Name: an immunohistopathologic study to profile the folate receptor beta macrophage and vascular immune microenvironment in giant cell arteritis
Uploaded: 2019-02-08T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Immunohistopathologic Study to Profile the Folate Receptor Beta Macrophage and Vascular Immune Microenvironment in Giant Cell Arteritis at JoVE.com

Detta arbete har gjorts möjlig genom stöd av Dr Douglas Stairs, Marianne Klinger, Ann Benko, avdelningen för Reumatologi/Institutionen för medicin och molekylär och histopatologiska Core laboratorium, Penn State University College of Medicine, Hershey PA.

Alla metoder beskrivs godkändes av Penn State institutionella i styrelsen.
1. histopatologiska förberedelse och bearbetning efter att erhålla tidsmässiga artär biopsi
Obs: Tidsmässiga artär biopsi (fliken) utförs under lokalbedövning och sterila förhållanden av en certifierad kirurg. Efter kirurgiskt erhålla ett 3 cm arteriell avsnitt på den mer drabbade sidan, preparatet är fast i formalin omedelbart under 24 h, indelad i 3 till 4 mm s...

<ol>
	<li>Klippel, J. H., Stone, J. H., White, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Primer on the rheumatic diseases. , (2008).</li><li>Weyand, C. M., Goronzy, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+mechanisms+in+medium+and+large-vessel+vasculitis.">Immune mechanisms in medium and large-vessel vasculitis.</a> Nature Reviews Rheumatol. 9 (12), 731-740 (2013).</li><li>Weyand, C. M., Liao, Y. J., Goronzy, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunopathology+of+giant+cell+arteritis:+diagnostic+and+therapeutic+implications.">The immunopathology of giant cell arteritis: diagnostic and therapeutic implications.</a> Journal of Neuro-ophthalmology. 32 (3), 259-265 (2012).</li><li>Deng, J., Younge, B., Olshen, R., Goronzy, J., Weyand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th17+and+Th1+T-cell+responses+in+giant+cell+arteritis.">Th17 and Th1 T-cell responses in giant cell arteritis.</a> Circulation. 121, 906-915 (2010).</li><li>Mahr, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjunctive+methotrexate+for+treatment+of+giant+cell+arteritis:+an+individual+patient+data+meta-analysis.">Adjunctive methotrexate for treatment of giant cell arteritis: an individual patient data meta-analysis.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 56 (8), 2789-2797 (2007).</li><li>Hoffman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicenter,+randomized,+double-blind,+placebo-controlled+trial+of+adjuvant+methotrexate+treatment+for+giant+cell+arteritis.">A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled trial of adjuvant methotrexate treatment for giant cell arteritis.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 46 (5), 1309-1318 (2002).</li><li>Stone, J. H., Klearman, M., Collinson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trial+of+Tocilizumab+in+Giant-Cell+Arteritis.">Trial of Tocilizumab in Giant-Cell Arteritis.</a> New England Journal of Medicine. 377 (15), 1494-1495 (2017).</li><li>Milman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tocilizumab+increased+sustained+glucocorticoid-free+remission+from+giant+cell+arteritis.">Tocilizumab increased sustained glucocorticoid-free remission from giant cell arteritis.</a> Annals of Internal Medicine. 167 (12), JC63 (2017).</li><li>Xia, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+folate+receptor+is+induced+during+macrophage+activation+and+can+be+used+to+target+drugs+to+activated+macrophages.">A functional folate receptor is induced during macrophage activation and can be used to target drugs to activated macrophages.</a> Blood. 113 (2), 438-446 (2009).</li><li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folate+receptor-beta+constitutes+a+marker+for+human+proinflammatory+monocytes.">Folate receptor-beta constitutes a marker for human proinflammatory monocytes.</a> Journal of Leukocyte Biology. 96 (4), 563-570 (2014).</li><li>Salazar, M. D., Ratnam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+folate+receptor:+what+does+it+promise+in+tissue-targeted+therapeutics.">The folate receptor: what does it promise in tissue-targeted therapeutics.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 26 (1), 141-152 (2007).</li><li>Low, P. S., Henne, W. A., Doorneweerd, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+development+of+folic-acid-based+receptor+targeting+for+imaging+and+therapy+of+cancer+and+inflammatory+diseases.">Discovery and development of folic-acid-based receptor targeting for imaging and therapy of cancer and inflammatory diseases.