Name: determining 3'-termini and sequences of nascent single-stranded viral dna molecules during hiv-1 reverse transcription in infected cells
Uploaded: 2019-01-30T14:00:00
Duration: 13 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells at JoVE.com

الكتاب الاعتراف بالدعم من أعضاء المختبر ماليم ولويس Apolonia، الندبة جيرنيج، و Oakey ريبيكا. يشكر المؤلفون أرنو مات في كلية الملك "لندن مركز الجينوم" وديبي هيوز في جامعة كلية لندن (UCL)، يعمل معهد "طب الأعصاب القادم جيل مرفق التسلسل" للحصول على مساعدة مع تسلسل مسك. أيد المملكة المتحدة مجلس البحوث الطبية (G1000196 والسيد/M001199/1 إلى م. م.)، ومؤسسة ويلكوم ترست (106223/Z/14/ي إلى م. م.)، والمفوضية الأوروبية للبرنامج الإطاري السابع (FP7-2007-2013) العمل إطار المنحة لا. بييف-GA-2012-329679 (إلى موانئ دبي)، ووزارة الصحة عن طريق "المعاهد الوطنية" لجائزة مركز البحوث الطبية الحيوية الشامل للبحوث الصحة للرجل وسانت توماس مؤسسة دائرة الصحة الوطنية الثقة في شراكة مع كلية لندن للملك والملك مستشفى الكلية مؤسسة دائرة الصحة الوطنية الثقة.

<ol>
	<li>Herschhorn, A., Hizi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+reverse+transcriptases.">Retroviral reverse transcriptases.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (16), 2717-2747 (2010).</li><li>Hu, W. S., Hughes, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+reverse+transcription.">HIV-1 reverse transcription.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (10), (2012).</li><li>Levin, J. G., Mitra, M., Mascarenhas, A., Musier-Forsyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+HIV-1+nucleocapsid+protein+in+HIV-1+reverse+transcription.">Role of HIV-1 nucleocapsid protein in HIV-1 reverse transcription.</a> RNA Biology. 7 (6), 754-774 (2010).</li><li>Menendez-Arias, L., Sebastian-Martin, A., Alvarez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+reverse+transcriptases.">Viral reverse transcriptases.</a> Virus Research. , (2016).</li><li>Telesnitsky, A., Goff, S. P., Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Retroviruses. , (1997).</li><li>Pollpeter, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+sequencing+of+HIV-1+reverse+transcripts+reveals+the+multifaceted+antiviral+functions+of+APOBEC3G.">Deep sequencing of HIV-1 reverse transcripts reveals the multifaceted antiviral functions of APOBEC3G.</a> Nature Microbiology. 3 (2), 220-233 (2018).</li><li>Frohman, M. A., Dush, M. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+production+of+full-length+cDNAs+from+rare+transcripts:+amplification+using+a+single+gene-specific+oligonucleotide+primer.">Rapid production of full-length cDNAs from rare transcripts: amplification using a single gene-specific oligonucleotide primer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (23), 8998-9002 (1988).</li><li>Liu, X., Gorovsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+5'+and+3'+ends+of+Tetrahymena+thermophila+mRNAs+using+RNA+ligase+mediated+amplification+of+cDNA+ends+(RLM-RACE).">Mapping the 5' and 3' ends of Tetrahymena thermophila mRNAs using RNA ligase mediated amplification of cDNA ends (RLM-RACE).</a> Nucleic Acids Research. 21 (21), 4954-4960 (1993).</li><li>Ince, I. A., Ozcan, K., Vlak, J. M., van Oers, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+classification+and+mapping+of+non-polyadenylated+transcripts+of+an+invertebrate+iridovirus.">Temporal classification and mapping of non-polyadenylated transcripts of an invertebrate iridovirus.</a> Journal of General Virology. 94, 187-192 (2013).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-ligase-dependent+biases+in+miRNA+representation+in+deep-sequenced+small+RNA+cDNA+libraries.">RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries.</a> RNA. 17 (9), 1697-1712 (2011).</li><li>Kwok, C. K., Ding, Y., Sherlock, M. E., Assmann, S. M., Bevilacqua, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hybridization-based+approach+for+quantitative+and+low-bias+single-stranded+DNA+ligation.">A hybridization-based approach for quantitative and low-bias single-stranded DNA ligation.</a> Analytical Biochemistry. 435 (2), 181-186 (2013).</li><li>Abram, M. E., Tsiang, M., White, K. L., Callebaut, C., Miller, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+strategy+to+assess+intrinsic+inhibition+efficiencies+of+HIV-1+reverse+transcriptase+inhibitors.">A cell-based strategy to assess intrinsic inhibition efficiencies of HIV-1 reverse transcriptase inhibitors.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (2), 838-848 (2015).</li><li>Bishop, K. N., Verma, M., Kim, E. Y., Wolinsky, S. M., Malim, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APOBEC3G+inhibits+elongation+of+HIV-1+reverse+transcripts.">APOBEC3G inhibits elongation of HIV-1 reverse transcripts.</a> PLoS Pathogens. 4 (12), 1000231 (2008).</li><li>Zack, J. A., Haislip, A. M., Krogstad, P., Chen, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incompletely+reverse-transcribed+human+immunodeficiency+virus+type+1+genomes+in+quiescent+cells+can+function+as+intermediates+in+the+retroviral+life+cycle.">Incompletely reverse-transcribed human immunodeficiency virus type 1 genomes in quiescent cells can function as intermediates in the retroviral life cycle.</a> Journal of Virology. 66 (3), 1717-1725 (1992).</li><li>Adachi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+acquired+immunodeficiency+syndrome-associated+retrovirus+in+human+and+nonhuman+cells+transfected+with+an+infectious+molecular+clone.">Production of acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone.</a> Journal of Virology. 59 (2), 284-291 (1986).</li><li>Shah, V. B., Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+uncoating+of+HIV-1+cores.">In vitro uncoating of HIV-1 cores.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), (2011).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Science+Education+Database:+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology:+Passaging+Cells.">Science Education Database: Basic Methods in Cellular and Molecular Biology: Passaging Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database:+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology:+Using+a+Hemocytometer+to+Count+Cells.">JoVE Science Education Database: Basic Methods in Cellular and Molecular Biology: Using a Hemocytometer to Count Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>Zhou, M. Y., Gomez-Sanchez, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+TA+cloning.">Universal TA cloning.</a> Current Issues in Molecular Biology. 2 (1), 1-7 (2000).</li><li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purifying+plasmid+DNA+from+bacterial+colonies+using+the+QIAGEN+Miniprep+Kit.">Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).</li><li>Mangeat, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+antiretroviral+defence+by+human+APOBEC3G+through+lethal+editing+of+nascent+reverse+transcripts.">Broad antiretroviral defence by human APOBEC3G through lethal editing of nascent reverse transcripts.</a> Nature. 424 (6944), 99-103 (2003).</li><li>Gillick, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+HIV-1+infection+by+APOBEC3+proteins+in+primary+human+CD4(+)+T+cells+is+associated+with+inhibition+of+processive+reverse+transcription+as+well+as+excessive+cytidine+deamination.">Suppression of HIV-1 infection by APOBEC3 proteins in primary human CD4(+) T cells is associated with inhibition of processive reverse transcription as well as excessive cytidine deamination.</a> Journal of Virology. 87 (3), 1508-1517 (2013).</li><li>Harris, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+deamination+mediates+innate+immunity+to+retroviral+infection.">DNA deamination mediates innate immunity to retroviral infection.</a> Cell. 113 (6), 803-809 (2003).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytidine+deaminase+CEM15+induces+hypermutation+in+newly+synthesized+HIV-1+DNA.">The cytidine deaminase CEM15 induces hypermutation in newly synthesized HIV-1 DNA.</a> Nature. 424 (6944), 94-98 (2003).</li><li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iCLIP--transcriptome-wide+mapping+of+protein-RNA+interactions+with+individual+nucleotide+resolution.">iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).</li><li>Troutt, A. B., McHeyzer-Williams, M. G., Pulendran, B., Nossal, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligation-anchored+PCR:+a+simple+amplification+technique+with+single-sided+specificity.">Ligation-anchored PCR: a simple amplification technique with single-sided specificity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (20), 9823-9825 (1992).</li><li>Zhelkovsky, A. M., McReynolds, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+analysis+of+Methanobacterium+thermoautotrophicum+RNA+ligase+-+engineering+a+thermostable+ATP+independent+enzyme.">Structure-function analysis of Methanobacterium thermoautotrophicum RNA ligase - engineering a thermostable ATP independent enzyme.</a> BMC Molecular Biology. 13 (24), (2012).</li><li>Li, T. W., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-independent+and+quantitative+ligation+of+single-stranded+DNA.">Structure-independent and quantitative ligation of single-stranded DNA.</a> Analytical Biochemistry. 349 (2), 242-246 (2006).</li><li>Gansauge, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-stranded+DNA+library+preparation+from+highly+degraded+DNA+using+T4+DNA+ligase.">Single-stranded DNA library preparation from highly degraded DNA using T4 DNA ligase.</a> Nucleic Acids Research. 45 (10), 79 (2017).</li><li>Ding, Y., Kwok, C. K., Tang, Y., Bevilacqua, P. C., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiling+of+in+vivo+RNA+structure+at+single-nucleotide+resolution+using+structure-seq.">Genome-wide profiling of in vivo RNA structure at single-nucleotide resolution using structure-seq.</a> Nature Protocols. 10 (7), 1050-1066 (2015).</li></ol>

