Name: an immunohistopathologic study to profile the folate receptor beta macrophage and vascular immune microenvironment in giant cell arteritis
Uploaded: 2019-02-08T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Immunohistopathologic Study to Profile the Folate Receptor Beta Macrophage and Vascular Immune Microenvironment in Giant Cell Arteritis at JoVE.com

Эта работа стала возможной благодаря поддержке д-р Дуглас лестницы, Марианна Klinger, Энн Бенко, Отдел ревматологии/Департамента медицины и молекулярной и гистопатологические Core лаборатории, Пенн государственного университета колледж медицины, Херши PA.

Все методы, описанные были утверждены Пенн государства институциональных Наблюдательный Совет.
1. гистопатологические подготовка и обработка после получения биопсии височной артерии
Примечание: Биопсии височной артерии (вкладка) проводится под ...

<ol>
	<li>Klippel, J. H., Stone, J. H., White, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Primer on the rheumatic diseases. , (2008).</li><li>Weyand, C. M., Goronzy, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+mechanisms+in+medium+and+large-vessel+vasculitis.">Immune mechanisms in medium and large-vessel vasculitis.</a> Nature Reviews Rheumatol. 9 (12), 731-740 (2013).</li><li>Weyand, C. M., Liao, Y. J., Goronzy, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunopathology+of+giant+cell+arteritis:+diagnostic+and+therapeutic+implications.">The immunopathology of giant cell arteritis: diagnostic and therapeutic implications.</a> Journal of Neuro-ophthalmology. 32 (3), 259-265 (2012).</li><li>Deng, J., Younge, B., Olshen, R., Goronzy, J., Weyand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th17+and+Th1+T-cell+responses+in+giant+cell+arteritis.">Th17 and Th1 T-cell responses in giant cell arteritis.</a> Circulation. 121, 906-915 (2010).</li><li>Mahr, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjunctive+methotrexate+for+treatment+of+giant+cell+arteritis:+an+individual+patient+data+meta-analysis.">Adjunctive methotrexate for treatment of giant cell arteritis: an individual patient data meta-analysis.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 56 (8), 2789-2797 (2007).</li><li>Hoffman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicenter,+randomized,+double-blind,+placebo-controlled+trial+of+adjuvant+methotrexate+treatment+for+giant+cell+arteritis.">A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled trial of adjuvant methotrexate treatment for giant cell arteritis.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 46 (5), 1309-1318 (2002).</li><li>Stone, J. H., Klearman, M., Collinson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trial+of+Tocilizumab+in+Giant-Cell+Arteritis.">Trial of Tocilizumab in Giant-Cell Arteritis.</a> New England Journal of Medicine. 377 (15), 1494-1495 (2017).</li><li>Milman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tocilizumab+increased+sustained+glucocorticoid-free+remission+from+giant+cell+arteritis.">Tocilizumab increased sustained glucocorticoid-free remission from giant cell arteritis.</a> Annals of Internal Medicine. 167 (12), JC63 (2017).</li><li>Xia, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+folate+receptor+is+induced+during+macrophage+activation+and+can+be+used+to+target+drugs+to+activated+macrophages.">A functional folate receptor is induced during macrophage activation and can be used to target drugs to activated macrophages.</a> Blood. 113 (2), 438-446 (2009).</li><li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folate+receptor-beta+constitutes+a+marker+for+human+proinflammatory+monocytes.">Folate receptor-beta constitutes a marker for human proinflammatory monocytes.</a> Journal of Leukocyte Biology. 96 (4), 563-570 (2014).</li><li>Salazar, M. D., Ratnam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+folate+receptor:+what+does+it+promise+in+tissue-targeted+therapeutics.">The folate receptor: what does it promise in tissue-targeted therapeutics.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 26 (1), 141-152 (2007).</li><li>Low, P. S., Henne, W. A., Doorneweerd, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+development+of+folic-acid-based+receptor+targeting+for+imaging+and+therapy+of+cancer+and+inflammatory+diseases.">Discovery and development of folic-acid-based receptor targeting for imaging and therapy of cancer and inflammatory diseases.</a> Accounts of Chemical Research. 41 (1), 120-129 (2008).