Name: determining 3'-termini and sequences of nascent single-stranded viral dna molecules during hiv-1 reverse transcription in infected cells
Uploaded: 2019-01-30T14:00:00
Duration: 13 min 7 s
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提交人感谢 malim 实验室成员 luis Apolonia、jernej ule 和 rebecca oakey 的支持。作者感谢伦敦国王学院基因组中心的马特·阿诺和伦敦大学学院 (ucl) 的黛比·休斯, 下一代神经病学测序设施, 感谢他们在 miseq 测序运行方面提供的帮助。这项工作得到了英国医学研究理事会 (g1000196 和 mr/m00112/1 至 m. m.)、wellcome 信托基金 (10622z/z/z 至 m. m.)、欧洲联盟委员会第七个框架方案 (fp72007-2013) 的支持。piif-gaa-2012-329779 (至 d. p.) 和卫生部通过国家卫生研究所综合生物医学研究中心与伦敦国王学院和国王学院合作, 向盖伊和圣托马斯国家医疗服务体系基金会信托基金颁发了奖项。学院医院 nhs 基金会信托基金。

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提交人声明, 他们没有什么可披露的。

快速、可靠和经济高效的深度测序技术使生命科学领域的许多方面发生了革命性的变化, 使基于测序的分析具有很大的深度。剩下的挑战在于创新设计和创建具有代表性的测序库。在这里, 我们描述了一个捕获新生病毒 cdna 分子的协议, 特别是 hiv-1 逆转录酶过程的中间体。
在这一战略中最关键的一步是连接一个适配器开放 3 '-终端在数量和公正的方式。针对各种应用11、26、27、28、29,研究并优化了两个分子内和分子内的两个 ssdna 末端之间结扎的效率。选择在步骤3.3 所述条件下使用带有 t4 dna 连接酶的发夹适配器是经验优化的结果, 我们在实验中评估了不同的配体、适应剂和试剂, 用于合成寡核苷酸的结扎hiv-1 序列 (表 2) (未显示数据)。在这些体外试验反应中, 我们证实 t4 dna 连接酶介导了发夹适配器的结扎, 如郭等人所述. 11、具有非常低的偏置, 当适配器过度使用时, 可实现受体分子的接近完全结扎。结扎效率不受添加核苷酸序列的影响, 使适配器与多路引物系统兼容 (见图 4)。相比之下, 我们发现, 热稳定性 5dna/rna 连接酶 ("连接酶 a", 见材料表比较确切的结扎酶), 这是一种工程 rna 连接酶, 开发的部分原因是为了提高以 ssdna 为受体的结扎效率27, 确实比 rna 连接酶 ("连接酶 b") 更有效地结扎两个 ssdna 分子, 但有明显的偏差, 即使在单碱基长度差异的寡核苷酸之间, 结扎效率也有很强的差异 [表2;htp 中 g (a) 和 (b)]。此外, 我们发现与 "ligase c" 的反应中只有最小的偏差, 并与带有随机 5 '-终端 (一种用于抵消已知的 "ligase c" 核苷酸偏倚的策略) 的适配器结合使用. 30). 然而, "连接酶 c" 介导的分子间结扎不完整, 使 t4 dna 连接酶系统的首选。
在协议过程中的几个质量控制步骤以及包含积极和消极的控制, 可以在检测继续之前检测潜在问题, 并为故障排除工作提供指导。qpcr 2.2.2 和2.3.12 中的步骤进行量化, 以确保输入材料的数量充足。200μl 洗脱 (步骤 2.1) 中的典型 cdna 拷贝数从每μl 10, 000 到 300, 000 不等。混合捕获步骤可能会导致 hiv-1 cdna 总量的一些损失, 但应该会导致在细胞 dna 上的特定 hiv-1 cdna 的大量丰富, 这可以通过使用适当的引物来确定基因组 dna 在浓缩前后的或通过测量总 dna 浓度。在混合捕获步骤后恢复的 hiv-1 cdna 应至少占输入的10%。低起始材料可以解释一个成功的寡核苷酸阳性控制 (见步骤 3.3.2), 但只有有限的读数在样品中实现。总体读数低的原因还可能是由于没有 miseq 适配器的 dna 物种不相关, 高估了图书馆的浓度。这将导致低聚类密度, 并可以通过 qpcr 确定库中 hiv-1 序列的浓度, 以及通过荧光测定的总 dna 量来改进。由于该方法的高度敏感性, 应特别注意避免来自其他样品 (特别是高浓度控制寡核苷酸库存) 和实验室设备的甚至低水平的污染。在紫外线灭菌 pcr 工作站上工作在这方面是有益的。最终库的自动凝胶电泳 (步骤 6.1.2) 是进一步的质量控制措施。通常观察到的核酸大小范围在150至 500 nt 之间, 现在应该不存在 pcr 后和纯化前可在可选控制中检测到的底漆 (见步骤5.2 中的说明)。在一个具有代表性的结果中, 样本强度曲线的峰值在160到 170, 40nm 左右, 第二个更锐利的峰值在320至 350 nt 左右。这可能反映了经常看到的较高的丰度, 无论是相对较短 (1 至20nt 插入长度) 和全长强停 (180 至 182 nt 插入长度) (图 3b)。
虽然所提出的协议和选定的引物是特定于早期 hiv-1 逆转录酶结构, 该方法是普遍适用于任何研究, 旨在确定开放 3 '-终止的 dna。其他上下文中需要的主要修改将是混合捕获的方法和引物设计策略。例如, 如果要使目标适应后期的 hiv-1 转录, 在 cdna 长度内退火更多的不同生物基化寡核苷酸将是可取的, 并可能减少混合捕获步骤中的损失。正如在导言中提到的, 在设计检测 3 '-终端的范围时, 必须考虑到限制, 以避免不同的偏差源。首先, 如果带有适配器的模板长度差别很大, 则 pcr 反应可能会有偏差。其次, 此处使用的排序平台 (例如, miseq) 具有最佳聚类的首选插入长度范围, 并且可能无法以相同的效率对产品进行排序。在一定程度上, 这可以通过计算来解决, 就像通过计算线性长度偏置的修正系数所做的那样 (参见图 4, 下图)。但是, 如果需要 3 '-终端映射的区域很长 (> 1000 nt), 则更建议将反应与结扎的文字记录分开, 并使用多个上游引物来评估部分中的 3 '-终端。
分析程序是在内部编写的, 其具体目的是分析与固定适配器序列相邻的 hiv-1 序列的最后一个核苷酸, 以及所有碱基的基部变异, 以识别任何突变。各个步骤包括以下几个步骤: 首先, 使用快速0.0.13 工具包对适配器序列进行修剪;然后, 删除复制的任何序列 (表示包含条形码的相同序列)。然后使用 bowtie (http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml) 将所有剩余的唯一读取与 hiv-1 序列对齐, 最大不匹配设置在三个碱基。模板序列由 hiv-1 cdna (nl4.3 菌株) 的前635吨组成, 其中包括-sss 序列和第一个链转移产品, 直至 polypurine 轨道 (u5-r-u3-ppt; 见图 1)。因此, 所提供的软件和模板只有在该方法用于同一应用时才直接适用 (检测 hiv-1nl4.3 的早期反录)。必须对其他目标序列进行调整。每个读取的 3 '-终端的位置由对齐中的位置决定。记录每个位置的基本调用, 并根据每个基数的总覆盖率计算变异率, 这一点各不相同, 因为读取长度不同, 而在 read2 中的125个基测序可能并不完全覆盖长的插入。
最后, 我们认为所描述的方法是许多类型研究的宝贵工具。明显的应用包括通过抗逆转录病毒药物或细胞限制因子对逆转录酶抑制的机制进行研究。然而, 只需要进行相对较小的调整, 就需要使系统适应其他单链 dna 病毒中间体中的 3 '-末端图谱, 例如, 在细小病毒复制中存在这种情况。此外, 该方法的原理, 特别是其优化的结扎步骤, 可以为图书馆准备设计的核心部分提供任何 3 '-dna 延伸的表征, 包括由细胞双链 dna 催化的伸长率聚合 酶。