الكتاب يعلن أن لديهم أي شيء كشف.

توافر التسلسل العميق سريعة وموثوق بها وفعالة من حيث التكلفة قد أحدث ثورة في العديد من الجوانب في مجال علوم الحياة، والسماح بعمق كبير في التحليلات القائمة على التسلسل. تحدي المتبقي يكمن في التصميم المبتكر وخلق الممثل مكتبات التسلسل. هنا يصف لنا وضع بروتوكول لالتقاط جزيئات كدنا الفيروسية الوليدة، على وجه التحديد المواد الوسيطة لعملية النسخ العكسي فيروس نقص المناعة البشرية-1.
أن الخطوة الأكثر أهمية في هذه الاستراتيجية هو ربط محول لفتح 3 '-تيرميني بطريقة كمية وغير متحيزة. فعالية ليجيشنز بين اثنين ssDNA تيرميني، سواء في جملة-وإينتراموليكولار، تم التحقيق فيها والأمثل لمختلف التطبيقات11،،من2627،،من2829. اختيار استخدام محول دبوس مع ليجاسى T4 الحمض النووي حسب الشروط الموضحة في الخطوة 3، 3 هو نتيجة للتحسين التجريبية التي نحن تقييم ligases مختلفة، محولات والمواد الكاشفة للربط النوكليوتيد الاصطناعية التي تمثل فيروس نقص المناعة البشرية-1 تسلسل (الجدول 2) (البيانات لا تظهر). في المختبر اختبار ردود الفعل هذه، أكدنا أن ليجاسى T4 الحمض النووي بوساطة ربط محول دبوس، كما وصفها كوك وآخرون. 11، قد تحيز منخفضة جداً، ويحقق القرب ربط كاملة من جزيئات يقبلون عند استخدام المحول في الزائدة. كفاءة عملية ربط لم تتأثر بإضافة النوكليوتيدات تسلسل تقديم المحول متوافق مع نظام متعدد التمهيدي (انظر الشكل 4). وفي المقابل، وجدنا أن من الحرارة 5 'الحمض النووي/رنا ليجاسى ("ليجاسى A"، انظر الجدول للمواد للضبط ligases مقارنة هنا)، الذي هو المهندسة رنا ليجاسى تم تطويره جزئيا لتحسين كفاءة عملية ربط مع ssDNA كما يقبلون 27، كان في الواقع أكثر فعالية في ليجاتينج اثنين ssDNA جزيئات من الحمض النووي الريبي ليجاسى ليجاسى ("B") ولكن لديها تحيز كبير، مع اختلافات قوية في كفاءة عملية ربط حتى بين النوكليوتيد مع اختلاف طول قاعدة واحد [الجدول 2 ; المشاركة يخدع منتصف ز (أ) و (ب)]. وعلاوة على ذلك، وجدنا تحيزاً الحد أدنى فقط في ردود الفعل مع "جيم ليجاسى" جنبا إلى جنب مع محول القيام تجارب معشاة 5 '-تيرميني (استراتيجية تستخدم للتعويض عن التحيز النوكليوتيدات المعروفة"ليجاسى ج"؛ انظر على سبيل المثال دينغ et al. 30). ومع ذلك، "جيم ليجاسى"-ليجيشنز الجزيئات وساطة كانت غير مكتملة، مما يجعل النظام ليجاسى الحمض النووي T4 اختيار متفوقة.
عدة خطوات مراقبة الجودة عبر مسار البروتوكول وإدراج عناصر إيجابية وسلبية، والسماح للكشف عن المشاكل المحتملة قبل مواصلة التحليل وتوفير التوجيه لجهود استكشاف الأخطاء وإصلاحها. كوانتيفيكيشنز قبكر في الخطوات 2.2.2 و 2.3.12 ضمان أن كمية المواد المدخلة غير كافية. كدنا نموذجي نسخ الأرقام في النطاق شطف (من الخطوة 2، 1) 200 ميليلتر من حوالي 10,000 إلى 300,000 كل ميليلتر. الخطوة القبض على الهجين يمكن أن يسفر عن بعض الخسائر الشاملة من فيروس نقص المناعة البشرية-1 كمية كدنا بل ينبغي أن يسفر إثراء خاصة فيروس نقص المناعة البشرية-1 كدنا قوية على الحمض الخلوي، الذي يمكن تحديده باستخدام أجهزة الإشعال المناسبة لقياس الحمض النووي قبل وبعد تخصيب اليورانيوم قبل قبكر أو عن طريق قياس مجموع تركيز الحمض النووي. كدنا فيروس نقص المناعة البشرية-1 تم استردادها بعد القبض على الهجين الخطوات ينبغي أن يكون على الأقل 10% المدخلات. منخفضة ابتداء من المواد قد يفسر خلاف عنصر تحكم اليغنوكليوتيد ناجحة إيجابية (راجع الخطوة 3.3.2) لكن ما يلي: تحقيق في العينات محدودة فقط. انخفاض قراءة الأرقام الإجمالية يمكن أن تفسر أيضا بالمبالغة في تقدير تركيز المكتبة نظراً للوجود غير صلة الأنواع الحمض النووي دون مسك محولات. وهذا سيؤدي إلى كتلة منخفضة الكثافة ويمكن تحسينه من خلال تحديد تركيز تسلسلات فيروس نقص المناعة البشرية-1 في المكتبة عن طريق قبكر بالإضافة إلى المبلغ الإجمالي الحمض النووي بفحوصات فلوروميتريك. نظراً للطبيعة الحساسة للغاية للأسلوب، ينبغي إيلاء عناية خاصة لتجنب التلوث حتى منخفض المستوى، سواء من عينات أخرى (على وجه الخصوص، من مخزون اليغنوكليوتيد عنصر التحكم التركيز العالي) كذلك من معدات المختبرات. تعمل بالأشعة فوق البنفسجية تعقيم PCR محطة عمل مفيد في هذا الصدد. التفريد جل الآلي للمكتبة النهائي (الخطوة 6.1.2) مقياس مراقبة الجودة مزيد. نطاق حجم الحمض النووي ولاحظ عادة بين 150 إلى 500 nt. الإشعال يمكن الكشف عنها في عنصر التحكم الاختياري بعد بكر وقبل تنقية (انظر الملاحظة في الخطوة 5، 2) الآن يجب أن تكون غائبة. في نتيجة ذلك ممثل، لقد منحنى كثافة العينة ذروتها حوالي 160 إلى 170 nt وأكثر وضوحاً بثانية ذروة حوالي 320 إلى 350 nt. المرجح أن هذا يعكس وفرة أعلى كثيرا ما ينظر في قصيرة نسبيا (طول إدراج nt 1 إلى 20) عكس النصوص وكامل طول قوية توقف (180 إلى 182 nt إدراج الطول) (الشكل 3ب).
بينما قدم البروتوكول والإشعال مختارة محددة لفيروس نقص المناعة البشرية-1 أوائل النسخ العكسي ثوابت، الأسلوب تنطبق بصورة عامة على أية دراسة تهدف إلى تحديد فتح 3 '-تيرميني للحمض النووي. التعديلات الرئيسية المطلوبة في سياقات أخرى ستكون طريقة للقبض على الهجين واستراتيجية التصميم التمهيدي. على سبيل المثال، إذا كان الهدف أن تتكيف أواخر فيروس نقص المناعة البشرية-1 النصوص، عددا أكبر من مختلف النوكليوتيد بيوتينيلاتيد الالتقاط الصلب عبر طول كدنا سيكون من المستصوب ويرجح أن تنخفض الخسارة في الخطوة القبض على الهجين. وكما ذكر في المقدمة، من المهم النظر في القيود عند تصميم النطاق أكثر مما 3 '-تيرميني ليتم اكتشافها لتجنب مصادر مختلفة من التحيز. أولاً، قد يكون هناك تحيز في ردود الفعل PCR إذا كانت القوالب مع المحول من طول متفاوتة إلى حد كبير. ثانيا، منصة التسلسل المستخدمة هنا (مثل مسك) نطاق طول إدراج مفضل للتكتل الأمثل، وإلى حد كبير قد لا تعيين تسلسل المنتجات أقصر وأطول بنفس الكفاءة. في جزء منه، وهذا يمكن معالجتها حسابياً، كما قامت بحساب عامل تصحيح للتحيز القائم على طول خطي (انظر الشكل 4، أسفل الرسم البياني). ومع ذلك، إذا كانت المنطقة من حيث هو المطلوب 3 '-تيرميني رسم الخرائط طويلة (nt > 1000)، فإنه من المستحسن أكثر تقسيم ردود الفعل مع النصوص الواصلة واستخدام كبسولة تفجير المنبع متعددة لتقييم 3'-تيرميني في الفروع.
تمت كتابة البرنامج التحليل داخليا لغرض محدد هو تحليل كلا النوكليوتيدات آخر فيروس نقص المناعة البشرية-1 تسلسل المتاخمة لتسلسل محول الثابتة وكذلك الاختلاف الأساسي من جميع القواعد لتحديد أي طفرات. الخطوات الفردية التي تشمل ما يلي: أولاً، يتم تقسيم في تسلسل محول استخدام أدوات فاستكس-0.0.13؛ بعد ذلك، تتم إزالة أي تسلسل لا تتكرر (بمعنى تسلسل مماثلة بما في ذلك الرمز الشريطي). ثم محاذاة كل القراءات فريدة المتبقية لفيروس نقص المناعة البشرية-1 التسلسل باستخدام Bowtie (http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml) مع عدم تطابق الحد الأقصى تعيين في ثلاث قواعد. يتكون تسلسل قالب من 635 الأولى nt لفيروس نقص المناعة البشرية-1 كدنا (سلالة NL4.3)، الذي يتضمن التسلسل-نظام الضمان الاجتماعي وأول منتج نقل حبلا يصل إلى المسار بوليبوريني (U5-R-U3-PPT) (انظر الشكل 1). وبالتالي، على البرامج المقدمة وقوالب فقط مباشرة مناسبة إذا استخدمت الطريقة لنفس التطبيق (الكشف عن النصوص عكس المبكر ل فيروس نقص المناعة البشرية-1NL4.3). سيتعين إجراء تعديلات لمتواليات مستهدفة أخرى. ومواقف 3 '-تيرميني لكل عملية قراءة يحددها الموقف في المحاذاة. يتم تسجيل المكالمات قاعدة لكل وظيفة، وتحسب معدلات الطفرة من تغطية مجموع كل قاعدة، ويختلف، كما يقرأ ذات أطوال مختلفة وإدراج طويلة لا يمكن تغطيتها بتسلسل 125-قاعدة في Read2 تماما.
وختاما، نعتقد الأسلوب وصف لتكون أداة قيمة للعديد من أنواع الدراسات. وتشمل التطبيقات واضحة تحقيقات الآليات الأساسية لتثبيط النسخ العكسي عن طريق العقاقير المضادة للفيروسات الرجعية أو عوامل تقييد الخلوية. ومع ذلك، ينبغي أن تكون تعديلات طفيفة نسبيا اللازمة للتكيف مع النظام إلى 3 '-تيرميني رسم الخرائط داخل أخرى وسيطة الفيروسي الحمض النووي واحد-الذين تقطعت بهم السبل التي موجودة، على سبيل المثال، في تكرار البارفو. وعلاوة على ذلك، يمكن أن توفر مبدأ الأسلوب، لا سيما خطوتها الربط الأمثل، جزءا أساسيا من تصميم إعداد المكتبة لتوصيف أي ملحقات 3 '--الحمض النووي، بما في ذلك الونجيشنز التي تحفزها الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل الخلوية [بولمرس].