</a> Accounts of Chemical Research. 41 (1), 120-129 (2008).</li><li>Puig-Kroger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folate+receptor+beta+is+expressed+by+tumor-associated+macrophages+and+constitutes+a+marker+for+M2+anti-inflammatory/regulatory+macrophages.">Folate receptor beta is expressed by tumor-associated macrophages and constitutes a marker for M2 anti-inflammatory/regulatory macrophages.</a> Cancer Research. 69 (24), 9395-9403 (2009).</li><li>Nakashima-Matsushita, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+expression+of+folate+receptor+beta+and+its+possible+role+in+methotrexate+transport+in+synovial+macrophages+from+patients+with+rheumatoid+arthritis.">Selective expression of folate receptor beta and its possible role in methotrexate transport in synovial macrophages from patients with rheumatoid arthritis.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 42 (8), 1609-1616 (1999).</li><li>vander Heijden, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folate+receptor+beta+as+a+potential+delivery+route+for+novel+folate+antagonists+to+macrophages+in+the+synovial+tissue+of+rheumatoid+arthritis+patients.">Folate receptor beta as a potential delivery route for novel folate antagonists to macrophages in the synovial tissue of rheumatoid arthritis patients.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 60 (1), 12-21 (2009).</li><li>Jansen, G., Peters, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+in+folate+receptors+and+transporters:+implications+for+disease+and+treatment+of+immune+diseases+and+cancer.">Novel insights in folate receptors and transporters: implications for disease and treatment of immune diseases and cancer.</a> Pteridines. 26 (2), 41-53 (2015).</li><li>Albano-Aluquin, S., Malysz, J., Aluquin, V. R., Ratnam, M., Olsen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunohistochemical+analysis+of+folate+receptor+beta+expression+and+distribution+in+giant+cell+arteritis+-+a+pilot+study.">An immunohistochemical analysis of folate receptor beta expression and distribution in giant cell arteritis - a pilot study.</a> American Journal of Clinical and Experimental Immunology. 6 (6), 107-114 (2017).</li><li>Ross, J. F., Chaudhuri, P. K., Ratnam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+folate+receptor+isoforms+in+normal+and+malignant+tissues+in+vivo+and+in+established+cell+lines.+Physiologic+and+clinical+implications.">Differential regulation of folate receptor isoforms in normal and malignant tissues in vivo and in established cell lines. Physiologic and clinical implications.</a> Cancer. 73 (9), 2432-2443 (1994).</li><li>Reiner, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+molecular+biology.+Macrophages+and+dendritic+cells.+Methods+and+protocols.+Preface.">Methods in molecular biology. Macrophages and dendritic cells. Methods and protocols. Preface.</a> Methods in Molecular Biology. 531, (2009).</li><li>Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunofluorescence+labelling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+tissue.">Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BMC Cell Biology. 9, 13 (2008).</li><li>Pawlina, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histology: A text and atlas with correlated cell and molecular biology. , (2016).</li><li>Kumar, V., Abbas, A., Robbins Aster, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Robbins and Cotran pathologic basis of disease. , (2015).</li><li>Dabbs, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Diagnostic immunohistochemistry. , (2019).</li><li>Ross, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folate+receptor+type+beta+is+a+neutrophilic+lineage+marker+and+is+differentially+expressed+in+myeloid+leukemia.">Folate receptor type beta is a neutrophilic lineage marker and is differentially expressed in myeloid leukemia.</a> Cancer. 85 (2), 348-357 (1999).</li><li>Holzapfel, G. A., Fratzl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+in+arterial+walls:+biomechanical+aspects.">Collagen in arterial walls: biomechanical aspects.</a> Collagen. Structure and Mechanics. , 285-324 (2008).</li><li>Sultan, H., Smith, S. V., Lee, A. G., Chevez-Barrios, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathologic+Markers+Determining+Prognosis+in+Patients+with+Treated+or+Healing+Giant+Cell+Arteritis.">Pathologic Markers Determining Prognosis in Patients with Treated or Healing Giant Cell Arteritis.</a> American Journal of Ophthalmology. , (2018).</li></ol>

