cancer and inflammatory diseases.</a> Accounts of Chemical Research. 41 (1), 120-129 (2008).</li><li>Puig-Kroger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folate+receptor+beta+is+expressed+by+tumor-associated+macrophages+and+constitutes+a+marker+for+M2+anti-inflammatory/regulatory+macrophages.">Folate receptor beta is expressed by tumor-associated macrophages and constitutes a marker for M2 anti-inflammatory/regulatory macrophages.</a> Cancer Research. 69 (24), 9395-9403 (2009).</li><li>Nakashima-Matsushita, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+expression+of+folate+receptor+beta+and+its+possible+role+in+methotrexate+transport+in+synovial+macrophages+from+patients+with+rheumatoid+arthritis.">Selective expression of folate receptor beta and its possible role in methotrexate transport in synovial macrophages from patients with rheumatoid arthritis.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 42 (8), 1609-1616 (1999).</li><li>vander Heijden, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folate+receptor+beta+as+a+potential+delivery+route+for+novel+folate+antagonists+to+macrophages+in+the+synovial+tissue+of+rheumatoid+arthritis+patients.">Folate receptor beta as a potential delivery route for novel folate antagonists to macrophages in the synovial tissue of rheumatoid arthritis patients.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 60 (1), 12-21 (2009).</li><li>Jansen, G., Peters, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+in+folate+receptors+and+transporters:+implications+for+disease+and+treatment+of+immune+diseases+and+cancer.">Novel insights in folate receptors and transporters: implications for disease and treatment of immune diseases and cancer.</a> Pteridines. 26 (2), 41-53 (2015).</li><li>Albano-Aluquin, S., Malysz, J., Aluquin, V. R., Ratnam, M., Olsen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunohistochemical+analysis+of+folate+receptor+beta+expression+and+distribution+in+giant+cell+arteritis+-+a+pilot+study.">An immunohistochemical analysis of folate receptor beta expression and distribution in giant cell arteritis - a pilot study.</a> American Journal of Clinical and Experimental Immunology. 6 (6), 107-114 (2017).</li><li>Ross, J. F., Chaudhuri, P. K., Ratnam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+folate+receptor+isoforms+in+normal+and+malignant+tissues+in+vivo+and+in+established+cell+lines.+Physiologic+and+clinical+implications.">Differential regulation of folate receptor isoforms in normal and malignant tissues in vivo and in established cell lines. Physiologic and clinical implications.</a> Cancer. 73 (9), 2432-2443 (1994).</li><li>Reiner, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+molecular+biology.+Macrophages+and+dendritic+cells.+Methods+and+protocols.+Preface.">Methods in molecular biology. Macrophages and dendritic cells. Methods and protocols. Preface.</a> Methods in Molecular Biology. 531, (2009).</li><li>Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunofluorescence+labelling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+tissue.">Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BMC Cell Biology. 9, 13 (2008).</li><li>Pawlina, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histology: A text and atlas with correlated cell and molecular biology. , (2016).</li><li>Kumar, V., Abbas, A., Robbins Aster, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Robbins and Cotran pathologic basis of disease. , (2015).</li><li>Dabbs, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Diagnostic immunohistochemistry. , (2019).</li><li>Ross, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folate+receptor+type+beta+is+a+neutrophilic+lineage+marker+and+is+differentially+expressed+in+myeloid+leukemia.">Folate receptor type beta is a neutrophilic lineage marker and is differentially expressed in myeloid leukemia.</a> Cancer. 85 (2), 348-357 (1999).</li><li>Holzapfel, G. A., Fratzl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+in+arterial+walls:+biomechanical+aspects.">Collagen in arterial walls: biomechanical aspects.</a> Collagen. Structure and Mechanics. , 285-324 (2008).</li><li>Sultan, H., Smith, S. V., Lee, A. G., Chevez-Barrios, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathologic+Markers+Determining+Prognosis+in+Patients+with+Treated+or+Healing+Giant+Cell+Arteritis.">Pathologic Markers Determining Prognosis in Patients with Treated or Healing Giant Cell Arteritis.</a> American Journal of Ophthalmology. , (2018).</li></ol>

GCA er den vanligste vaskulitt i voksne og sin patologisk hallmark eksemplifiserer en potent kombinasjon av T-lymfocytter helper og aktivert makrofager som kan også finnes i andre granulomatøs sykdommer eller vasculopathies som Sarkoidose og granulomatøs polyangiitis2,3. I GCA, timelige arterien gir en god representasjon av en middels til store store arterien og TA biopsi gir en betydelig utvalg som kan lagres i parafinblokkene år dermed skape muligheter til ...