</li><li>Puig-Kroger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folate+receptor+beta+is+expressed+by+tumor-associated+macrophages+and+constitutes+a+marker+for+M2+anti-inflammatory/regulatory+macrophages.">Folate receptor beta is expressed by tumor-associated macrophages and constitutes a marker for M2 anti-inflammatory/regulatory macrophages.</a> Cancer Research. 69 (24), 9395-9403 (2009).</li><li>Nakashima-Matsushita, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+expression+of+folate+receptor+beta+and+its+possible+role+in+methotrexate+transport+in+synovial+macrophages+from+patients+with+rheumatoid+arthritis.">Selective expression of folate receptor beta and its possible role in methotrexate transport in synovial macrophages from patients with rheumatoid arthritis.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 42 (8), 1609-1616 (1999).</li><li>vander Heijden, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folate+receptor+beta+as+a+potential+delivery+route+for+novel+folate+antagonists+to+macrophages+in+the+synovial+tissue+of+rheumatoid+arthritis+patients.">Folate receptor beta as a potential delivery route for novel folate antagonists to macrophages in the synovial tissue of rheumatoid arthritis patients.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 60 (1), 12-21 (2009).</li><li>Jansen, G., Peters, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+in+folate+receptors+and+transporters:+implications+for+disease+and+treatment+of+immune+diseases+and+cancer.">Novel insights in folate receptors and transporters: implications for disease and treatment of immune diseases and cancer.</a> Pteridines. 26 (2), 41-53 (2015).</li><li>Albano-Aluquin, S., Malysz, J., Aluquin, V. R., Ratnam, M., Olsen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunohistochemical+analysis+of+folate+receptor+beta+expression+and+distribution+in+giant+cell+arteritis+-+a+pilot+study.">An immunohistochemical analysis of folate receptor beta expression and distribution in giant cell arteritis - a pilot study.</a> American Journal of Clinical and Experimental Immunology. 6 (6), 107-114 (2017).</li><li>Ross, J. F., Chaudhuri, P. K., Ratnam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+folate+receptor+isoforms+in+normal+and+malignant+tissues+in+vivo+and+in+established+cell+lines.+Physiologic+and+clinical+implications.">Differential regulation of folate receptor isoforms in normal and malignant tissues in vivo and in established cell lines. Physiologic and clinical implications.</a> Cancer. 73 (9), 2432-2443 (1994).</li><li>Reiner, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+molecular+biology.+Macrophages+and+dendritic+cells.+Methods+and+protocols.+Preface.">Methods in molecular biology. Macrophages and dendritic cells. Methods and protocols. Preface.</a> Methods in Molecular Biology. 531, (2009).</li><li>Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunofluorescence+labelling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+tissue.">Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BMC Cell Biology. 9, 13 (2008).</li><li>Pawlina, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histology: A text and atlas with correlated cell and molecular biology. , (2016).</li><li>Kumar, V., Abbas, A., Robbins Aster, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Robbins and Cotran pathologic basis of disease. , (2015).</li><li>Dabbs, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Diagnostic immunohistochemistry. , (2019).</li><li>Ross, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folate+receptor+type+beta+is+a+neutrophilic+lineage+marker+and+is+differentially+expressed+in+myeloid+leukemia.">Folate receptor type beta is a neutrophilic lineage marker and is differentially expressed in myeloid leukemia.</a> Cancer. 85 (2), 348-357 (1999).</li><li>Holzapfel, G. A., Fratzl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+in+arterial+walls:+biomechanical+aspects.">Collagen in arterial walls: biomechanical aspects.</a> Collagen. Structure and Mechanics. , 285-324 (2008).</li><li>Sultan, H., Smith, S. V., Lee, A. G., Chevez-Barrios, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathologic+Markers+Determining+Prognosis+in+Patients+with+Treated+or+Healing+Giant+Cell+Arteritis.">Pathologic Markers Determining Prognosis in Patients with Treated or Healing Giant Cell Arteritis.</a> American Journal of Ophthalmology. , (2018).</li></ol>

ГКА является наиболее распространенным васкулит у взрослых, и его патологического hallmark является примером мощное сочетание вспомогательные Т-лимфоцитов и активации макрофагов, которые также могут быть найдены в других гранулематозный заболевания или специализирующемуся как саркоид?...