وسيطة مطلوبة من أجل تشريح وفهم النسخ المتماثل الفيروسية تماما، وبصورة متزايدة صقل التقنيات التي التقاط النسخ المتماثل. على وجه الخصوص، التعريف الدقيق لأنواع الحمض النووي الفيروسي في سياق الخلايا المصابة يمكن أن توفر أفكاراً جديدة، نظراً للعديد من النسخ المتماثل الفيروسية الآليات حتى الآن تم النظر في ردود أفعال معزولة في المختبر . هو مثال على عملية النسخ العكسي في الفيروسات القهقرية، مثل فيروس نقص المناعة البشرية (فيروس نقص المناعة البشرية-1) 1. الخطوات المختلفة لفيروس نقص المناعة البشرية-1 النسخ العكسي، خلالها نسخ المنتسخة العكسية إنزيم فيروسي (RT) جينوم الحمض النووي الريبي المفرد-الذين تقطعت بهم السبل في الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل، وقد درس في المقام الأول التمهيدي التمديد معبراً مع البروتينات المنقاة والنووية الأحماض1،2،3،،من45. بينما وضعت مبادئ أساسية، مثل فحوصات لا تتضمن كافة المكونات الخلوية والفيروسية وقد لا تعكس ستويتشيوميتريس بيولوجيا ذات الصلة من العوامل المشتركة. ولذلك، قمنا بتصميم تقنية قوية لتحديد أطياف وسيطة النسخ العكسي مع كدنا دقيقة 3 '-تيرميني (أي تحديد أطوال الضبط)، وتسلسل النوكليوتيدات في سياق العدوى للمعيشة 6من الخلايا. جمع البيانات من الوقت يمكن الاستفادة من التجارب بالطبع لمقارنة الشخصية النصوص تحت ظروف مختلفة، مثل وجود الجزيئات المضادة للفيروسات أو البروتينات، والتي قد تؤثر على كفاءة و [بروسسيفيتي] لتركيب الدنا و تراكم. وهذا ما يسمح فهم أكثر تفصيلاً لدورة الحياة الطبيعية الممرض، والذي غالباً ما يكون أساسا لتصميم الأدوية المستهدفة والتدخل العلاجي الناجح.
فيروس نقص المناعة البشرية-1 النسخ العكسي وتضم سلسلة من الأحداث المتعاقبة التي بدأتها الصلب من التمهيدي الحمض الريبي النووي النقال إلى قالب الحمض النووي الريبي الجينوم، الذي تم تمديده بعد ذلك قبل RT لإنتاج نسخة قصيرة واحدة-الذين تقطعت بهم السبل كدنا يسمى حبلا ناقص قوية-وقف (-نظام الضمان الاجتماعي) (انظر الشكل 1). في وقت لاحق، كدنا-نظام الضمان الاجتماعي نقل إلى المحطة 5 'دام تكرار (لتر) 3'-لتر من الجيش الملكي النيبالي الجينوم، حيث أنها أنيالس ويخدم التمهيدي ل RT استمرار وساطة استطالة الناقص حبلا الحمض النووي (انظر ملاحظات على النسخ العكسي1 , 2 , 3 , 4)-هذا النقل حبلا الأولى واحدة من الخطوات التي تحد من معدل للنسخ العكسي؛ ومن ثم فهو معروف كدنا-نظام الضمان الاجتماعي تتراكم. ويرد في الشكل 2aتصميم سير العمل والمكتبة الأساسية لالتقاط المنتجات النسخ العكسي في الخلايا المصابة. كبسولة تفجير محددة وتحليل الإعدادات التي يتم استخدامها في البروتوكول والمدرجة في الجدول 1 استهداف جميع أوائل عكس النسخ كدنا وسيطة داخل نطاق طول من 23 إلى 650 ~ nt, التي تضم 180-182 nt-نظام الضمان الاجتماعي الحمض النووي. بيد تسمح تعديلات طفيفة المناسبة للاستراتيجية التطبيق إلى أواخر النسخ العكسي المنتجات ليس فقط ولكن أيضا الفيروسات الأخرى والنظم، حيث يتمثل الهدف في الكشف عن 3 '--أوه تحتوي على الحمض النووي ينتهي. تشمل القيود الهامة للنظر في نطاق طول للمنتج النهائي ببكر في المكتبة؛ على وجه الخصوص، القوالب التي تتجاوز المسافة بين محول على فتح 3 '-المحطة والموقع التمهيدي المنبع nt ~ 1000 سوف يرجح أن تكون أقل كفاءة متسلسلة، إدخال يحتمل أن تكون مضللة التحيزات القائمة على التقنية خلال (إعداد المكتبة انظر المناقشة لمزيد من التفاصيل والاقتراحات التكيف).
سابقا قد ركزت تقنيات الإبلاغ عنها لتحديد منهجية 3 '-تيرميني خيوط الحمض النووي في الجيش الملكي النيبالي، وليس الحمض النووي، والجزيئات. مثال واحد هو 3 ' سباق (التضخيم السريع ينتهي كدنا)7، الذي يعتمد على بوليادينيليشن مرناً. وباﻹضافة إلى ذلك، وضعت محول المستندة إلى ربط استراتيجيات توظيف ligases الجيش الملكي النيبالي، التي شملت RLM-سباق (سباق ليجاسى بوساطة الرنا)8 أو الرباط (التضخيم القائم على ربط الغايات كدنا)9. من المهم التأكيد على أن تستند إلى عملية ربط إيضاحات مسهبة حساسة لأي تحيز الأخذ برد فعل ربط نفسها. على سبيل المثال، يمكن ربط كفاءة أكثر أو أقل اعتماداً النوكليوتيدات خاص في موقف 3 '، وتسلسل، الطول الكلي جزيء أو الهيكل المحلي. هذه التفضيلات ليجاسى يؤدي إلى التقاط غير مكتملة من الجزيئات وتحريف في قراءات، التي لاحظت نحن وآخرون9،10. لتقليل التحيز ربط أثناء خطوات إضافة محول في البروتوكول الموضحة هنا، لقد اختبرنا عددا من استراتيجيات عملية ربط والعثور على استخدام الحمض النووي T4 ليجاسى مع محول الحمض النووي دبوس واحد-الذين تقطعت بهم السبل (كما وصفها كوك et al. 11) أن يكون الإجراء الوحيد بالقرب من ربط الكمية التي لم تسفر عن وجود اختلافات كبيرة في كفاءة عملية ربط عند تقييم مع مجموعة مختارة خصيصا لمراقبة النوكليوتيد6. اختيار استراتيجية ربط هذا، لذلك، سمة رئيسية في نجاح هذا البروتوكول.
وحتى الآن، رصد تطور فيروس نقص المناعة البشرية-1 RT في الخلايا المصابة أساسا تم إنجازه عن طريق قياس منتجات النسخ العكسي من طول مختلف مع PCR الكمي (qPCR) باستخدام مجموعات التحقيق التمهيدي بشكل فريد قياس أقصر أو أطول (المبكر و وقت متأخر، على التوالي) كدنا منتجات12،،من1314. بينما هذا النهج qPCR المناسب لتحديد الكفاءات الجوهرية لعملية النسخ العكسي في الأنظمة الخلوية، الإخراج من دقة منخفضة نسبيا، مع أية معلومات تسلسل مستمدة. نهجنا الجديد، استناداً إلى ربط محول محسن، وتوليد المكتبة بكر بوساطة، وعناوين تسلسل عميق الهوة التكنولوجية ويوفر فرصة لرصد النسخ العكسي أثناء الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 كمياً وفي النوكليوتيدات واحدة القرار.
أننا قد أثبتت فائدة هذا الأسلوب في دراسة التي ميزت بين المقترح نموذجين لقدرة عامل تقييد فيروس نقص المناعة البشرية-1 APOBEC3G (الابوليبوبروتين ب مرناً تحرير إنزيم الحفازة مثل ببتيد 3 ز) للتدخل مع إنتاج المستنسخات عكس الفيروسي6.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:743px;" width="743">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">293T cells</td>
			<td style="width:160px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-3216</td>
			<td style="width:209px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15150-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">HeraCell Vios 250i CO2 Incubator</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td>51030966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Laminar flow hood - CAS BioMAT2</td>
			<td style="width:160px;">Wolflabs</td>
			<td style="width:119px;">CAS001-C2R-1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">10mm TC-treated culture dish</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">TrypLE&#8482; Express (1x), Stable Trypsin Replacement Enzyme</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">OptiMEM&#174; (Minimal Essential Medium)</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31985-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3)</td>
			<td style="width:160px;">NIH Aids reagent program</td>
			<td style="width:119px;">114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Polyethylenimine (PEI) - MW:25000</td>
			<td style="width:160px;">PolySciences Inc</td>
			<td>23966-2</td>
			<td>dissolved at 1mg/ml and adjusted to pH7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">RQ1- Rnase free Dnase</td>
			<td style="width:160px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">M6101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Filter 0.22 &#956;m</td>
			<td style="width:160px;">Triple Red Limited</td>
			<td>FPE404025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">15 mL polypropylene tubes</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td>CLS430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Sucrose</td>
			<td style="width:160px;">Calbiochem</td>
			<td>573113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:160px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">344060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:160px;">Sorval</td>
			<td style="width:119px;">WX Ultra Series</td>
			<td>Th-641 Rotor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Alliance HIV-1 p24 antigen ELISA kit</td>
			<td style="width:160px;">Perkin Elmer</td>
			<td>NEK050001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">CEM-SS cells</td>
			<td style="width:160px;">NIH Aids reagent program</td>
			<td>776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Roswell Park Memorial Institute Medium</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31870-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">CoStar&#174; TC treated multiple well plates</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">CLS3513-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Benchtop centrifuge: Heraus&#8482; Multifuge&#8482; X3 FR</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td>75004536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">TX-1000 Swinging Bucket Rotor</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td>75003017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Microcentrifuge: 5424R</td>
			<td style="width:160px;">Eppendorf</td>
			<td>5404000060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Total DNA extraction kit (DNeasy Blood and Tissue kit)</td>
			<td style="width:160px;">Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Nuclease free H2O</td>
			<td style="width:160px;">Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Cutsmart buffer</td>
			<td style="width:160px;">New England Biolabs (part of DpnI enzyme)</td>