为了充分剖析和理解病毒复制, 需要越来越精细的技术来捕获复制中间体。特别是, 在受感染细胞的背景下, 病毒核酸物种的精确定义可以提供新的见解, 因为许多病毒复制机制迄今已在孤立的体外反应中进行了检查。一个很好的例子是逆转录酶病毒的逆转录化过程, 如人体免疫缺陷病毒 1 (hiv-1)。hiv-1 逆转录酶的各个步骤, 在这期间, 病毒酶逆转录酶 (rt) 将单链 rna 基因组复制到双链 dna 中, 主要研究了纯化蛋白质和细胞核的引物扩展分析酸1,2,3,4,5。虽然确立了基本原则, 但这种检测并不包括所有病毒和细胞成分, 也可能不反映相关因素的生物学相关化学因素。因此, 我们设计了一种强大的技术来确定逆转录酶中间体的光谱, 它们的精确 cdna 3 '-终端 (即, 确定它们的确切长度) 和核苷酸序列在生活感染的背景下单元格6。从时间过程实验中收集的数据可用于比较各种条件下的记录的概况, 例如抗病毒分子或蛋白质的存在, 这些条件可能会影响 dna 合成的效率和可扩展性,积累。这使得人们能够更详细地了解自然病原体的生命周期, 这往往是有针对性的药物设计和成功的治疗干预的基础。
hiv-1 逆转录酶包括一系列连续的事件, 由 rna 引物退火到基因组 rna 模板, 然后由 rt 扩展, 以产生一个短的单链 cdna 转录, 称为微链强停 (-sss) (见图 1)。随后,-sss cdna 从 5 ' 长的末端重复 (ltr) 转移到基因组 rna 的 3 '-ltr, 在那里它退火并作为引物继续 rt 介导的延伸的减去链 dna (见评论逆转录酶 1,2,3 个,4). 第一次链转移是逆转录酶的限速步骤之一;因此,-ss cdna 是已知的积累。图 2a概述了在受感染细胞中捕获逆转录酶产品的基本工作流程和库设计。协议中使用并在表 1中列出的特定引物和分析设置的目标是所有早期逆转录酶中间体, 长度在 23 ~ 650 nt 之间, 其中包括180-182 分 sss dna。然而, 对该策略的适当的小调整将允许应用于不仅是晚期逆转录酶产物, 还有其他病毒和系统, 其目的是检测含有 dna 末端的 3 '-oh。需要考虑的重要限制包括库中最终 pcr 产品的长度范围;特别是, 开放 3 '-终端上的适配器与上游引物站点之间的距离超过 ~ 1000 nt 的模板可能会降低排序效率, 这可能会在图书馆准备过程中引入误导性的技术偏差 (有关更多详细信息和适应建议, 请参阅讨论)。
此前报道的系统测定核酸链 3 '-末端的技术主要集中在 rna, 而不是 dna, 分子。一个例子是 3 ' race (快速扩增 cdna 末端) 7, 它依赖于 mrna 的多腺化。此外, 还开发了采用 rna 脂质的适配器连接策略, 其中包括 rlm-race (rna 配体介导的 race) 8 或 lace (基于配体的 cdna 末端扩增)9。重要的是要强调的是, 基于结扎的放大是敏感的任何偏见引入的结扎反应本身。例如, 结扎的效率可能或多或少取决于 3 ' 位置、序列、总分子长度或局部结构中的特定核苷酸。这种连接酶偏好导致分子的不完全捕获和读数中的曲解, 我们和其他人已经观察到9,10.为了最大限度地减少在本文所述协议中的适配器添加步骤中的结扎偏差, 我们测试了一些结扎策略, 并发现使用 t4 dna 连接酶与发夹单链 dna 适配器 (如郭文等人所述).11) 是唯一的程序与接近定量结扎没有导致显著差异的结扎效率时, 评估与一套专门选择的控制寡核苷酸6。因此, 选择这种结扎策略是本协议成功的一个关键特征。
迄今为止, 对感染细胞中 hiv-1 rt 进展的监测主要是通过使用定量 pcr (qpcr) 测量不同长度的逆转录酶品来完成的, 这些逆转录酶链仪使用原始探针集, 以独特地测量短时间或更长的时间 (早期和早期和早期)(分别为) cdna 产品12、13、14。虽然这种 qpcr 方法适合于确定细胞系统中逆转录酶过程的内在效率, 但输出的分辨率相对较低, 没有获得序列信息。我们的新方法基于优化的适配器结扎、pcr 介导的库生成和深度测序, 解决了技术差距, 并为定量和单核苷酸时监测 hiv-1 感染期间的逆转录酶提供了机会分辨率。
我们已经说明了这种方法的效用, 在一项研究中, 区分了两个拟议的模型的能力的 hiv-1 限制因子 apobec3g (载脂蛋白 b mrna 编辑酶催化多肽类似 3g) 干扰6.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:743px;" width="743">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">293T cells</td>
			<td style="width:160px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-3216</td>
			<td style="width:209px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15150-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">HeraCell Vios 250i CO2 Incubator</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td>51030966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Laminar flow hood - CAS BioMAT2</td>
			<td style="width:160px;">Wolflabs</td>
			<td style="width:119px;">CAS001-C2R-1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">10mm TC-treated culture dish</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">TrypLE&#8482; Express (1x), Stable Trypsin Replacement Enzyme</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">OptiMEM&#174; (Minimal Essential Medium)</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31985-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3)</td>
			<td style="width:160px;">NIH Aids reagent program</td>
			<td style="width:119px;">114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Polyethylenimine (PEI) - MW:25000</td>
			<td style="width:160px;">PolySciences Inc</td>
			<td>23966-2</td>
			<td>dissolved at 1mg/ml and adjusted to pH7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">RQ1- Rnase free Dnase</td>
			<td style="width:160px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">M6101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Filter 0.22 &#956;m</td>
			<td style="width:160px;">Triple Red Limited</td>
			<td>FPE404025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">15 mL polypropylene tubes</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td>CLS430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Sucrose</td>
			<td style="width:160px;">Calbiochem</td>