Гигантоклеточная артериит (ВКА) является воспалительным заболеванием средне крупных артерий, ориентация аорты и ее ветвей и затрагивает пожилых людей. Она представляет с умеренной до тяжелой ишемических осложнений, таких как головные боли, боли в челюсти, потеря зрения, инсульта и тканей гангрены. Диагноз подтверждается высоким воспалительные маркеры как скорость оседания эритроцитов (СОЭ) и собственный гистопатологические картины на височной артерии биопсии (вкладка)1. ГКА является наиболее распространенным взрослых васкулит, и доступность височной артерии, полученные для диагностики представляет преимущество над другими специализирующемуся, таким образом позволяя один для изучения его патогенез более легко. Типичные результаты на закладке включают инфильтрата гистиоциты/макрофагов и Т-лимфоцитов, нашли на всех уровнях сосудистой интимы туника, СМИ и адвентиции с параллельной разрушения упругой пластинки, которая обычно отделяет эти 2отсеках. Текущий доказательства свидетельствуют, что ВКА включает неизвестный антиген, который активирует дендритные клетки в адвентиции сосудов, следуют найма помощника клетки T (Th), специально Th1 и Th17 подтипы, которые выделяют интерлейкина-17 и Интерферон гамма (МГС) соответственно. ИФГ затем новобранцев и активирует макрофаги производить цитокинов и протеаз. К ним относятся провоспалительных цитокинов; включая Ил-12, которая взаимно активирует клетки Th1, обеспечивая тем самым положительной обратной связью; фактор некроза опухоли и интерлейкина-6, вызывающие артрит и металлопротеаз и лихорадки, которые повреждают упругой пластинки. Глюкокортикоидов (GC), которые являются стандартной терапии хронической, частично управлять цитокина пути ослабления Th17/Ил-17, но не Th1/IFG руку иммунный ответ3,4. К сожалению прекращение GC приводит к рецидиву болезни. В качестве альтернативного механизма метотрексат был многоцелевых ГЦА лечения, но желаемого клинические конечные точки не были достигнуты последовательно, хотя более чувствительных биомаркеров не были использованы для терапевтического мониторинга5,6 . В 2017 году интерлейкин 6 окон, tocilizumab, был одобрен для лечения вка, как доказано эффективно болезнями и стероидных щадящие эффекты7,8.
На сегодняшний день, есть нет хороших biomarkers для ЗКО. В результате трудно контролировать активность заболевания и титровать дозы доступных препаратов, чтобы избежать неблагоприятных последствий и уменьшить бремя расходов для общества. Таким образом важно, чтобы искать кандидата биомаркеров, что коррелирует с активностью болезни, обеспечивают новые идеи по патогенезу и помощи в терапевтических решений.
Dysregulation активация макрофагов является решающим фактором в патогенезе ЗКО. Таким образом могут быть эффективным средством лечения вка, избирательного отношения к Активированные макрофаги. Фолиевая кислота рецепторов бета (FRB) является glycosyl фосфатидилинозитол гликопротеин, которая зиждется на клеточной мембране в нормальной миеломоноцитная клеток, клеток миелоидной лейкемии и активация макрофагов. Его лиганда, фолиевая кислота, является одним из важнейших витаминов в сокращенной форме, которая позволяет клеточной ДНК синтеза, метилирование и ремонт9. FRB выражение индуцируется в аутоиммунных заболеваний и канцерогенеза. Его выражение ограничен поверхности моноциты или про воспалительных M1 макрофагов в ревматоидный артрит, или противовоспалительные м2 макрофагов в твердые органов и миелоидных злокачественных10,11,12 , 13. в дополнение к своей потенциальной роли в качестве биомаркера активированных макрофагов, FRB можно включить селективного наркотиков транспорта через многоступенчатый процесс, который начинается с привязкой рецепторов фолиевой кислоты, антифолаты или фолиевой кислоты конъюгированных наркотиков в ячейке поверхности, следуют интернализации, выпуска и окончательной доставки желаемого наркотиков внутренних ячейки машин12,14,15,16. В отличие от FRB выражена в раковых клеток и активации макрофагов, FRB, выраженные в нормальные гемопоэтические клетки способны связывать фолатов, обеспечивая тем самым, что FRB/фолиевой кислоты опосредованной лекарств ограничен FRB-положительных воспалительных или раковые клетки.
В нашем предыдущем исследовании мы показали в первый раз, что FRB выражается в ЗКО макрофагов и его выражение коррелирует с CD68 + и эндотелина рецептора бета макрофаги, которые способствуют ГЦА патогенеза17. В настоящем докладе мы описываем гистопатологические и Иммуногистохимические методы используются для оценки FRB макрофагов и анализируется общая лимфоцитов и макрофагов рассчитывает получить представление о FRB позиции в ЗКО сосудистой ландшафт.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Reichert-Jung</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plain and frosted microscope slides and cover slips</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical rack</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Olympus BX60&#160; microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone in distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>concentrations 100%, 90%, 70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered saline solution (TBS)&#160;</td>
			<td>Dako Wash BufferS3006</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% hydrogen peroxide in TBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaminobenzidine (DAB)</td>
			<td>Sigma Fast Tablet set</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical Permount&#160; Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>SP-15-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harleco Gill&#39;s III Hematoxylin</td>
			<td>Fiisher Scientific 23-750-019</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harleco Eosin Y 1% Alcoholic Stock Solution</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>23-749-977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM citric acid monohydrate (pH 6.0)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-folate receptor beta&#160;</td>
			<td>Manohar Ratnam</td>
			<td></td>
			<td>optimized at 1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-human CD68</td>
			<td>Dako&#160;</td>
			<td>M071801</td>
			<td>optimized at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-CD3</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>A0452</td>
			<td>optimized at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymer goat anti- rabbit/mouse secondary antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Placental tissue</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#160;for FRB positive control</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an immunohistopathologic study to profile the folate receptor beta macrophage and vascular immune microenvironment in giant cell arteritis