			<td style="width:119px;">R0176S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">DpnI restriction enzyme</td>
			<td style="width:160px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R0176S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Oligonucleotides for qPCR</td>
			<td style="width:160px;">MWG Eurofins</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>HPSF purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">TaqMan PCR Universal Mastermix</td>
			<td style="width:160px;">Thermo</td>
			<td>4304437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">LoBind Eppendorf&#174; tubes</td>
			<td style="width:160px;">Eppendorf</td>
			<td>30108078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Axygen&#8482; aerosol filter pipette tips, 1000 &#956;L</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td>TF-000-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Axygen&#8482; aerosol filter pipette tips, 200 &#956;L</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td>TF-200-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Axygen&#8482; aerosol filter pipette tips, 20 &#956;L</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td>TF-20-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Axygen&#8482; aerosol filter pipette tips, 10 &#956;L</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">TF-10-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">PCR clean hood</td>
			<td style="width:160px;">LabCaire</td>
			<td style="width:119px;">Model PCR-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">DynaMag&#8482;2-magnet</td>
			<td style="width:160px;">Thermo</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Streptavidin MagneSphere&#174; paramagnetic particles</td>
			<td style="width:160px;">Promega</td>
			<td>Z5481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Casein</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">37582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">End over end rotator, Revolver&#8482; 360&#176;</td>
			<td style="width:160px;">Labnet</td>
			<td style="width:119px;">H5600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tris-Base</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td>H1758-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">EDTA disodium salt dihydrate</td>
			<td style="width:160px;">Electran (VWR)</td>
			<td style="width:119px;">443885J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Dri-Block&#174; Analog Block Heater</td>
			<td style="width:160px;">Techne</td>
			<td>UY-36620-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">PCR tubes and domed caps</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td>AB0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">PCR machine</td>
			<td style="width:160px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">Mastercycler&#174; series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:160px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0202M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">40% Polyethylene glycol solution (PEG) in H2O, MW: 8000</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td>P1458-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Betaine solution, 5M</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td>B0300-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Gel loading buffer II (formamide buffer)</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td>AM8546G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Precast 6% TBE urea gels</td>
			<td style="width:160px;">Invitrogen</td>
			<td>EC6865BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Mini cell electrophoresis system</td>
			<td style="width:160px;">Invitrogen, Novex</td>
			<td>XCell SureLock&#8482;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tris/Borate/EDTA solution (10x)</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td>10031223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Needle 21 G x1 1/2</td>
			<td style="width:160px;">VWR</td>
			<td>613-2022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">SYBR Gold nucleic acid stain (10000x)</td>
			<td style="width:160px;">Life Technologies</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Dark Reader DR46B transilluminator</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td>NC9800797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ammonium acetate</td>
			<td style="width:160px;">Merck</td>
			<td>101116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">SDS solution 20% (w/v)</td>
			<td style="width:160px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">161-0418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Centrifuge tube filter</td>
			<td style="width:160px;">Appleton Woods</td>
			<td style="width:119px;">BC591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Filter Glass Fibre Gf/D 10mm</td>
			<td style="width:160px;">Whatman (VWR)</td>
			<td>512-0427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">polyadenylic acid (polyA) RNA</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td>10108626001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Glycogen, molecular biology grade</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td>R0561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Isopropanol (2-propanol)</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td>15809665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ethanol, molecular biology grade</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td>10041814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Accuprime&#8482; Supermix I (DNA polymerase premix)</td>
			<td style="width:160px;">Life Technologies</td>
			<td>12342-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">NEBNext&#174; Multiplex Oligo for Illumina (Index Primer Set 1 and 2)</td>
			<td style="width:160px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">E7335S; E7500S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Tapestation D1000 Screentape High sensitivity</td>
			<td style="width:160px;">Agilent Technologies</td>
			<td>5067- 5584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tapestation D1000 Reagents</td>
			<td style="width:160px;">Agilent Technologies</td>
			<td>5067- 5585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">2200 Tapestation - automated gel electrophoresis system</td>
			<td style="width:160px;">Agilent Technologies</td>
			<td>G2965AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Agencourt&#174; AMPure&#174; beads XP</td>
			<td style="width:160px;">Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Qubit&#8482; dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td style="width:160px;">Invitrogen</td>
			<td>Q32851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Qubit&#8482; 2.0 Fluorometer</td>
			<td style="width:160px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Topo&#8482; TA cloning Kit</td>
			<td style="width:160px;">Invitrogen</td>
			<td>450071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Sequencing platform: MiSeq System</td>
			<td style="width:160px;">Illumina</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:255px;">Experiment Manager (Sample sheet software)</td>
			<td style="width:160px;">Illumina</td>
			<td style="width:119px;">Note: Use TruSeq LT as a template</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Miseq&#8482; Reagent kit V3 (150 cycle)</td>
			<td style="width:160px;">Illumina</td>
			<td>MS-102-3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Sequencing hub: Basespace</td>
			<td style="width:160px;">Illumina</td>
			<td style="width:119px;">https://basespace.illumina.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ligase A: Thermostable 5&#8217; App DNA/RNA ligase</td>
			<td style="width:160px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0319S</td>
			<td style="width:209px;">Not used in this protocol, but tested in optimization process with results described in the discussion.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ligase B: T4 RNA ligase 1</td>
			<td style="width:160px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0204</td>
			<td style="width:209px;">Not used in this protocol, but tested in optimization process with results described in the discussion.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ligase C: CircLigase</td>
			<td style="width:160px;">Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">CL4111K</td>
			<td style="width:209px;">Not used in this protocol, but tested in optimization process with results described in the discussion.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining 3'-termini and sequences of nascent single-stranded viral dna molecules during hiv-1 reverse transcription in infected cells