			<td>573113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:160px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">344060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:160px;">Sorval</td>
			<td style="width:119px;">WX Ultra Series</td>
			<td>Th-641 Rotor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Alliance HIV-1 p24 antigen ELISA kit</td>
			<td style="width:160px;">Perkin Elmer</td>
			<td>NEK050001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">CEM-SS cells</td>
			<td style="width:160px;">NIH Aids reagent program</td>
			<td>776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Roswell Park Memorial Institute Medium</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31870-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">CoStar&#174; TC treated multiple well plates</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">CLS3513-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Benchtop centrifuge: Heraus&#8482; Multifuge&#8482; X3 FR</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td>75004536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">TX-1000 Swinging Bucket Rotor</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td>75003017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Microcentrifuge: 5424R</td>
			<td style="width:160px;">Eppendorf</td>
			<td>5404000060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Total DNA extraction kit (DNeasy Blood and Tissue kit)</td>
			<td style="width:160px;">Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Nuclease free H2O</td>
			<td style="width:160px;">Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Cutsmart buffer</td>
			<td style="width:160px;">New England Biolabs (part of DpnI enzyme)</td>
			<td style="width:119px;">R0176S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">DpnI restriction enzyme</td>
			<td style="width:160px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R0176S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Oligonucleotides for qPCR</td>
			<td style="width:160px;">MWG Eurofins</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>HPSF purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">TaqMan PCR Universal Mastermix</td>
			<td style="width:160px;">Thermo</td>
			<td>4304437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">LoBind Eppendorf&#174; tubes</td>
			<td style="width:160px;">Eppendorf</td>
			<td>30108078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Axygen&#8482; aerosol filter pipette tips, 1000 &#956;L</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td>TF-000-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Axygen&#8482; aerosol filter pipette tips, 200 &#956;L</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td>TF-200-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Axygen&#8482; aerosol filter pipette tips, 20 &#956;L</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td>TF-20-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Axygen&#8482; aerosol filter pipette tips, 10 &#956;L</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">TF-10-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">PCR clean hood</td>
			<td style="width:160px;">LabCaire</td>
			<td style="width:119px;">Model PCR-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">DynaMag&#8482;2-magnet</td>
			<td style="width:160px;">Thermo</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Streptavidin MagneSphere&#174; paramagnetic particles</td>
			<td style="width:160px;">Promega</td>
			<td>Z5481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Casein</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">37582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">End over end rotator, Revolver&#8482; 360&#176;</td>
