Name: an immunohistopathologic study to profile the folate receptor beta macrophage and vascular immune microenvironment in giant cell arteritis
Uploaded: 2019-02-08T12:30:00
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Este trabalho foi feito possível pelo suporte de Stairs de Douglas do Dr., Marianne Klinger, Ann Benko, divisão de Reumatologia/departamento de medicina e o Molecular e histopatológico de núcleo de laboratório, Estado Penn University College of Medicine, Hershey PA.

Todos os métodos descritos foram aprovados pelo Conselho de revisão institucional estado de Penn.
1. histopatológica preparação, processamento e após a obtenção de biópsia da artéria Temporal
Nota: A biópsia da artéria temporal (TAB) é realizada sob anestesia local e condições estéreis por um cirurgião certificado. Depois de obter cirurgicamente uma seção arterial de 3 cm no lado mais afetado, o espécime é fixado em formalina ime...

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	<li>Klippel, J. H., Stone, J. H., White, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Primer on the rheumatic diseases. , (2008).</li><li>Weyand, C. M., Goronzy, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+mechanisms+in+medium+and+large-vessel+vasculitis.">Immune mechanisms in medium and large-vessel vasculitis.</a> Nature Reviews Rheumatol. 9 (12), 731-740 (2013).</li><li>Weyand, C. M., Liao, Y. J., Goronzy, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunopathology+of+giant+cell+arteritis:+diagnostic+and+therapeutic+implications.">The immunopathology of giant cell arteritis: diagnostic and therapeutic implications.</a> Journal of Neuro-ophthalmology. 32 (3), 259-265 (2012).</li><li>Deng, J., Younge, B., Olshen, R., Goronzy, J., Weyand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th17+and+Th1+T-cell+responses+in+giant+cell+arteritis.">Th17 and Th1 T-cell responses in giant cell arteritis.</a> Circulation. 121, 906-915 (2010).</li><li>Mahr, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjunctive+methotrexate+for+treatment+of+giant+cell+arteritis:+an+individual+patient+data+meta-analysis.">Adjunctive methotrexate for treatment of giant cell arteritis: an individual patient data meta-analysis.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 56 (8), 2789-2797 (2007).</li><li>Hoffman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicenter,+randomized,+double-blind,+placebo-controlled+trial+of+adjuvant+methotrexate+treatment+for+giant+cell+arteritis.">A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled trial of adjuvant methotrexate treatment for giant cell arteritis.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 46 (5), 1309-1318 (2002).</li><li>Stone, J. H., Klearman, M., Collinson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trial+of+Tocilizumab+in+Giant-Cell+Arteritis.">Trial of Tocilizumab in Giant-Cell Arteritis.</a> New England Journal of Medicine. 377 (15), 1494-1495 (2017).</li><li>Milman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tocilizumab+increased+sustained+glucocorticoid-free+remission+from+giant+cell+arteritis.">Tocilizumab increased sustained glucocorticoid-free remission from giant cell arteritis.</a> Annals of Internal Medicine. 167 (12), JC63 (2017).</li><li>Xia, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+folate+receptor+is+induced+during+macrophage+activation+and+can+be+used+to+target+drugs+to+activated+macrophages.">A functional folate receptor is induced during macrophage activation and can be used to target drugs to activated macrophages.</a> Blood. 113 (2), 438-446 (2009).</li><li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folate+receptor-beta+constitutes+a+marker+for+human+proinflammatory+monocytes.">Folate receptor-beta constitutes a marker for human proinflammatory monocytes.</a> Journal of Leukocyte Biology. 96 (4), 563-570 (2014).</li><li>Salazar, M. D., Ratnam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+folate+receptor:+what+does+it+promise+in+tissue-targeted+therapeutics.">The folate receptor: what does it promise in tissue-targeted therapeutics.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 26 (1), 141-152 (2007).</li><li>Low, P. S., Henne, W. A., Doorneweerd, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+development+of+folic-acid-based+receptor+targeting+for+imaging+and+therapy+of+cancer+and+inflammatory+diseases.">Discovery and development of folic-acid-based receptor targeting for imaging and therapy of cancer and inflammatory diseases.