Name: an immunohistopathologic study to profile the folate receptor beta macrophage and vascular immune microenvironment in giant cell arteritis
Uploaded: 2019-02-08T12:30:00
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Este trabajo fue posible gracias al apoyo del Dr. Douglas Stairs, Marianne Klinger, Ann Benko, la división de Reumatología del Departamento de medicina y la Molecular y laboratorio de base histopatológica, Penn estado Colegio de medicina de la Universidad, Hershey PA

Todos los métodos descritos fueron aprobados por la Junta de revisión institucional del estado de Penn.
1. histopatológico preparación y procesamiento después de obtener la biopsia de arteria Temporal
Nota: La biopsia de arteria temporal (ficha) se realiza bajo anestesia local y las condiciones de esterilidad por un cirujano certificado. Tras obtener quirúrgicamente una sección arterial de 3 cm en el lado más afectado, la muestra fijada en fo...

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GCA es la vasculitis más común en adultos, y su seña de identidad patológica ejemplifica una potente combinación de linfocitos del ayudante T y activa los macrófagos que se encuentran también en otras enfermedades granulomatosas o vasculopathies como sarcoidosis y polyangiitis granulomatosa2,3. En ACG, la arteria temporal proporciona una buena representación de una arteria de tamaño mediano a grande y la biopsia TA da una muestra de tamaño considerable ...