Gigantiske celle arteritt (GCA) er en betennelsessykdom i middels til store arteriene, målretting aorta og dens forgreninger og påvirker eldre voksne. Den presenterer med mild til alvorlig iskemiske komplikasjoner som hodepine, kjeve smerter, synstap, hjerneslag og vev koldbrann. Diagnosen er bekreftet av høy inflammatoriske markører som røde blodlegemer sedimentasjonsrate (SR) og et distinkt histopathologic mønster på timelige arterien biopsi (TAB)1. GCA er den vanligste voksen vaskulitt tilgjengelighet i timelige arterien innhentet for diagnose presenterer en fordel over andre vasculopathies, dermed muliggjør en studere sin patogenese lettere. Typisk resultatene kategorien inkluderer en infiltrere makrofager/histiocytter og T-lymfocytter funnet over alle vaskulære lag av tunika intima, media og adventitia med samtidig ødeleggelse av den elastiske lamina som vanligvis skiller dette rom2. Dagens bevisene viser at GCA innebærer et ukjent antigen som aktiverer dendrittiske celler i det vaskulære adventitia, etterfulgt av rekruttering av hjelper T (Th) celler, spesielt Th1 og Th17 undertypene som skiller interleukin-17 og plasma interferon-gamma (IFG) henholdsvis. IFG så rekrutterer og aktiverer makrofager å produsere cytokiner og proteaser. Disse inkluderer pro-inflammatoriske cytokiner; inkludert IL-12, som aktiverer gjensidig Th1 celler dermed gir en positiv feedback loop; tumor nekrose faktor og interleukin-6, som forårsaker artritt og fevers og metalloproteases som skade den elastiske lamina. Glukokortikoider (GC), som utgjør standard kronisk terapi, kontrollere delvis cytokin veier av demping Th17/IL-17 men ikke Th1/IFG armen av immunrespons3,4. Dessverre seponering av GC resulterer i sykdommen tilbakefall. Som et alternativ modalitet, methotrexate har blitt repurposed for GCA behandling, men ønsket klinisk endepunktene ble ikke konsekvent oppnådd selv om mer følsomme biomarkers ikke har vært benyttet for terapeutisk overvåking5,6 . I 2017, ble interleukin 6 blokkering, tocilizumab, godkjent for behandling av GCA som det effektivt demonstrert sykdomskontroll og steroid sparsom effekter7,8.
Hittil er det ingen bra biomarkers for GCA. Som et resultat, er det vanskelig å overvåke sykdomsaktivitet og sjarmere doser av tilgjengelige narkotika å unngå bivirkninger og redusere byrden av kostnader for samfunnet. Derfor er det viktig å se etter en kandidat biomarkør som samsvarer med sykdomsaktivitet, gi romanen innsikt i patogenesen og bistand i terapeutisk beslutninger.
Feilregulering macrophage aktivisering er en kritisk faktor i GCA patogenesen. Dermed kan et effektivt middel for behandling av GCA være selektiv målrettingen aktivert makrofager. Folat reseptor beta (FRB) er en glycosyl-phosphatidylinositol glykoprotein som er forankret i cellemembranen uttrykt i normal myelomonocytic celler, myelogen leukemi celler og aktivert makrofager. Ligand, folsyre, er en viktig vitamin i formen, som gjør mobilnettet DNA syntese, metylering og reparasjon9. FRB uttrykk er indusert i autoimmune sykdommer og under kreft. Uttrykket er begrenset til overflaten av monocytter eller pro-inflammatoriske M1 makrofager i revmatoid artritt eller anti-inflammatorisk M2 makrofager i solid orgel og myelogen malignitet10,11,12 , 13. i tillegg til sin potensielle rolle som en biomarkør av aktivert makrofager, FRB kan aktivere selektiv narkotika transport gjennom en flertrinnsprosess som starter med reseptor bindingen til folinsyre, antifolates eller folat-konjugerte medisiner på cellen overflaten, etterfulgt av internalisering, utgivelse og eventuell levering av ønsket stoffet til interne celle maskiner12,14,15,16. I motsetning til FRB uttrykt i kreftceller og aktivert makrofager, FRB uttrykt i normal blodkreft cellene kan ikke binde folates og dermed sikre at FRB/folat-mediert narkotika-leveranser er begrenset til FRB-positive inflammatoriske eller kreftceller.
I vår forrige studie vi viste for første gang som FRB uttrykkes i GCA makrofager og uttrykket korrelert med CD68 + og endothelin reseptor beta makrofager, som bidrar til GCA patogenesen17. I denne rapporten beskriver vi de histopathological og immunohistochemical metoder brukes til å vurdere FRB macrophage og analysert de totale lymfocytt og macrophage teller for å få innsikt i den FRB posisjon i GCA vaskulære landskapet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Reichert-Jung</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plain and frosted microscope slides and cover slips</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical rack</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Olympus BX60&#160; microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone in distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>concentrations 100%, 90%, 70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered saline solution (TBS)&#160;</td>
			<td>Dako Wash BufferS3006</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% hydrogen peroxide in TBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaminobenzidine (DAB)</td>
			<td>Sigma Fast Tablet set</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical Permount&#160; Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>SP-15-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harleco Gill&#39;s III Hematoxylin</td>
			<td>Fiisher Scientific 23-750-019</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harleco Eosin Y 1% Alcoholic Stock Solution</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>23-749-977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM citric acid monohydrate (pH 6.0)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-folate receptor beta&#160;</td>
			<td>Manohar Ratnam</td>
			<td></td>
			<td>optimized at 1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-human CD68</td>
			<td>Dako&#160;</td>
			<td>M071801</td>
			<td>optimized at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-CD3</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>A0452</td>
			<td>optimized at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymer goat anti- rabbit/mouse secondary antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Placental tissue</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#160;for FRB positive control</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an immunohistopathologic study to profile the folate receptor beta macrophage and vascular immune microenvironment in giant cell arteritis