رصد الحمض النووي وسيطة أثناء النسخ المتماثل الفيروس يوفر نظرة ثاقبة على آثار وآليات العمل من المركبات المضادة للفيروسات وبروتينات الخلية المضيفة في تركيب الدنا الفيروسي. هنا يمكننا معالجة النقص في التحليل يستند إلى الخلية وتغطية عالية وعالية الدقة قادرة على تحديد وسيطة النسخ العكسي للفيروس في سياق الفسيولوجية للإصابة بالفيروسات. يلتقط الأسلوب المبين في 3 '-تيرميني لجزيئات الحمض النووي (كدنا) تكميلية الوليدة داخل خلايا المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية-1 في القرار النوكليوتيدات واحدة. ينطوي البروتوكول حصاد خلية كله الحمض النووي، وتخصيب المستهدفة من الحمض النووي الفيروسي عن طريق القبض على الهجين، وربط محول، تجزئة المساحة بتنقية جل بكر التضخيم وتسلسل عميق، وتحليل البيانات. خطوة رئيسية هي ربط فعالة وغير منحازة لجزيئات محول لفتح تيرميني 3 '--الحمض النووي. تطبيق طريقة وصف يحدد وفرة النصوص عكس كل مدة معينة في نموذج معين. كما يوفر معلومات حول تسلسل (الداخلية) الاختلاف في النسخ العكسي وبالتالي أي طفرات محتملة. وبصفة عامة، التحليل مناسبة لأي أسئلة تتعلق بالحمض النووي 3 '-التمديد، شريطة أن يعرف تسلسل قالب.