			<td style="width:160px;">Labnet</td>
			<td style="width:119px;">H5600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tris-Base</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td>H1758-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">EDTA disodium salt dihydrate</td>
			<td style="width:160px;">Electran (VWR)</td>
			<td style="width:119px;">443885J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Dri-Block&#174; Analog Block Heater</td>
			<td style="width:160px;">Techne</td>
			<td>UY-36620-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">PCR tubes and domed caps</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td>AB0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">PCR machine</td>
			<td style="width:160px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">Mastercycler&#174; series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:160px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0202M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">40% Polyethylene glycol solution (PEG) in H2O, MW: 8000</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td>P1458-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Betaine solution, 5M</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td>B0300-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Gel loading buffer II (formamide buffer)</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td>AM8546G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Precast 6% TBE urea gels</td>
			<td style="width:160px;">Invitrogen</td>
			<td>EC6865BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Mini cell electrophoresis system</td>
			<td style="width:160px;">Invitrogen, Novex</td>
			<td>XCell SureLock&#8482;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tris/Borate/EDTA solution (10x)</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td>10031223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Needle 21 G x1 1/2</td>
			<td style="width:160px;">VWR</td>
			<td>613-2022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">SYBR Gold nucleic acid stain (10000x)</td>
			<td style="width:160px;">Life Technologies</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Dark Reader DR46B transilluminator</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td>NC9800797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ammonium acetate</td>
			<td style="width:160px;">Merck</td>
			<td>101116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">SDS solution 20% (w/v)</td>
			<td style="width:160px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">161-0418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Centrifuge tube filter</td>
			<td style="width:160px;">Appleton Woods</td>
			<td style="width:119px;">BC591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Filter Glass Fibre Gf/D 10mm</td>
			<td style="width:160px;">Whatman (VWR)</td>
			<td>512-0427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">polyadenylic acid (polyA) RNA</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td>10108626001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Glycogen, molecular biology grade</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td>R0561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Isopropanol (2-propanol)</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td>15809665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ethanol, molecular biology grade</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td>10041814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Accuprime&#8482; Supermix I (DNA polymerase premix)</td>
			<td style="width:160px;">Life Technologies</td>