GCA är den vanligaste vaskulit hos vuxna, och dess patologiska hallmark exemplifierar en potent kombination av T-hjälparceller lymfocyter och aktiveras makrofager som kan också hittas i andra granulomatös sjukdomar eller vasculopathies som sarkoidos och granulomatös polyangit2,3. I GCA, den temporala artären ger en bra representation av ett medium till stora storlek artär och TA biopsi ger ett betydande prov som kan lagras i paraffinblock i år, vilket ska...

Jätte cell arterit (GCA) är en inflammatorisk sjukdom av medelstora till stora artärer, inriktning aorta och dess grenar och påverkar äldre vuxna. Den presenterar med mild till svår ischemisk komplikationer såsom stroke och vävnad kallbrand, synförlust, käken smärta, huvudvärk. Diagnosen bekräftas av höga inflammatoriska markörer som erytrocyt sänkan (ESR) och en distinkt histopatologiska mönstret på tidsmässiga artär biopsi (fliken)1. GCA är den vanligaste vuxen vaskulit och tillgängligheten i den temporala artären som erhållits för diagnos presenterar en fördel över andra vasculopathies, vilket möjliggör att studera dess patogenes lättare. De typiska fynd på fliken omfatta ett infiltrat av makrofager/histiocyter och T-lymfocyter finns över alla vaskulär lager av tunica intima, media och adventitia med samtidiga förstörelse av den elastiska lamina som normalt skiljer dessa fack2. De aktuella beläggen visar att GCA innebär okända antigen som aktiverar dendritiska celler i vaskulär adventitia, följt av rekrytering av helper T (Th) celler, särskilt Th1 och Th17 undertyper som utsöndra interleukin-17 och interferon-gamma (IFG) respektive. IFG sedan rekryterar och aktiverar makrofager att producera cytokiner och proteaser. Dessa inkluderar pro-inflammatoriska cytokiner; inklusive IL-12, som reciprocally aktiverar Th1 celler vilket ger en positiv feedbackloop; tumörnekrosfaktor och interleukin-6, som orsakar artrit och feber och metalloproteaser som skada den elastiska lamina. Glukokortikoider (GC), som utgör den kroniska standardbehandling, styra delvis cytokin vägar genom förmildrande av Th17/IL-17 men inte Th1/IFG armen av immunsvar3,4. Tyvärr, utsättande av GC resulterar i återfall. Som en alternativ modalitet, metotrexat har varit repurposed för GCA behandling, men de önska kliniska effektmåtten uppnåddes inte konsekvent trots mer känsliga biomarkörer inte har använts för terapeutiskt övervakning5,6 . 2017 godkändes av interleukin-6 blockerare, tocilizumab, för behandling av GCA framgår det effektivt sjukdomskontroll och steroid sparing effekter7,8.
Hittills finns det inga bra biomarkörer för GCA. Som ett resultat, är det svårt att följa sjukdomens aktivitet och titrera doser av tillgängliga läkemedel för att undvika negativa effekter och minska bördan av kostnad för samhället. Därför är det absolut nödvändigt att leta efter en kandidat biomarkör att korrelerar med sjukdomsaktivitet, ger nya insikter om patogenes och stöd i terapeutiska beslut.
Dysreglering av makrofag aktiveringen är en kritisk faktor i GCA patogenes. Ett effektivt sätt att behandla GCA kan således vara selektiv inriktning av aktiverade makrofager. Folat receptor beta (FRB) är en glycosyl-fosfatidylinositol glykoprotein som är förankrad på cellmembranet uttrycks i normala myelomonocytär celler, myeloisk leukemiceller och aktiverade makrofager. Dess ligand, folsyra, är en viktig vitamin i dess reducerade form, vilket möjliggör cellulär DNA syntesen, metylering och reparation9. FRB uttryck induceras i autoimmun sjukdom och under carcinogenes. Dess uttryck är begränsad till ytan av monocyter eller pro-inflammatoriska M1 makrofager i reumatoid artrit eller antiinflammatoriska M2 makrofager i solida organ och myeloida maligniteter10,11,12 , 13. Utöver dess potentiella roll som en biomarkör av aktiverade makrofager, FRB kan aktivera selektiv läkemedelstransport thru en flerstegsprocess som börjar med receptorbindning folsyra, antifolates eller folat-konjugerad droger på cellen yta, följt av internalisering, release och eventuell leverans av önskad drog till inre cell maskiner12,14,15,16. I kontrast till FRB uttryckt i cancerceller och aktiveras makrofager, FRB uttrycks i normala hematopoetiska celler är inte binda folater därigenom säkerställa att FRB/folat-medierad drogen leverans är begränsad till FRB-positiv inflammatorisk eller cancerceller.
I vår tidigare studie, vi visade för första gången som FRB uttrycks i GCA makrofager och dess uttryck korrelerade med CD68 + och endotelin receptor beta makrofager, som bidrar till GCA patogenes17. I den här rapporten beskriver vi den histopatologiska och immunohistokemiska metoder används för att bedöma FRB makrofag och analyseras det totala lymfocyt och makrofag räknas för att få en inblick i den FRB'S position i GCA vaskulär landskapet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Reichert-Jung</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plain and frosted microscope slides and cover slips</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical rack</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Olympus BX60&#160; microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone in distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>concentrations 100%, 90%, 70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered saline solution (TBS)&#160;</td>
			<td>Dako Wash BufferS3006</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% hydrogen peroxide in TBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaminobenzidine (DAB)</td>
			<td>Sigma Fast Tablet set</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical Permount&#160; Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>SP-15-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harleco Gill&#39;s III Hematoxylin</td>
			<td>Fiisher Scientific 23-750-019</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harleco Eosin Y 1% Alcoholic Stock Solution</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>23-749-977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM citric acid monohydrate (pH 6.0)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-folate receptor beta&#160;</td>
			<td>Manohar Ratnam</td>
			<td></td>
			<td>optimized at 1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-human CD68</td>
			<td>Dako&#160;</td>
			<td>M071801</td>
			<td>optimized at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-CD3</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>A0452</td>
			<td>optimized at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymer goat anti- rabbit/mouse secondary antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Placental tissue</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#160;for FRB positive control</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an immunohistopathologic study to profile the folate receptor beta macrophage and vascular immune microenvironment in giant cell arteritis