Arteritis de células gigantes (ACG) es una enfermedad inflamatoria de las arterias medianas a grandes, dirigidos a la aorta y sus ramas y que afectan a los adultos mayores. Presenta leves a severas complicaciones isquémicas tales como dolores de cabeza, dolor de mandíbula, pérdida de la visión, movimiento y tejidos gangrena. La diagnosis es confirmada por altos marcadores inflamatorios como tarifa de sedimentación de eritrocito (ESR) y un patrón histopatológico distinto en la biopsia (ficha) de arteria temporal1. GCA es la vasculitis más común de adultos, y la accesibilidad de la arteria temporal obtenida para diagnóstico presenta una ventaja sobre otros vasculopathies, así que permiten estudiar más fácilmente su patogenesia. Los resultados típicos en ficha incluyen un infiltrado de macrófagos/histiocitos y linfocitos T encontrados todas las capas vasculares de la intima del tunica, media y adventicia con simultánea destrucción de la lámina elástica que normalmente separa estos compartimientos de2. La evidencia actual demuestra que GCA implica un antígeno desconocido que activa las células dendríticas en la adventicia vascular, seguido por la contratación de ayudante células de T (Th), subtipos específicamente Th1 y Th17 que secretan interleucina-17 y interferón-gamma (IFG) respectivamente. IFG y recluta y activa los macrófagos para producir citocinas y proteasas. Estos incluyen las citoquinas pro inflamatorias; incluyendo la IL-12, que recíprocamente activa Th1 células proporcionando así un bucle de retroalimentación positiva; factor de necrosis tumoral y la interleucina-6, que causa la artritis y fiebres y metaloproteasas que dañan la lámina elástica. Glucocorticoides (GC), que constituyen la terapia crónica estándar, controlan parcialmente las vías del cytokine atenuando la Th17/IL-17, pero no el brazo Th1/IFG de la respuesta inmune3,4. Desafortunadamente, discontinuación de la GC resulta en recaída de la enfermedad. Como una modalidad alternativa, metotrexato ha sido repurposed para el tratamiento de la GCA y los puntos finales clínicos deseados no siempre lograron aunque biomarcadores más sensibles no han sido utilizados para el monitoreo terapéutico5,6 . En 2017, el bloqueador de interleucina 6, tocilizumab, era aprobado para el tratamiento de ACG como demostró con eficacia control de la enfermedad y esteroides sparing efectos7,8.
Hasta la fecha, no hay ninguna buena biomarcadores para GCA. Como resultado, es difícil supervisar actividad de la enfermedad y valorar la dosis de fármacos disponibles para evitar los efectos adversos y reducir la carga de costo a la sociedad. Por lo tanto, es imperativo buscar un biomarcador de candidato que se correlaciona con la actividad de la enfermedad, proporcionar nuevos conocimientos sobre patogénesis y ayuda en las decisiones terapéuticas.
La desregulación de la activación de los macrófagos es un factor crítico en la patogénesis de la GCA. Así, puede ser un medio eficaz de tratar la GCA la focalización selectiva de macrófagos activados. La beta del receptor del folato (FRB) es una glicoproteína de glicosil-fosfatidilinositol que está anclada en la membrana de la célula expresados en células myelomonocytic normal, las células de la leucemia mieloide y activa los macrófagos. Su ligando, el ácido fólico es una vitamina esencial en su forma reducida, que permite que celular DNA síntesis, reparación y metilación del9. FRB expresión es inducida en la enfermedad autoinmune y durante la carcinogénesis. Su expresión se limita a la superficie de monocitos o macrófagos pro-inflamatorias de M1 en la artritis reumatoide o a antiinflamatorios macrófagos M2 en órganos sólidos y malignidades mieloides10,11,12 , 13. Además de su papel potencial como un biomarcador de macrófagos activados, la unidad FRB puede habilitar el transporte de droga selectiva a través de un proceso de múltiples paso que comienza con el atascamiento del receptor para ácido fólico, antifolates o medicamentos conjugados con ácido fólico en la célula superficie, seguida de la internalización, la liberación y la eventual entrega de droga deseada a la interna de la célula maquinaria12,14,15,16. En contraste con FRB expresado en las células cancerosas y activa macrófagos, FRB expresado en las células hematopoyéticas normales es incapaz de enlazar folatos garantizando que FRB/folato-mediado entrega de la droga se limita a FRB-positiva inflamatoria o las células cancerosas.
En nuestro estudio anterior, demostramos por primera vez que FRB se expresa en los macrófagos de la GCA y su expresión correlaciona con CD68 + y endotelina macrófagos de receptores beta, que contribuyen a la patogénesis de GCA17. En este informe, describimos el histopatológico y métodos inmunohistoquímicos utilizan para evaluar el macrófago de la FRB y analizan el total de linfocitos y macrófagos cuenta para ganar la penetración en la posición de la FRB en el paisaje vascular GCA.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Reichert-Jung</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plain and frosted microscope slides and cover slips</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical rack</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Olympus BX60&#160; microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone in distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>concentrations 100%, 90%, 70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered saline solution (TBS)&#160;</td>
			<td>Dako Wash BufferS3006</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% hydrogen peroxide in TBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaminobenzidine (DAB)</td>
			<td>Sigma Fast Tablet set</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical Permount&#160; Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>SP-15-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harleco Gill&#39;s III Hematoxylin</td>
			<td>Fiisher Scientific 23-750-019</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harleco Eosin Y 1% Alcoholic Stock Solution</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>23-749-977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM citric acid monohydrate (pH 6.0)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-folate receptor beta&#160;</td>
			<td>Manohar Ratnam</td>
			<td></td>
			<td>optimized at 1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-human CD68</td>
			<td>Dako&#160;</td>
			<td>M071801</td>
			<td>optimized at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-CD3</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>A0452</td>
			<td>optimized at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymer goat anti- rabbit/mouse secondary antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Placental tissue</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#160;for FRB positive control</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an immunohistopathologic study to profile the folate receptor beta macrophage and vascular immune microenvironment in giant cell arteritis