Гигантоклеточная артериит (ГКА) является хронической болезнью, связанный иммунной опосредованного артерий среднего и большого размера, затрагивает пожилых людей. GCA манифесты с артритом и окклюзионной симптомы головной боли, инсульта или потери зрения. Макрофаги и лимфоциты Т-хелперами проникнуть сосудистой стенки и производят про воспалительной реакции, которые ведут к судну ущерб и ишемии. На сегодняшний день, есть нет ГЦА биомаркеров, который может контролировать болезнь деятельность и руководство лечебных ответ.
Фолиевая кислота рецепторов бета (FRB) является glycosylphosphatidylinositol белок, который является якорь на клеточные мембраны и обычно выражается в линии миеломоноцитная и в большинстве клеток миелоидной лейкемии как опухоли и ревматоидные синовиальной макрофагов, где его выражение коррелирует с тяжести заболевания. FRB возможность привязать фолиевой кислоты соединений, фолиевой кислоты конъюгатов и antifolate наркотиков сделала его druggable цель в рак и воспалительные болезни исследований. В настоящем докладе описываются гистопатологические и иммуногистохимических методов, используемых для оценки выражения и распределение FRB по отношению к GCAimmunopathology.
Формалин исправлена и парафин врезанных височной артерии биопсий ГКА и нормального управления окрашивали гематоксилином и эозином пересмотреть Гистология ткани и определить патогномоничных функции. Иммуногистохимия была использована для выявления FRB, CD68 и CD3 выражение. Микроскопический анализ проводился для количественного определения количество положительно окрашенных клеток на 10 выбранных секций высокой мощности поля и их местоположения в стенке артерий.
Воспаление Lymphohistiocytic (ЛГ) в сопровождении гиперплазия интимы и нарушается упругой пластинки был замечен в ЗКО с ничего не найдено в элементах управления. LH инфильтрат состоит из примерно 60% лимфоцитов и 40% макрофагов. FRB выражение ограничивался макрофагов, состоящий из 31% всего населения CD68 + макрофагов и локализованные для средств массовой информации и адвентиции. Не FRB был замечен в элементах управления.
Этот протокол продемонстрировал шаблон различных численных и пространственной FRB макрофага по отношению к сосудистой иммунной микроокружения в ЗКО.