Watch this Scientific Journal Video about Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells at JoVE.com

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

3 '-تيرميني وتسلسل الجزيئات الوليدة الدنا الفيروسي واحد-الذين تقطعت بهم السبل أثناء فيروس نقص المناعة البشرية-1 تحديد عكس النسخ في الخلايا المصابة

وهنا يقدم نهجاً تسلسل عميق الذي يوفر تصميم غير متحيزة الوليدة 3 '-تيرميني وكذلك الملامح حيث جزيئات الحامض النووي واحد-الذين تقطعت بهم السبل. التطبيق الرئيسي هو توصيف المعينة الوليدة مكملة للفيروسات الرجعية (كدناس)، المواد الوسيطة التي تم إنشاؤها أثناء عملية النسخ العكسي للفيروس.

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

هذه الطريقة الجديدة لتحليل النسخ العكسي يمكن أن تخبرنا أشياء جديدة حول مجال علم الفيروسات الرجعية. على سبيل المثال، يمكننا معرفة تفاصيل كيفية عمل عوامل القيود الخلوية أو كيف تمنع الأدوية المضادة للفيروسات العكوسة تخليق الحمض النووي لفيروس نقص المناعة البشرية 1. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن لا يوفر فقط معلومات حول تسلسل الوليدة عكس تران scrips، ولكنه يسمح برسم خرائط دقيقة لها 3-رئيس الدنا تيرميني في قرار ضيق النووية واحدة.يتم إثراء الحمض النووي الناسلي لفيروس نقص المناعة البشرية 1 من الحمض النووي الجملة للخلايا المصابة HIV1 ، عن طريق التقاط هجين وينبغي تنفيذه في محطة عمل PCR. إعداد مزيج رئيسي من الخرز streptavidin المغناطيسي عن طريق توجيه الأنابيب مائة ميكرولترات من الخرز لكل عينة في أنبوب واحد جهاز طرد مركزي صغير وضع الأنبوب على المغناطيس مناسبة لأنابيب أجهزة الطرد المركزي الصغيرة. بعد أن استقر الخرز نحو الجانب المغناطيسي من الأنبوب ، وإزالة المخزن العازلة ، وإزالة أنبوب من المغناطيس ، وإعادة تعليق الخرز في خمسمائة microliters من bindent غسل أو العازلة BW.وضع أنبوب مرة أخرى على المغناطيس، والانتظار للخرز إلى الهجرة إلى المغناطيس، وإزالة افر. إزالة أنبوب من المغناطيس، إضافة خمسمائة ميكرولترات من محلول الساليين، إعادة تعليق الخرز، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة عشر دقائق. بعد عشر دقائق، وغسل الخرز مع العازلة BW.وضع أنبوب مرة أخرى على المغناطيس، وإزالة عظمى وإعادة تعليق الخرز في خمسمائة ميكرولترات من العازلة BW. إضافة خمسين picomoles من كل القبض على أوليغنوكليد biotinylated في العينة الواحدة. احتضان في درجة حرارة الغرفة في حين هزاز في نهاية أكثر من خلاط نهاية لمدة ثلاثين دقيقة.المقبل، والعودة الأنبوب إلى المغناطيس، وإزالة عظمى، وإزالة أنبوب من المغناطيس، إضافة خمسمائة ميكرولترات من 1x عشرة العازلة، وإعادة تعليق الخرز. بعد غسل الثانية تعليق الخرز مع oligonucleotides شل الحركة في 10 ميكرولتردات من 1x عشرة العازلة لكل عينة. لكل عينة، تسمية أنبوب ميكروستروروج واحد وإضافة عشرة ميكرولترات من تعليق حبة، مائة وسبعين microliters من الحمض النووي، وتسعين microliters من 3x عشرة العازلة.احتضان في كتلة الحرارة الجافة في 92 درجة مئوية لمدة دقيقتين للطبيعة الحمض النووي. نقل الأنابيب إلى كتلة مختلفة الحرارة الجافة، والتي يتم تعيينها إلى 50 درجة مئوية، واحتضان لمدة ساعة واحدة. كل عشر دقائق خلال هذا الحضانة، عكس الأنابيب لخلط.عندما يتم الحضانة ساعة واحدة، وغسل الخرز مرة واحدة مع خمسمائة ميكروليتر من 1x عشرة العازلة، وإعادة تعليق في خمس وثلاثين microliters من المياه الحرة النوى. ضمان حبات تسوية جيدا عن طريق ترك الأنابيب على المغناطيس لمدة ثلاث دقائق تقريبا قبل إزالة أي سائل. إلى elute، احتضان الأنابيب في 92 درجة مئوية في كتلة الحرارة الجافة لمدة دقيقتين.ثم، بسرعة نقل الأنابيب على المغناطيس، أنبوب واحد في وقت واحد. بمجرد ربط الخرز إلى جانب الأنبوب ، قم بنقل المابير الذي يحتوي على الحمض النووي HIV1 إلى أنبوب جديد. لبدء هذا الإجراء، إعادة تعليق محول مسيل للشرب في 100 ميكرومولار في المياه الحرة النوكلاز ودوامة الأنبوب.لكل عينة، بالإضافة إلى عينة تحكم واحدة، والجمع بين نقطة الصفر أربعة مصغرة خمسة من 10x T4 الحمض النووي العازلة، وأربعة ميكرولترات من محول، ونقطة صفر خمسة ميكرولترات من المياه الحرة النوى. الحرارة إلى 92 درجة مئوية لمدة دقيقتين، ثم ندعه يبرد ببطء إلى ستة عشر درجة مئوية في جهاز PCR. وهذا سيسمح للمحول لتشكيل هيكل دبوس الشعر.الخطوة الرئيسية في هذا الإجراء هو ربط فعالة وغير منحازة من الجزيئات المكيفة لفتح 3-رئيس الدنا تيرميني. يتم ربط جزيئات cDNA الوليدة المنقية ذات الطول المتفاوت إلى محول حمض نووي واحد من دبوس الشعر الذي تقطعت به السبل باستخدام T4 DNA Ligase. محول يحمل عشوائية ستة تسلسل الباركود النيوكليوتيد، والذي يسمح لparing لتسهيل الربط، ويعمل في وقت واحد كمعرف لقرأات فريدة من نوعها.محول تيرميني 3-رئيس يحمل فاصل لمنع الربط الذاتي. لإعداد ستين microliter تفاعلات الربط الحجم النهائي، إضافة ما يلي إلى كل أنبوب PCR: ستة microliters من 10x T4 الحمض النووي العازلة، وأربعة وعشرين microliters من أربعون في المئة PEG، وستة ميكروليترز من خمسة مولور بيتاين، وأربع نقاط خمس ميكرولترات من محول، نقطة واحدة اثنين من microliters من T4 الحمض النووي ligase، وثمانية عشر نقطة 3000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 بعد خلط ردود الفعل بشكل جيد، احتضان في جهاز PCR في ستة عشر درجة مئوية بين عشية وضحاها.