Gigantiske celle arteritt (GCA) er en kronisk immun-mediert sykdom av middels til store store arterier som påvirker eldre voksne. GCA manifester med leddgikt og occlusive symptomer hodepine, hjerneslag eller visjonen tap. Makrofager og T-helper lymfocytter infiltrere vaskulære veggen og produsere en pro-inflammatoriske respons som fører til fartøyet skade og ischemia. Hittil er det ingen GCA biomarkør som kan overvåke sykdom aktivitet og guide terapeutiske svar.
Folat reseptor beta (FRB) er et glycosylphosphatidylinositol protein som er forankret på celle membraner og vanligvis uttrykt i myelomonocytic avstamning og i fleste myelogen leukemi cellene også svulst og Revmatoid synovial makrofager, der uttrykket samsvarer med sykdommens alvorlighetsgrad. Evne til FRB binde folat forbindelser, folsyre-conjugates og antifolate narkotika har gjort det en druggable mål i kreft og betennelsessykdom forskning. Denne rapporten beskriver metodene histopathologic og immunohistochemical brukes til å vurdere uttrykk og distribusjon av FRB i forhold til GCAimmunopathology.
Formalin-fast og parafin-embedded timelige arterien biopsier fra GCA og vanlige kontrollene var farget med Hematoxylin og Eosin å vurdere vev histology og Patognomonisk funksjoner. Immunohistochemistry ble brukt til å oppdage FRB, CD68 og CD3 uttrykk. En microscopic analyse ble utført for å kvantifisere antall positivt farget celler på 10 utvalgte høy-power-feltet deler og deres respektive steder i arterieveggen.
Lymphohistiocytic (LH) betennelse ledsaget av intimal hyperplasia og forstyrret elastisk lamina ble sett i GCA med ingen i kontroller. LH infiltrere var sammensatt av ca 60% lymfocytter og 40% makrofager. FRB uttrykk var begrenset til makrofager, som består av 31% av den totale CD68 + macrophage befolkningen og lokalisert til media og adventitia. Ingen FRB ble sett i kontroller.
Denne protokollen vist en distinkte numeriske og romlig mønster av FRB macrophage i forhold til det vaskulære immun microenvironment i GCA.