Гистопатологические выводы
H & E пятна в нормальные образцы показали нормальная анатомия артерий с эндотелиальных клеток интимы туника, гладких мышечных клеток в СМИ туника, и разнородные коллагеновой матрицы, которые включаю...

Watch this Scientific Journal Video about An Immunohistopathologic Study to Profile the Folate Receptor Beta Macrophage and Vascular Immune Microenvironment in Giant Cell Arteritis at JoVE.com

An Immunohistopathologic Study to Profile the Folate Receptor Beta Macrophage and Vascular Immune Microenvironment in Giant Cell Arteritis

Протокол иллюстрирует использование гистопатологические осмотра и иммуногистохимии профиль макрофагов бета рецепторов фолиевой кислоты и ее отношения с общей иммунных клеток проникнуть в биопсии височной артерии в гигантоклеточная артериальный.

Immunohistopathologic исследование фолиевая кислота рецепторов бета макрофагов и сосудистой иммунной микроокружения в гигантоклеточная артериальный профиля

Giant cell arteritis (GCA) is a chronic immune-mediated disease of medium-to-large sized arteries that affects older adults. GCA manifests with arthritis ...

Этот иммуногистохимический и гистопатологический протокол может быть использован для изучения бета-рецептора фолиевой кислоты, который является кандидатом белка с потенциальной прогностической и терапевтической ценностью для микроокноронирования сосудов при гигантском клеточном артериите. Этот протокол проверен временем и широко используется и может быть использован для изучения бета-атрибутов рецепторов фолиевой кислоты в тканях височной артерии, даже после длительного хранения. Чтобы приобрести секции тканей, используйте микротом, чтобы нарезать четыре-пять микрометров толщиной разделы парафин-встроенных височных артерий, плавающие каждый раздел в 40 градусов по Цельсию водяной бане, как они получены, чтобы удалить морщины.Используйте стеклянные слайды микроскопа, чтобы захватить три секции на слайд, и тепло слайды на греющим пластины, в 60 градусов по Цельсию духовке в течение 60 минут. Когда секции прилипли к слайдам, поместите слайды в вертикальную стойку для сушки при 37 градусах по Цельсию в течение 24 часов. На следующий день перенесите слайды в контейнер для хранения при четырех градусах по Цельсию в течение по крайней мере 12 часов.Затем нагрузка скользит в стойку слайда и увлажняет ткани двумя пятиминутными, 100%-ти ксилеными погружениями и нисходящей пятиминутной серией погружения этанола в концентрацию, с 10 секундами возбуждения каждые 30 секунд. После погружения 70%ethanol, промойте горки два раза в двойной дистиллированной воде в течение пяти минут, с 10 секундами возбуждения каждые 30 секунд. Для извлечения антигена перенесите стойку в стеклянный контейнер с 200 микролитров 95 градусов по Цельсию, 10 миллимолярной на литр цитрат буфера в течение 30 минут.В конце инкубации, дайте слайдам остыть до комнатной температуры в течение 20 минут, прежде чем полоскания с проточной водой в течение пяти минут. Чтобы удалить эндогенную активность пероксидазы, сначала используйте гидрофобный маркер, чтобы нарисовать круг вокруг каждого образца ткани, прежде чем инкубировать образцы в 200 микролитров 3%перекиси водорода в течение 10 минут, а затем 3 моет в 200 миколитеров трис-буферного солевого раствора, или TBSS, за стирку. После последней стирки, мазок каждый слайд осторожно, чтобы удалить излишки буфера и добавить 200 микролитров первичного антитела коктейль интерес и крышка скольжения на каждый слайд в течение одного часа инкубации во влажной камере при комнатной температуре.В конце инкубации отбросьте крышку скользит и промойте горки тремя двухминутными мойки в свежем TBSS. После удаления избыточного буфера добавьте 200 микролитров соответствующего биотинилированного вторичного раствора антител и крышку скольжения к каждому слайду для 45-минутной инкубации во влажной камере при комнатной температуре. После отбрасывания крышки скользит, промыть слайды с TBSS, как попродемонстрировано.