</a> Accounts of Chemical Research. 41 (1), 120-129 (2008).</li><li>Puig-Kroger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folate+receptor+beta+is+expressed+by+tumor-associated+macrophages+and+constitutes+a+marker+for+M2+anti-inflammatory/regulatory+macrophages.">Folate receptor beta is expressed by tumor-associated macrophages and constitutes a marker for M2 anti-inflammatory/regulatory macrophages.</a> Cancer Research. 69 (24), 9395-9403 (2009).</li><li>Nakashima-Matsushita, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+expression+of+folate+receptor+beta+and+its+possible+role+in+methotrexate+transport+in+synovial+macrophages+from+patients+with+rheumatoid+arthritis.">Selective expression of folate receptor beta and its possible role in methotrexate transport in synovial macrophages from patients with rheumatoid arthritis.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 42 (8), 1609-1616 (1999).</li><li>vander Heijden, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folate+receptor+beta+as+a+potential+delivery+route+for+novel+folate+antagonists+to+macrophages+in+the+synovial+tissue+of+rheumatoid+arthritis+patients.">Folate receptor beta as a potential delivery route for novel folate antagonists to macrophages in the synovial tissue of rheumatoid arthritis patients.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 60 (1), 12-21 (2009).</li><li>Jansen, G., Peters, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+in+folate+receptors+and+transporters:+implications+for+disease+and+treatment+of+immune+diseases+and+cancer.">Novel insights in folate receptors and transporters: implications for disease and treatment of immune diseases and cancer.</a> Pteridines. 26 (2), 41-53 (2015).</li><li>Albano-Aluquin, S., Malysz, J., Aluquin, V. R., Ratnam, M., Olsen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunohistochemical+analysis+of+folate+receptor+beta+expression+and+distribution+in+giant+cell+arteritis+-+a+pilot+study.">An immunohistochemical analysis of folate receptor beta expression and distribution in giant cell arteritis - a pilot study.</a> American Journal of Clinical and Experimental Immunology. 6 (6), 107-114 (2017).</li><li>Ross, J. F., Chaudhuri, P. K., Ratnam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+folate+receptor+isoforms+in+normal+and+malignant+tissues+in+vivo+and+in+established+cell+lines.+Physiologic+and+clinical+implications.">Differential regulation of folate receptor isoforms in normal and malignant tissues in vivo and in established cell lines. Physiologic and clinical implications.</a> Cancer. 73 (9), 2432-2443 (1994).</li><li>Reiner, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+molecular+biology.+Macrophages+and+dendritic+cells.+Methods+and+protocols.+Preface.">Methods in molecular biology. Macrophages and dendritic cells. Methods and protocols. Preface.</a> Methods in Molecular Biology. 531, (2009).</li><li>Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunofluorescence+labelling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+tissue.">Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BMC Cell Biology. 9, 13 (2008).</li><li>Pawlina, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histology: A text and atlas with correlated cell and molecular biology. , (2016).</li><li>Kumar, V., Abbas, A., Robbins Aster, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Robbins and Cotran pathologic basis of disease. , (2015).</li><li>Dabbs, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Diagnostic immunohistochemistry. , (2019).</li><li>Ross, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folate+receptor+type+beta+is+a+neutrophilic+lineage+marker+and+is+differentially+expressed+in+myeloid+leukemia.">Folate receptor type beta is a neutrophilic lineage marker and is differentially expressed in myeloid leukemia.</a> Cancer. 85 (2), 348-357 (1999).</li><li>Holzapfel, G. A., Fratzl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+in+arterial+walls:+biomechanical+aspects.">Collagen in arterial walls: biomechanical aspects.</a> Collagen. Structure and Mechanics. , 285-324 (2008).</li><li>Sultan, H., Smith, S. V., Lee, A. G., Chevez-Barrios, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathologic+Markers+Determining+Prognosis+in+Patients+with+Treated+or+Healing+Giant+Cell+Arteritis.">Pathologic Markers Determining Prognosis in Patients with Treated or Healing Giant Cell Arteritis.</a> American Journal of Ophthalmology. , (2018).</li></ol>