في اليوم التالي لأربطة المحولات، في ثلاثين microliters من الفورماميد التي تحتوي على الحمض النووي هلام تحميل العازلة لكل تفاعل ربط ومزيج جيد عن طريق توجيه الأنابيب. الحرارة في جهاز PCR في 94 درجة مئوية لمدة دقيقتين ثم وضعت على الفور على الجليد. الخطوة التالية هي الاستعداد ل denaturing هلام الكهرباء.وضع ما قبل المدلى بها ستة في المئة TBE denaturing اليوريا هلام بولياكريلاميد في خزان هلام المناسبة وإضافة 1x TBE تشغيل العازلة. تشغيل ما قبل هلام لمدة عشرين دقيقة. المقبل، واستخدام حقنة وإبرة قياس واحد وعشرين لغسل جيوب هلام مع تشغيل العازلة.ثم تحميل ثلاثين microliters في بئر من نفس العينة في ثلاثة آبار. من المستحسن تشغيل عينة واحدة فقط لكل هلام لتجنب التلوث عبر. تشغيل لمدة عشرين دقيقة.في حين أن هلام هو تشغيل، وإعداد ثلاثة نقطة صفر خمسة ملليلتر microcentrifuge أنابيب لكل عينة باستخدام إبرة حقنة قياس واحد وعشرين لكزة ثقوب في القاع. إدراج كل من أنابيب المعدة في أنبوب جهاز طرد مركزي صغير ملليلتر وتسمية لهم مع اسم العينة بالإضافة إلى منخفضة، أو متوسطة، أو عالية. عندما تكون جبهة الصبغة الزرقاء الداكنة في منتصف الطريق من خلال الجل ، أوقف الكهربائي وإزالة كاسيت الجل.نقب فتح الكاسيت وقطع هلام عموديا مع razorblade. لمعالجة الشريط بسخاء مع ثلاثة آبار من العينات المحملة. إضافة شريط هلام إلى حاوية مع 1x TBE وخمسة ميكرولترات من وصمة عار حمض السيانين النووي واحتضان لمدة ثلاث إلى خمس دقائق.ضمان تلطيخ كافية من أجل تحديد بسهولة الجزء العلوي من محول الحرة التي سيتم إزالتها في وقت لاحق. بعد ذلك، قم بتنظيف سطح الترانوميميناتور الضوء الأزرق بدقة مع المياه المقطرة دي المتأينة. ثم تأخذ قطعة هلام من حاوية تلطيخ ووضعها على مربع الضوء.بدوره على مربع الضوء وفحص الأحماض النووية الملطخة من خلال مرشح البرتقال. عينة الحمض النووي التمثيلية على هلام ملون، يظهر هنا. المحول عادة ما يبدو مثقلا ويعمل كما النقطة الكبيرة مع الحمض النووي HIV1 الربط تعمل فوق كشرائط.تشير الخطوط الحمراء إلى المواقع التي يجب قطع الجل فيها لإزالة المحول الحر ، وتقسيم العينة إلى ثلاث قطع زوجية. باستخدام razorblade جديدة، وقطع بعيدا الجانبين من هلام إذا كان هناك مناطق مع عدم وجود عينة محملة لا تزال موجودة. المقبل، وقطع فقط فوق محول لإزالة محول وانخفاض أجزاء هلام.وأخيرا، قطع بعيدا الجزء العلوي جدا من هلام بما في ذلك حوالي ملليمتر واحد من جيوب هلام التي غالبا ما يكون إشارة حادة مكثفة من الحمض النووي الوزن الجزيئي أعلى. تقسيم قطعة هلام المتبقية التي تحتوي على عينة أفقيا إلى ثلاث قطع حتى. مناطق منخفضة ومتوسطة وعالية الوزن الجزيئي.ثم، وقطع كل من شظايا هلام ثلاثة إلى اثنين من القطع مليمتر ونقلها إلى نقطة الصفر أعد خمسة أنابيب microcentuge ملليلتر. تدور في السرعة القصوى مع أغطية مفتوحة لمدة دقيقة واحدة. للضغط على القطع هلام من خلال ثقب في أنبوب ملليلتر اثنين لخلق طين هلام.إذا بقيت أي جزيئات هلامية في الجزء السفلي من أنبوب 5 ملليلتر نقطة صفر، نقلها إلى أنبوب مليلتر يدويا باستخدام إبرة. ابدأ إجراء استخراج الحمض النووي عن طريق إضافة ملليلتر واحد من عازلة استخراج هلام اليوريا إلى طين الجل في كل أنبوب microcentrifuge. تدوير الأنابيب مع نهاية على نهاية خلاط في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن ثلاث ساعات.إعداد أعمدة التصفية. استخدام مجموعة نظيفة من ملاقط لإضافة واحدة صغيرة جولة الألياف الزجاجية مرشح لكل عمود الطرد المركزي مع مرشحات غشاء خلات السليلوز، الذي يمنع انسداد الغشاء. وضع مرشح في مكان مع رأس أنبوب مقلوب تلميح.تدور لفترة وجيزة أنابيب ملليلتر مع جل slush واستخراج العازلة في microcentrifuge، ونقل سبعمائة ميكرولترات من السوبر إلى أعمدة مرشح المعدة. الطرد المركزي أعمدة التصفية في ميكروسنتريفوج في السرعة القصوى لمدة دقيقة واحدة. ثم نقل تدفق من خلال أنبوب جديد ملليلتر microcentrifuge.إعادة تحميل الأعمدة مع عظمى المتبقية. في محاولة للحصول على أكبر قدر ممكن من السائل من الخدود استخراج ولا تكون قلقة إذا يتم تضمين قطع هلام. تدور مرة أخرى.الجمع بين تدفق من خلال عينات الاستخراج نفسه والمضي قدما كما هو موضح في بروتوكول النص. وقد استخدم هذا البروتوكول في عينات من خلايا CEMS-ST المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 في حالة عدم وجود أو وجود بروتين مضاد للفيروسات العكوسة البشرية A3G. وتشير قطعة من العدد الإجمالي للقراءات الفريدة التي تم الحصول عليها من كل عينة إلى أن زيادة مستويات A3G تقلل من إجمالي عدد القراءات.تعكس تأثير المثبطة من A3G على النسخ العكسي توسطت cdna التوليف. في هذه المؤامرات الثلاثة التالية، يظهر جزء الجزيئات في كل طول ممكن في أول مائة وثمانين نيوكليوتيدات، في المدرجات اللونية الزرقاء. تكلفة إضافة A3G زيادة حادة من جزيئات cdna أقصر مبتورة في عدد قليل من المواقف القابلة للاستنساخ محددة جدا.الخطوط الحمراء المتقطعة، تظهر النسب المئوية من القراءات التي تحمل طفرات C إلى T في الموقف المعني. ويمكن إنتاج سيطرة إيجابية عن طريق تجهيز مجموعة من أوليغونوكليوتيدات الاصطناعية من معرفة تسلسل، وطول وتركيز. يجب أن تظهر جميع الجزيئات في ما يقرب من وفرة متساوية مع اختلافات صغيرة فقط.إذا كان تشغيل مكتبة ينتج تحيز طول طفيفة، في التسلسل، فإنه من المستحسن تطبيق عامل تطبيع الذي هو مشتق من المنحدر الذي يمثل التحيز حجم. يمكن تكييف هذا الإجراء بسهولة مع أنظمة أخرى حيث من شأن تحديد الأطراف الرئيسية الثلاثة لجزيئات الحمض النووي أن يضيف رؤى رئيسية في ارطان استقلاب الحمض النووي. يرجى عدم نسيان أن التعامل مع فيروس نقص المناعة البشرية يمكن أن يكون خطيرا للغاية وينبغي أن يتم تنفيذ بعض الإصابات فقط في مختبرات السلامة المعينة.