Jätte cell arterit (GCA) är en kronisk immunmedierad sjukdom av medelstora till stora medelstora artärer som drabbar äldre vuxna. GCA godsspecifikationer med artrit och ocklusiva symptom på huvudvärk, stroke eller synförlust. Makrofager och T-hjälparceller lymfocyter infiltrera kärlväggen och producerar proinflammatoriska svar som leder till kärlskada och ischemi. Hittills finns det ingen GCA biomarkör som kan övervaka sjukdomen aktivitet och guide terapeutiskt svar.
Folat receptor beta (FRB) är ett glycosylphosphatidylinositol protein som är förankrade på cellmembran och normalt uttryckt i myelomonocytär härstamning och majoriteten av myeloisk leukemiceller samt i tumören och reumatoid synovial makrofager, där dess uttryck korrelerar med sjukdomens svårighetsgrad. FRB förmåga att binda folat föreningar, folsyra-konjugat och antifolate droger har gjort det ett druggable mål i cancer och inflammatorisk Sjukdomforskning. Rapporten beskriver de histopatologiska och immunohistokemiska metoder att bedöma uttryck och distribution av FRB i förhållande till GCAimmunopathology.
Formalin-fasta och paraffin-inbäddat temporala artären biopsier från GCA och normala kontroller var färgas med Hematoxylin och Eosin att granska vävnad histologi och identifiera patognomona funktioner. Immunohistokemi användes för att upptäcka FRB, CD68 och CD3 uttryck. En mikroskopisk analys utfördes för att kvantifiera antalet positivt färgade celler på 10 markerade hög-High-Power-fältet avsnitt och sina respektive platser i kärlväggen.
Lymphohistiocytic (LH) inflammation åtföljs av intimans hyperplasi och störd elastisk lamina sågs i GCA med ingen hittades i kontroller. Den LH infiltrera bestod av cirka 60% lymfocyter och 40% makrofager. FRB uttrycket var begränsad till makrofager, bestående av 31% av den totala CD68 + makrofag befolkningen och lokaliserad till media och adventitia. Ingen FRB sågs hos kontrollerna.
Detta protokoll visat ett distinkt numeriskt och rumsliga mönster av FRB makrofager i förhållande till den vaskulära immun närmiljön i GCA.