GCA é a vasculite mais comum em adultos, e sua marca patológica exemplifica uma potente combinação de linfócitos T helper e ativados macrófagos que também podem ser encontrados em outras doenças granulomatosas ou vasculopathies como sarcoidose e granulomatosa poliangiite2,3. Em GCA, a artéria temporal fornece uma boa representação de tamanho médio a grande artéria e a biópsia TA dá uma amostra considerável que pode ser armazenada em blocos de para...

Arterite de células gigantes (GCA) é uma doença inflamatória das artérias de médio a grande, visando a aorta e seus ramos e afetando adultos mais velhos. Apresenta-se com leve a graves complicações isquêmicas, tais como dores de cabeça, dor no maxilar, perda de visão, acidente vascular cerebral e tecido gangrena. O diagnóstico é confirmado pela altos marcadores inflamatórios como taxa de sedimentação de eritrócitos (ESR) e um padrão distinto de histopatológico na artéria temporal biópsia (TAB)1. GCA é a vasculite mais comum de adulta e a acessibilidade da artéria temporal obtida para o diagnóstico apresenta uma vantagem sobre outros vasculopathies, permitindo que se estude a sua patogênese mais prontamente. Os achados típicos na guia incluem um infiltrado de histiócitos/macrófagos e linfócitos T, encontrados em todas as camadas vasculares da túnica íntima, mídia e adventícia com simultânea destruição da lâmina elástica que normalmente separa estas compartimentos2. A evidência atual demonstra que o GCA envolve um antígeno desconhecido que ativa as células dendríticas no adventitia vascular, seguido pelo recrutamento de auxiliar células T (Th), especificamente Th1 e Th17 subtipos que secretam Interleucina-17 e interferon-gama (IFG) respectivamente. IFG então recrutas e ativa macrófagos a produzir citocinas e proteases. Estes incluem citocinas pró-inflamatórias; incluindo a IL-12, que reciprocamente, ativa as células Th1, proporcionando assim uma retroalimentação positiva; fator de necrose tumoral e interleucina-6, que causam artrite e febres e metaloproteases que danificam a lâmina elástica. Glicocorticoides (GC), que constituem a padrão terapêutica crónica, parcialmente controlam as vias de citocina, atenuando o Th17/IL-17, mas não o braço de Th1/IFG da resposta imune3,4. Infelizmente, a descontinuação do GC resulta em recaída da doença. Como uma modalidade alternativa, metotrexato tem foi realocado para o tratamento de GCA, mas os pontos de extremidade clínicos desejados não foram consistentemente alcançados, embora mais sensíveis biomarcadores não tenham sido utilizados para terapêutica monitoramento5,6 . Em 2017, o bloqueador de interleucina 6, tocilizumab, foi aprovado para o tratamento de GCA como demonstrou efetivamente o controle de doença e esteroide poupadores efeitos7,8.
Até à data, não há nenhuma boas biomarcadores para GCA. Como resultado, é difícil monitorar a atividade da doença e titula-se doses de drogas disponíveis para evitar efeitos adversos e reduzir a carga de custos para a sociedade. Assim, é imperativo para procurar um biomarcador de candidato que correlaciona-se com atividade de doença, fornecem introspecções novela na patogênese e ajuda nas decisões terapêuticas.