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

النسخ في المختبر فحوصات وتطبيقها في اكتشاف الأدوية

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

الاعتراف الخاصة بتسلسل وانتقائية بالكشف مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل على الكشف واحد-الذين تقطعت بهم السبل بتعديل كيميائيا الببتيد الأحماض النووية

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

إيمونوستينينج لإدخال تعديلات على الحمض النووي: التحليل الحسابي للصور [كنفوكل]

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

تحليل في الوقت الحقيقي النسخ عامل ملزم، النسخ والترجمة، ودوران لعرض الأحداث العالمية خلال التنشيط الهاتف الخلوي

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

بروتوكول لإنتاج ناقلات لينتيفيرال إينتيجراسي التي تفتقر لخروج المغلوب كريسبر/Cas9-بوساطة الجينات في تقسيم الخلايا

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

المراقبة على نطاق الجينوم من أخطاء النسخ في الكائنات الحية حقيقية النواة

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

التضخيم من القرب من كامل طول فيروس نقص المناعة البشرية-1 بروفيروسيس للجيل التالي التسلسل

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

عكس التحليل التضخيم متحاور حلقة تتوسط النسخ (RT-مصباح) للفيروس Zika والجينات التدبير المنزلي في البول والمصل، وعينات البعوض

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

شاشات الهجين واحد الخميرة المحسنة لتحديد عامل النسخ ملزمة لتسلسل الحمض النووي البشري

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

تحديد "معدل إخصاب البيض" من حيث دراسة استخدام "تقنية الخلوية الوراثية"

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...