Histopathologic funn
H & E flekker i normal prøver demonstrert normal arteriell anatomi med endotelceller i tunika intima, glatte muskelcellene i tunika media, og en heterogene kollagen matrise fibroblaster og mater skip kalt vasa vasorum i tunica adventitia. Det er ingen inflammatoriske infiltrere identifisert. GCA positive timelige arterier vist moderat til alvorlig betennelse med aggregat makrofager/histiocy...

Watch this Scientific Journal Video about An Immunohistopathologic Study to Profile the Folate Receptor Beta Macrophage and Vascular Immune Microenvironment in Giant Cell Arteritis at JoVE.com

An Immunohistopathologic Study to Profile the Folate Receptor Beta Macrophage and Vascular Immune Microenvironment in Giant Cell Arteritis

Protokollen illustrerer bruken av histopathologic undersøkelse og immunohistochemistry profilen folat reseptor beta macrophage og dens forhold til totalt immun-cellen infiltrere i timelige arterien biopsier i gigantiske celle arteritt.

En Immunohistopathologic studie til folat reseptor Beta Macrophage og vaskulær immun Microenvironment i gigantiske celle arteritt

Giant cell arteritis (GCA) is a chronic immune-mediated disease of medium-to-large sized arteries that affects older adults. GCA manifests with arthritis ...