A desregulação da ativação de macrófagos é um fator crítico na patogênese do GCA. Assim, um meio eficaz de tratar a GCA pode ser a seleção de alvos de macrófagos ativados. O beta de receptor de folato (FRB) é uma glicoproteína glycosyl-fosfatidilinositol que está ancorada na membrana celular expressos nas células mielomonocítica normal, as células de leucemia mieloide e ativados macrófagos. Seu ligante, ácido fólico, é uma vitamina essencial na sua forma reduzida, o que permite que celulares DNA síntese, metilação e reparação9. Expressão de FRB é induzida em doença auto-imune e durante a carcinogênese. Sua expressão é restrito à superfície de monócitos ou pró-inflamatórias macrófagos M1 na artrite reumatoide, ou aos anti-inflamatórios M2 de macrófagos em órgãos sólidos e neoplasias mieloides10,11,12 , 13. além de seu papel potencial como um biomarcador de macrófagos ativados, a FRB pode habilitar o transporte seletivo de drogas através de um processo de várias etapa que começa com a ligação ao receptor de ácido fólico, antifolates ou drogas conjugada com ácido fólico na célula superfície, seguido de interiorização, lançamento e eventual entrega de droga desejada para a célula interna máquinas12,14,15,16. Em contraste com a FRB expressa em células cancerosas e ativados macrófagos, FRB, expressa em células hematopoiéticas normais é incapaz de vincular folatos, assegurando que entrega de droga FRB/ácido fólico-mediada é limitada a FRB-positivo inflamatória ou células cancerosas.
Em nosso estudo anterior, temos demonstrado pela primeira vez FRB é expressa em macrófagos GCA e sua expressão correlacionados com CD68 + e endotelina macrófagos de beta do receptor, que contribuem para a patogênese de GCA17. Neste relatório, descrevemos o histopatológico e imuno-histoquímica métodos utilizados para avaliar o macrófago FRB e analisaram os linfócitos totais e macrófago conta ganhar a introspecção em posição a FRB na paisagem vascular GCA.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Reichert-Jung</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plain and frosted microscope slides and cover slips</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical rack</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Olympus BX60&#160; microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone in distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>concentrations 100%, 90%, 70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered saline solution (TBS)&#160;</td>
			<td>Dako Wash BufferS3006</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% hydrogen peroxide in TBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaminobenzidine (DAB)</td>
			<td>Sigma Fast Tablet set</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical Permount&#160; Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>SP-15-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harleco Gill&#39;s III Hematoxylin</td>
			<td>Fiisher Scientific 23-750-019</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harleco Eosin Y 1% Alcoholic Stock Solution</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>23-749-977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM citric acid monohydrate (pH 6.0)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-folate receptor beta&#160;</td>
			<td>Manohar Ratnam</td>
			<td></td>
			<td>optimized at 1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-human CD68</td>
			<td>Dako&#160;</td>
			<td>M071801</td>
			<td>optimized at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-CD3</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>A0452</td>
			<td>optimized at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymer goat anti- rabbit/mouse secondary antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Placental tissue</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#160;for FRB positive control</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an immunohistopathologic study to profile the folate receptor beta macrophage and vascular immune microenvironment in giant cell arteritis