Arteritis de células gigantes (ACG) es una mediada inmune enfermedad crónica de las arterias de tamaño mediano a grande que afecta a los adultos mayores. GCA se manifiesta con síntomas oclusivos de dolores de cabeza y artritis, movimiento o pérdida de la visión. Linfocitos T-helper y macrófagos infiltran la pared vascular y producen una respuesta pro-inflamatorias que conducen a daño a los vasos e isquemia. Hasta la fecha, no hay ningún biomarcador GCA que puede monitorear la respuesta terapéutica guía y actividad de la enfermedad.
Beta del receptor de folato (FRB) es una proteína glicosilfosfatidilinositol anclada en las membranas celulares y normalmente se expresa en la estirpe mielomonocítica y en la mayoría de las células de la leucemia mieloide, así como en el tumor y los macrófagos sinoviales reumatoides, donde su expresión se correlaciona con la severidad de la enfermedad. La capacidad de FRB compuestos de ácido fólico, ácido fólico-conjugados y fármacos antifolatos ha hecho un blanco druggable en cáncer y la investigación de la enfermedad inflamatoria. Este informe describe los métodos histopatológicos e immunohistochemical para evaluar la expresión y distribución de FRB en lo referente a GCAimmunopathology.
Las biopsias de arteria temporal fijados con formol y embebido en parafina de ACG y controles normales fueron teñidas con hematoxilina y eosina para revisar la histología del tejido e identificar características patognomónicas. Immunohistochemistry fue utilizado para detectar expresión de FRB, CD68 y CD3. Se realizó un análisis microscópico para cuantificar el número de células teñidas positivamente en 10 secciones de campo de alta potencia seleccionadas y sus respectivas ubicaciones en la pared arterial.
Inflamación lymphohistiocytic (LH) acompañada de hiperplasia intimal y lámina elástica interrumpido fue visto en GCA con ninguno en los controles. El infiltrado de LH fue compuesto de aproximadamente 60% linfocitos y 40% macrófagos. Expresión de FRB se restringió a los macrófagos, que comprende el 31% de la población de macrófagos CD68 + total y localizada a la media y adventicia. No FRB se observó en los controles.
Este protocolo demostró un patrón numérico y espacial distinto del macrófago FRB en relación con el microambiente inmunológico vascular en ACG.

Resultados histopatológicos
La H & E mancha en anatomía arterial normal demostrada muestras normales con células endoteliales en la intima del tunica, células de músculo liso en la túnica media, y una matriz de colágeno heterogéneos que incluyen fibroblastos y alimentador vasos llamados vasa vasorum en el adventitia de tunica. Hay no hay infiltrado inflamatorio identificado. Arterias temporales positivas...

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An Immunohistopathologic Study to Profile the Folate Receptor Beta Macrophage and Vascular Immune Microenvironment in Giant Cell Arteritis

El protocolo muestra el uso de la examinación histopatológica e inmunohistoquímica al perfil el macrófago de beta del receptor de folato y su relación con el total de la célula inmune infiltran en las biopsias de arteria temporal en la arteritis de células gigantes.

Un estudio de Immunohistopathologic a perfil el folato del Receptor Beta macrófago y microambiente inmunológico Vascular en Arteritis de células gigantes

Giant cell arteritis (GCA) is a chronic immune-mediated disease of medium-to-large sized arteries that affects older adults. GCA manifests with arthritis ...