Удалите лишний буфер. И обозначить секции 200 микролитров буфера субстрата DAB в течение 10 минут при комнатной температуре. В конце инкубации, мыть горки с TBSS и проточной водопроводной водой в течение 10 минут, прежде чем счетчики с гематоксилином в течение трех минут.Затем добавьте 70 микролитров соответствующей крепления среды к каждому слайду и медленно наконечник стеклянной крышкой полосы на монтажную среду, чтобы избежать создания пузырьков, как крышка скольжения опускается на место. Для гистопатологического анализа поместите слайд на стадию светового микроскопа и оцените сосудистую архитектуру первой секции тканей. Затем количественно количество макрофагов по отношению к количеству лимфоцитов на секцию.Для иммуногистохимического анализа изучите бета-окрашивание рецепторов фолата на каждом участке ткани и количественно оцените количество бета-позитива рецепторов фолата, CD68 положительных и CD3 положительных клеток в 10 случайно выбранных высокой мощности полей на секцию. Гематоксилин и эозин окрашивания в нормальных образцах показывает нормальную артериальную анатомию, с эндотелиальными клетками в индиме туники, гладкие мышечные клетки в средствах массовой информации туники, и неоднородной коллагеновой матрицы, которые включают фибробласты и фидеровые сосуды, называемые vasa vasorum в туника adventitia. Гигантский клеточный артерит положительные височные артерии демонстрируют умеренное и тяжелое воспаление, с агрегатами и макрофагами, или гистоциты, лимфоциты, случайные плазменные клетки, и многоядерные гигантские клетки.Также отмечается сужение Luminal, сопровождаемое интимальным утолщением и 90%-ным нарушением внутренней эластичной ламины. CD3 положительные лимфоциты и CD68 положительные макрофаги также присутствуют во всех гигантских клеточных артериит положительных образцов, с аналогичными окрашивания моделей наблюдается во всех биопсий. Окрашивание бета-рецептора фолиевой кислоты ограничивается макрофагами и многоядерными гигантскими клетками, которые преимущественно локализуются для адвентитии и средств массовой информации.Примечательно, что бета-версия рецепторов фолата составила около 30% от общего объема макрофагов. Обработка биопсии височной артерии, резка и роса требуют тщательной ловкости для того, чтобы выполнить последующие шаги. Слайд интерпретация требует опыта опытного сердечно-сосудистого патологоанатома.Напомните зрителям использовать контактные и дыхательные меры предосторожности, такие как перчатки и вентилируемые капюшоны, при обращении с образцами и реагентами.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Seven Steps to Stellate Cells

Семь шагов к звездчатых клеток

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Введение в паразитических наездников<em&gt; Drosophila</em&gt; И противопаразитарной иммунного ответа

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

<em&gt; В пробирке</em&gt; Модель для изучения гетерогенности человека дифференциации макрофагов и поляризация

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

В пробирке и в естественных моделью для изучения бактериальной адгезии к стенке сосуда в проточных условиях

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Нейтрофильная Выделение и анализ для определения их роли в клеточной лимфомы чувствительность к терапевтических агентов

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Разработка и идентификация романа субпопуляции человеческого нейтрофилами производного Giant фагоцитов<em&gt; In Vitro</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Fabricating Optical-quality Glass Surfaces to Study Macrophage Fusion

Изготовления поверхностей оптическое качество стекла для изучения макрофагов Fusion

Visualizing the formation of multinucleated giant cells (MGCs) from living specimens has been challenging due to the fact that most live imaging ...

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

Оценка клеточный иммунный ответ плодовой мушки Drosophila melanogaster, используя Assay фагоцитоза в естественных условиях

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are ...