Arterite de células gigantes (GCA) é uma doença crónica, imune-mediada das artérias de tamanhos médio para grande afeta adultos mais velhos. GCA manifestos com artrite e oclusivos sintomas de dores de cabeça, derrame ou perda de visão. Macrófagos e linfócitos T-helper infiltrar a parede vascular e produzem uma resposta pro-inflamatórios que levam a lesão vascular e isquemia. Até à data, não há nenhum biomarcador de GCA que pode monitorar a resposta terapêutica guia e atividade de doença.
Beta de receptor de folato (FRB) é uma proteína de glicosilfostidilinosiol que está ancorada na membrana celular e normalmente expresso na linhagem mielomonocítica e na maioria das células de leucemia mieloide, bem como no tumor e macrófagos sinoviais reumatoides, onde sua expressão se correlaciona com a severidade da doença. A capacidade de FRB vincular compostos de ácido fólico, ácido fólico-conjugados e drogas antifolate tornou um alvo druggable na pesquisa de doenças inflamatórias e câncer. Este relatório descreve os métodos de histopatológico e imuno-histoquímicos utilizados para avaliar a expressão e a distribuição de FRB em relação GCAimmunopathology.
Biópsias de artéria temporal fixada em formol e parafina do GCA e controles normais foram coradas com hematoxilina e eosina, para rever a histologia do tecido e identificar características patognomônicas. Imuno-histoquímica foi usado para detectar a expressão FRB, CD68 e CD3. Uma análise microscópica foi realizada para quantificar o número de células coradas positivamente em 10 seções selecionadas do elevado-poder-campo e seus respectivos locais na parede arterial.
Inflamação Lymphohistiocytic (LH) acompanhado por hiperplasia da íntima e lâmina elástica interrompida foi vista em GCA com nenhum encontrado nos controles. O infiltrado de LH foi composto de aproximadamente 60% macrófagos linfócitos e 40%. FRB expressão era restrito aos macrófagos, composto por 31% da população de macrófagos CD68 + total e localizado para a mídia e adventícia. Não FRB foi visto em controles.
Este protocolo demonstrou um padrão distinto de numérico e espacial do macrófago FRB em relação o microambiente imune vascular em GCA.

Achados histopatológicos
A H & E manchas em anatomia arterial normal de espécimes normal demonstrada com células endoteliais na túnica íntima, células musculares lisas da túnica média, e uma matriz de colagénio heterogêneo incluem fibroblastos e vasos alimentador chamado vasa vasorum no adventitia túnica. Não há nenhum infiltrado inflamatório identificado. Artérias temporais positivas de GCA demon...

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An Immunohistopathologic Study to Profile the Folate Receptor Beta Macrophage and Vascular Immune Microenvironment in Giant Cell Arteritis

O protocolo ilustra o uso do exame histopatológico e imuno-histoquímica para perfil o macrófago de beta de receptor de folato e sua relação com a célula total imune infiltrar-se na biópsia da artéria temporal na arterite de células gigantes.

Um estudo de Immunohistopathologic de perfil o folato receptores Beta macrófago e Vascular microambiente imune na arterite de células gigantes

Giant cell arteritis (GCA) is a chronic immune-mediated disease of medium-to-large sized arteries that affects older adults. GCA manifests with arthritis ...