Histopatologiska fynd
H & E fläckar i normala prover visat normal arteriell anatomi med endotelceller i tunica intima, glatta muskelceller i tunica media, och en heterogen kollagenmatrisen som inkluderar fibroblaster och feeder fartyg kallas vasa vasorum i tunica adventitia. Det finns ingen inflammatoriska infiltrat som identifierats. GCA positiva temporala artärer visat måttlig till svår inflammation med ag...

Watch this Scientific Journal Video about An Immunohistopathologic Study to Profile the Folate Receptor Beta Macrophage and Vascular Immune Microenvironment in Giant Cell Arteritis at JoVE.com

An Immunohistopathologic Study to Profile the Folate Receptor Beta Macrophage and Vascular Immune Microenvironment in Giant Cell Arteritis

Protokollet illustrerar användningen av histopatologisk undersökning och immunohistokemi till Profil folat receptor beta makrofag och dess förhållande till den totala immunceller infiltrera i temporala artären biopsier i jätte cell arterit.

En Immunohistopathologic studie att profilera den folat Receptor Beta makrofag och vaskulär immun närmiljön i jätte Cell arterit

Giant cell arteritis (GCA) is a chronic immune-mediated disease of medium-to-large sized arteries that affects older adults. GCA manifests with arthritis ...