Este protocolo inmunohistoquímico e histopatológico se puede utilizar para examinar el receptor de folato beta, que es una proteína candidata con potencial pronóstico y valor terapéutico para el microambiente vascular en la arteritis de células gigantes. Este protocolo es probado en el tiempo y ampliamente empleado y se puede utilizar para explorar los atributos beta del receptor de folato en los tejidos de las arterias temporales, incluso después de almacenamiento a largo plazo. Para adquirir secciones de tejido, utilice un microtoma para cortar secciones de cuatro a cinco micrómetros de espesor de las arterias temporales incrustadas en parafina, flotando cada sección en un baño de agua de 40 grados Celsius a medida que se obtienen, para eliminar las arrugas.Utilice diapositivas de microscopio de vidrio para capturar tres secciones por diapositiva, y caliente las diapositivas en una placa de calentamiento, en un horno Celsius de 60 grados durante 60 minutos. Cuando las secciones se hayan adherido a los portaobjetos, coloque los portaobjetos en un bastidor vertical para secar a 37 grados centígrados durante 24 horas. Al día siguiente, transfiera las diapositivas a un contenedor de diapositivas para almacenarlos a cuatro grados centígrados durante al menos 12 horas.A continuación, cargue diapositivas en un portaobjetos e hidrate los tejidos con dos inmersiones de cinco minutos, 100% de xileno y una serie de inmersión de etanol descendente de cinco minutos por concentración, con 10 segundos de agitación cada 30 segundos. Después de la inmersión del 70%etanol, enjuague los portaobjetos dos veces en agua doble destilada durante cinco minutos, con 10 segundos de agitación cada 30 segundos. Para la recuperación de antígenos, transfiera el bastidor a un recipiente de vidrio con 200 microlitros de 95 grados Celsius, 10 mililitros por litro de tampón de citrato durante 30 minutos.Al final de la incubación, deje que los toboganes se enfríen a temperatura ambiente durante 20 minutos antes de enjuagar con agua corriente durante cinco minutos. Para eliminar la actividad peroxidasa endógena, utilice primero un marcador hidrófobo para dibujar un círculo alrededor de cada muestra de tejido, antes de incubar las muestras en 200 microlitros de 3%peróxido de hidrógeno durante 10 minutos, seguido de 3 lavados en 200 mifotes de solución salina tampón trised, o TBSS, por lavado. Después del último lavado, deslice suavemente cada diapositiva para eliminar cualquier exceso de tampón y agregue 200 microlitros del cóctel de anticuerpos primario de interés y un resbalón de cubierta a cada diapositiva para una incubación de una hora en una cámara húmeda a temperatura ambiente.Al final de la incubación, deseche los resbalones de la cubierta y enjuague los portaobjetos con tres lavados de dos minutos en TBSS fresco. Después de eliminar el exceso de tampón, añada 200 microlitros de una solución adecuada de anticuerpos secundarios biotinilados y un resbalón de cobertura en cada portaobjetos para una incubación de 45 minutos en la cámara húmeda a temperatura ambiente. Después de desechar los resbalones de la cubierta, enjuague los portaobjetos con TBSS como se ha demostrado.Elimine cualquier exceso de búfer. Y etiquete las secciones con 200 microlitros de tampón de sustrato DAB durante 10 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, lave los toboganes con TBSS y el agua corriente del grifo durante 10 minutos, antes de contramaner con hematoxilina durante tres minutos.A continuación, agregue 70 microlitros de un medio de montaje adecuado a cada diapositiva y entor volce lentamente una tira de cubierta de vidrio en el medio de montaje para evitar la creación de burbujas a medida que el resbalón de la cubierta se baja en su lugar. Para el análisis histopatológico, coloque la diapositiva en la etapa de un microscopio de luz y evalúe la arquitectura vascular de la primera sección tisular. A continuación, cuantificar el número de macrófagos en relación con el número de linfocitos por sección.Para el análisis inmunohistoquímico, examine el patrón de tinción beta del receptor de folato en cada sección del tejido y cuantifique el número de células beta positivas del receptor de folato, CD68 positivas y CD3 en 10 campos de alta potencia seleccionados aleatoriamente por sección. La tinción de hematoxilina y eosina en muestras normales revela una anatomía arterial normal, con células endoteliales en la tunica intima, células musculares lisas en los medios de la túnica, y una matriz de colágeno heterogénea, que incluye fibroblastos y vasos alimentadores llamados vasa vasorum en la tunica adventitia. Las arterias temporales positivas de células gigantes demuestran una inflamación moderada a grave, con agregados y macrófagos, o histiocitos, linfocitos, células plasmáticas ocasionales y células gigantes multinulciadas.También se observa el estrechamiento luminoso, y acompañado de un engrosamiento notable y una interrupción del 90% de la lámina elástica interna. Los linfocitos positivos CD3 y los macrófagos positivos CD68 también están presentes en todos los especímenes positivos de arteritis de células gigantes, con patrones de tinción similares observados en todas las biopsias. La tinción para el receptor beta de folato se limita a los macrófagos y las células gigantes multinóspitas que se localizan preferentemente a la adventitia y a los medios de comunicación.En particular, el receptor beta de folato comprendía aproximadamente el 30% del total de macrófagos. El procesamiento, corte y desescamiento de la biopsia de arteria temporal requiere una destreza cuidadosa para realizar los pasos posteriores. La interpretación de la diapositiva requiere la experiencia de un patólogo cardiovascular experimentado.Recuerde a los espectadores que utilicen precauciones respiratorias y de contacto, como guantes y capuchas ventiladas, al manipular muestras y los reactivos.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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