Este protocolo imunohistoquímico e histopatológico pode ser usado para examinar o receptor beta, que é uma proteína candidata com potencial valor prognóstico e terapêutico ao microambiente vascular em arterite celular gigante. Este protocolo é testado por tempo e amplamente empregado e pode ser usado para explorar os atributos beta do receptor de folato em tecidos da artéria temporal, mesmo após o armazenamento a longo prazo. Para adquirir seções de tecido, use um microtome para cortar de quatro a cinco micrômetros de seções de espessura de artérias temporais incorporadas à parafina, flutuando cada seção em um banho de água de 40 graus Celsius à medida que são obtidos, para remover rugas.Use slides de microscópio de vidro para capturar três seções por slide, e aqueça os slides em uma placa de aquecimento, em um forno de 60 graus Celsius por 60 minutos. Quando as seções tiverem aderido aos slides, coloque os slides em um rack vertical para secar a 37 graus celsius por 24 horas. No dia seguinte, transfira os slides para um recipiente de slides para armazenamento a quatro graus Celsius por pelo menos 12 horas.Em seguida, a carga desliza em um rack de slides e hidrata os tecidos com duas imersões de cinco minutos, 100% xileno e uma série de imersão de etanol descendente de cinco minutos por concentração, com 10 segundos de agitação a cada 30 segundos. Após a imersão de 70% de etanol, enxágue os slides duas vezes em água duplamente destilada por cinco minutos, com 10 segundos de agitação a cada 30 segundos. Para recuperação de antígeno, transfira o rack para um recipiente de vidro com 200 microliters de 95 graus Celsius, 10 mililitros por litro de tampão citrato por 30 minutos.No final da incubação, deixe os slides esfriarem até a temperatura ambiente por 20 minutos antes de enxaguar com água corrente por cinco minutos. Para remover a atividade peroxidase endógena, primeiro use um marcador hidrofóbico para desenhar um círculo em torno de cada amostra de tecido, antes de incubar as amostras em 200 microliters de peróxido de hidrogênio de 3% por 10 minutos, seguido por 3 lavagens em 200 micoliters de solução salina tris-tamponada, ou TBSS, por lavagem. Após a última lavagem, debocoe cada slide suavemente para remover qualquer excesso de tampão e adicione 200 microliters do coquetel de anticorpos primário de interesse e um deslizamento de cobertura em cada slide para uma incubação de uma hora em uma câmara úmida à temperatura ambiente.No final da incubação, descarte os deslizamentos de cobertura e enxágue os slides com três lavagens de dois minutos em TBSS frescos. Depois de remover o buffer em excesso, adicione 200 microliters de uma solução de anticorpos secundários biotiningadas apropriada e um deslizamento de cobertura para cada slide para uma incubação de 45 minutos na câmara úmida à temperatura ambiente. Depois de descartar os deslizamentos de cobertura, enxágue os slides com TBSS como demonstrado.Remova qualquer excesso de buffer. E rotule as seções com 200 microliters de tampão de substrato DAB por 10 minutos em temperatura ambiente. No final da incubação, lave os slides com TBSS e água da torneira por 10 minutos, antes de contra-atacar com hematoxilina por três minutos.Em seguida, adicione 70 microliters de um meio de montagem apropriado a cada slide e lentamente coloque uma tampa de vidro no meio de montagem para evitar a criação de bolhas à medida que o deslizamento da tampa é abaixado no lugar. Para análise histopatológica, coloque o slide no estágio de um microscópio leve e avalie a arquitetura vascular da primeira seção tecidual. Em seguida, quantifique o número de macrófagos em relação ao número de linfócitos por seção.Para análise imunohistoquímica, examine o padrão de coloração beta do receptor de folato em cada seção de tecido e quantifique o número de células beta positivas do receptor de folato, CD68 positivo e CD3 em 10 campos de alta potência selecionados aleatoriamente por seção. A coloração de hematoxilina e eosina em espécimes normais revela uma anatomia arterial normal, com células endoteliais na tunica intima, células musculares lisas na mídia tunica, e uma matriz de colágeno heterogênea, que incluem fibroblastos e vasos alimentador chamados vasa vasorum na tunica adventitia. Artérias temporais positivas da arterite celular gigante demonstram uma inflamação moderada a grave, com agregados e macrófagos, ou histiocitos, linfócitos, células plasmáticas ocasionais e células gigantes multi-nucleadas.O estreitamento luminal também é notado, e acompanhado de espessamento intimal e uma interrupção de 90% da lâmina elástica interna. Linfócitos positivos CD3 e macrófagos positivos CD68 também estão presentes em todas as amostras positivas de arterite celular gigante, com padrões de coloração semelhantes observados em todas as biópsias. A coloração para o receptor de folato beta é restrita a macrófagos e células gigantes multi-nucleadas que preferencialmente localizam para a adventitia e mídia.Notavelmente, o receptor beta do folato compreendeu aproximadamente 30% do total de macrófagos. A biópsia da artéria temporal processando, cortando e desapóxing requerem destreza cuidadosa para realizar etapas subsequentes. A interpretação do slide requer a experiência de um patologista cardiovascular experiente.Lembre os espectadores a usar em contato e precauções respiratórias, como luvas e capuzes ventilados, ao manusear espécimes e os reagentes.

Research

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