Denne immunohistokjemiske og histopatologiske protokollen kan brukes til å undersøke folatreseptor beta, som er et kandidatprotein med potensiell prognostisk og terapeutisk verdi til vaskulær mikromiljø i gigantisk cellearteritt. Denne protokollen er tidstestet og mye ansatt og kan brukes til å utforske folat reseptor beta attributter i temporal arterie vev, selv etter langsiktig lagring. For å skaffe vevsseksjoner, bruk en mikrotom til å skjære fire til fem mikrometer tykke deler av parafin-innebygde temporale arterier, flytende hver seksjon i et 40 grader Celsius vannbad som de oppnås, for å fjerne rynker.Bruk glassmikroskopsklier for å fange tre seksjoner per lysbilde, og varm lysbildene på en varmeplate, i en 60 graders Celsius-ovn i 60 minutter. Når seksjonene har festet seg til lysbildene, plasserer du lysbildene i et vertikalt stativ for tørking ved 37 grader celsius i 24 timer. Neste dag overfører du lysbildene til en lysbildebeholder for lagring ved fire grader Celsius i minst 12 timer.Deretter glir lasten inn i et lysbildestativ og hydrerer vevet med to fem-minutters, 100% xylen nedsenking og en synkende, fem minutters per konsentrasjon etanol nedsenking serien, med 10 sekunder med agitasjon hvert 30. Etter 70% etanol nedsenking, skyll lysbildene to ganger i dobbeltdestillert vann i fem minutter, med 10 sekunder med agitasjon hvert 30. For antigenhenting, overfør stativet til en glassbeholder med 200 mikroliter på 95 grader Celsius, 10 millimolar per liter citratbuffer i 30 minutter.På slutten av inkubasjonen, la lysbildene avkjøles til romtemperatur i 20 minutter før skylling med rennende vann i fem minutter. For å fjerne endogene peroksidaseaktivitet, bruk først en hydrofob markør til å tegne en sirkel rundt hver vevsprøve, før du inkuberer prøvene i 200 mikroliter med 3% hydrogenperoksid i 10 minutter, etterfulgt av 3 vasker i 200 micoliters av trisbufret saltløsning, eller TBSS, per vask. Etter den siste vasken, dab hver lysbilde forsiktig for å fjerne overflødig buffer og legge til 200 mikroliter av den primære antistoff cocktail av interesse og et deksel slip til hvert lysbilde for en times inkubasjon i et fuktig kammer ved romtemperatur.På slutten av inkubasjonen, kast dekselet slips og skyll lysbildene med tre to minutters vasker i friske TBSS. Etter å ha fjernet overflødig buffer, tilsett 200 mikroliter av en passende biotinylert sekundær antistoffløsning og en dekselslip til hvert lysbilde for en 45-minutters inkubasjon i det fuktige kammeret ved romtemperatur. Etter at dekselet er kassert, skyll lysbildene med TBSS som vist.Fjern overflødig buffer. Og merk seksjonene med 200 mikroliter dab-substratbuffer i 10 minutter ved romtemperatur. På slutten av inkubasjonen vasker du lysbildene med TBSS og rennende vann fra springen i 10 minutter, før du teller med hematoksylin i tre minutter.Deretter legger du til 70 mikroliter av et passende monteringsmedium til hvert lysbilde og sakte tipper en glassdekselstripe på monteringsmediet for å unngå å lage bobler når dekselet glir ned på plass. For histopathologic analyse, plasser lysbildet på scenen av et lett mikroskop og vurder den vaskulære arkitekturen til den første vevsdelen. Deretter kvantifiserer du antall makrofager i forhold til antall lymfocytter per seksjon.For immunohistokjemisk analyse, undersøke folat reseptor beta farging mønster på hver vev seksjon og kvantifisere antall folat reseptor beta positiv, CD68 positive, og CD3 positive celler i 10 tilfeldig utvalgte høy effekt felt per seksjon. Hematoksylin og eosinfarging i normale prøver avslører en normal arteriell anatomi, med endotelceller i tunika intima, glatte muskelceller i tunikamediet og en heterogen kollagenmatrise, som inkluderer fibroblaster og materkar kalt vasa vasorum i tunika adventitia. Gigantiske cellearteritt positive temporale arterier viser en moderat til alvorlig betennelse, med aggregater og makrofager, eller histiocytter, lymfocytter, sporadiske plasmaceller og multikjernerte gigantiske celler.Luminal innsnevring er også notert, og ledsaget av intimal fortykning og en 90% forstyrrelse av den interne elastiske lamina. CD3 positive lymfocytter og CD68 positive makrofager er også til stede i alle gigantiske cellearteritt positive prøver, med lignende farging mønstre observert i alle biopsier. Farging for folat reseptor beta er begrenset til makrofager og multi-nucleated gigantiske celler som fortrinnsvis lokalisere til adventitia og media.Spesielt, folat reseptor beta besto ca 30% av de totale makrofager. Den temporale arterien biopsi behandling, skjæring, og dewaxing krever forsiktig fingerferdighet for å utføre påfølgende trinn. Lysbildetolkningen krever ekspertisen til en erfaren kardiovaskulær patolog.Minn seerne på å bruke kontakt- og åndedrettsforanstaltninger, for eksempel hansker og ventilerte hetter, ved håndtering av prøver og reagenser.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

En<em&gt; In vitro</em&gt; Modell for å studere heterogenitet of Human Macrophage Differensiering og Polarisering

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In vitro og in vivo modell for å studere bakteriell adhesjon til fartøyet veggen under strømningsforhold

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Nøytrofile Isolering og analyse for å fastslå deres rolle i lymfom Cell Følsomhet for Terapeutiske midler

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Utvikling og identifikasjon av en Novel undergruppe av menneskelige nøytrofilmedierte avledet Giant Fagocytter<em&gt; In Vitro</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Fabricating Optical-quality Glass Surfaces to Study Macrophage Fusion

Fabrikere optisk-kvalitet barometer overflater å studere Macrophage Fusion

Visualizing the formation of multinucleated giant cells (MGCs) from living specimens has been challenging due to the fact that most live imaging ...

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

Vurdere mobilnettet immunforsvaret frukt fly, Drosophila melanogaster, bruke i Vivo fagocytose analysen

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are ...