Detta immunohistochemical och histopathologic protokoll kan användas för att undersöka folat receptor beta, som är en kandidat protein med potentiella prognostiska och terapeutiska värdet till den vaskulära mikromiljö i jätte cell arteritis. Detta protokoll är tidstestade och allmänt sysselsatta och kan användas för att utforska folat receptorn beta attribut i tidsmässiga artär vävnader, även efter långvarig lagring. Att förvärva vävnad sektioner, använd en mikrotom för att skära fyra till fem mikrometer tjocka delar av paraffin-inbäddade temporala artärer, flytande varje avsnitt i en 40 grader Celsius vattenbad som de erhålls, för att ta bort rynkor.Använd glasmikroskop diabilder för att fånga tre sektioner per bild, och värma diabilder på en värmande platta, i en 60 graders Celsius ugn i 60 minuter. När sektionerna har anslutit sig till bilderna placerar du bilderna i ett vertikalt rack för torkning vid 37 graders celsius i 24 timmar. Nästa dag överför du bilderna till en glidbehållare för lagring vid fyra grader Celsius i minst 12 timmar.Därefter, ladda glider in i en slide rack och hydrat vävnaderna med två fem minuter, 100%xylen nedsänkning och en fallande, fem minuter per koncentration etanol nedsänkning serien, med 10 sekunder av agitation var 30 sekunder. Efter 70%etanol nedsänkning, skölj diabilder två gånger i dubbeldestillerat vatten i fem minuter, med 10 sekunder av agitation var 30 sekunder. För antigenhämtning, överför rack i en glasbehållare med 200 mikroliter på 95 grader Celsius, 10 millimol per liter citratbuffert i 30 minuter.Vid inkubationens, låt rutschkanorna svalna till rumstemperatur i 20 minuter innan du sköljer med rinnande vatten i fem minuter. För att ta bort den endogena peroxidasaktiviteten, använd först en hydrofoba markör för att rita en cirkel runt varje vävnadsprov, innan du inkuberar proverna i 200 mikroliter på 3%väteperoxid i 10 minuter, följt av 3 tvättar i 200 gloliter av tris-buffrad saltlösning, eller TBSS, per tvätt. Efter den sista tvätten, badda varje bild försiktigt för att ta bort eventuellt överskott buffert och tillsätt 200 mikroliter av den primära antikropp cocktail av intresse och ett lock slip till varje bild för en timmes inkubation i en fuktig kammare vid rumstemperatur.I slutet av inkubationen, kassera täcksliorna och skölj objektglasen med tre tvåminuterstvättar i färsk TBSS. När överskottsbufferten har avlägsnats, tillsätts 200 mikroliter av en lämplig biotinylerad sekundär antikroppslösning och en täckslir till varje objektglas för en 45-minuters inkubation i den fuktiga kammaren vid rumstemperatur. När du har kastat om kåpans glidningar sköljer du objektglasen med TBSS som det visats.Ta bort eventuell överskottsbuffert. Och märka sektionerna med 200 mikroliter av DAB substratbuffert i 10 minuter vid rumstemperatur. Vid slutet av inkubationen tvättar du rutschkanorna med TBSS och rinnande kranvatten i 10 minuter, innan du räknar med hematoxylin i tre minuter.Tillsätt sedan 70 mikroliter av ett lämpligt monteringsmedium till varje objektglas och tippa långsamt en glasskyddslist på monteringsmediet för att undvika att skapa bubblor när täckglidningen sänks på plats. För histopatologisk analys, placera bilden på scenen i ett ljus mikroskop och bedöma vaskulär arkitekturen i den första vävnaden avsnitt. Sedan kvantifiera antalet makrofager i förhållande till antalet lymfocyter per avsnitt.För immunohistochemical analys, undersöka folat receptorn beta färgning mönster på varje vävnad avsnitt och kvantifiera antalet folat receptor beta positiva, CD68 positiva och CD3 positiva celler i 10 slumpmässigt utvalda hög effekt fält per avsnitt. Hematoxylin och eosin färgning i normala exemplar avslöjar en normal kranskärlens anatomi, med endotelceller i tunica intima, glatt muskelceller i tunica media, och en heterogen kollagen matris, som inkluderar fibroblaster och feeder fartyg som kallas vasa vasorum i tunica adventitia. Giant cell arteritis positiva temporal artärer visar en måttlig till svår inflammation, med aggregat och makrofager, eller histiocytes, lymfocyter, enstaka plasma celler och multi-nucleated jätteceller.Luminal förträngning noteras också, och åtföljs av intimal förtjockning och en 90%störningar av den inre elastisk lamina. CD3 positiva lymfocyter och CD68 positiva makrofager finns också i alla jätte cell arteritis positiva exemplar, med liknande färgning mönster observerats i alla de tarmbiopsier. Färgning för folat receptor beta är begränsad till makrofager och multi-nucleated jätteceller som företrädesvis lokalisera till adventitia och media.Noterbart, folat receptor beta omfattade cirka 30%av den totala makrofager. Den tidsmässiga artär biopsi bearbetning, skärning och dewaxing kräver noggrann dexteriety för att utföra efterföljande steg. Bilden tolkning kräver expertis av en erfaren kardiovaskulär patolog.Påminn tittarna om att använda kontakt- och andningsskyddsförsiktighetsåtgärder, som handskar och ventilerade huvar, vid hantering av preparat och reagenserna.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Seven Steps to Stellate Cells

Sju steg till stellate celler

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

En introduktion till parasitsteklar av<em&gt; Drosophila</em&gt; Och Antiparasite immunsvar

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Ett<em&gt; In vitro</em&gt; Modell för att studera skillnader mellan de mänskliga makrofagdifferentiering och polarisation

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In vitro och in vivo modell för att studera bakteriell vidhäftning till kärlväggen Under Flow Villkor

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofil Isolering och analys för att fastställa deras roll i lymfom Cell Känslighet för terapeutiska medel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Utveckling och identifieringen av en ny underpopulation av humant neutrofilt härrörande Giant fagocyter<em&gt; In Vitro</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Fabricating Optical-quality Glass Surfaces to Study Macrophage Fusion

Fabricera optisk-kvalitet glasytor att studera makrofag Fusion

Visualizing the formation of multinucleated giant cells (MGCs) from living specimens has been challenging due to the fact that most live imaging ...

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

Bedömningen av cellulära immunsvaret hos bananflugan, Drosophila melanogaster, använder ett fagocytos i Vivo test

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are ...