			<td>12342-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">NEBNext&#174; Multiplex Oligo for Illumina (Index Primer Set 1 and 2)</td>
			<td style="width:160px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">E7335S; E7500S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Tapestation D1000 Screentape High sensitivity</td>
			<td style="width:160px;">Agilent Technologies</td>
			<td>5067- 5584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tapestation D1000 Reagents</td>
			<td style="width:160px;">Agilent Technologies</td>
			<td>5067- 5585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">2200 Tapestation - automated gel electrophoresis system</td>
			<td style="width:160px;">Agilent Technologies</td>
			<td>G2965AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Agencourt&#174; AMPure&#174; beads XP</td>
			<td style="width:160px;">Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Qubit&#8482; dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td style="width:160px;">Invitrogen</td>
			<td>Q32851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Qubit&#8482; 2.0 Fluorometer</td>
			<td style="width:160px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Topo&#8482; TA cloning Kit</td>
			<td style="width:160px;">Invitrogen</td>
			<td>450071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Sequencing platform: MiSeq System</td>
			<td style="width:160px;">Illumina</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:255px;">Experiment Manager (Sample sheet software)</td>
			<td style="width:160px;">Illumina</td>
			<td style="width:119px;">Note: Use TruSeq LT as a template</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Miseq&#8482; Reagent kit V3 (150 cycle)</td>
			<td style="width:160px;">Illumina</td>
			<td>MS-102-3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Sequencing hub: Basespace</td>
			<td style="width:160px;">Illumina</td>
			<td style="width:119px;">https://basespace.illumina.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ligase A: Thermostable 5&#8217; App DNA/RNA ligase</td>
			<td style="width:160px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0319S</td>
			<td style="width:209px;">Not used in this protocol, but tested in optimization process with results described in the discussion.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ligase B: T4 RNA ligase 1</td>
			<td style="width:160px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0204</td>
			<td style="width:209px;">Not used in this protocol, but tested in optimization process with results described in the discussion.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ligase C: CircLigase</td>
			<td style="width:160px;">Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">CL4111K</td>
			<td style="width:209px;">Not used in this protocol, but tested in optimization process with results described in the discussion.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining 3'-termini and sequences of nascent single-stranded viral dna molecules during hiv-1 reverse transcription in infected cells

在病毒复制过程中对核酸中间体进行监测, 可深入了解抗病毒化合物和宿主细胞蛋白对病毒 dna 合成的作用及其机制。在这里, 我们解决缺乏一种基于细胞的、高覆盖率和高分辨率的检测方法, 该检测方法能够在病毒感染的生理环境中定义抗逆转录病毒逆转录酶中间体。所述方法在单核苷酸分辨率下捕获 hiv-1 感染细胞中新生互补 dna (cdna) 分子的 3 '-末端。该协议涉及采集整个细胞 dna、通过混合捕获有针对性地浓缩病毒 dna、适应结扎、通过凝胶纯化进行大小分馏、pcr 扩增、深度测序和数据分析。一个关键的步骤是有效和无偏见的结扎适配器分子打开 3 '-dna 终端。所描述的方法的应用决定了给定样本中每个特定长度的反向文字记录的丰度。它还提供了关于 (内部) 序列变化的信息, 在反写文字记录, 从而任何潜在的突变。一般来说, 该检测适用于与 dna 3 '-扩展相关的任何问题, 前提是模板序列是已知的。

本文中描述的技术被应用于更广泛的研究, 以解决抗逆转录病毒人类蛋白 apodec3g (a3g)6抑制 hiv-1 逆转录酶的机制。图 3显示了在没有或不存在 a3g 的情况下, 在感染病毒缺乏hiv-1 的 cem-ss t 细胞样本中使用该协议后获得的具有代表性的结果。图 3a绘制了在筛选出具有相同的6个条形码和相同长度 (由提供的分析软件执行) 的任何 pcr 重复项后从每个样本中获得的唯一读取总数。a3g 水平的增加减少了反映 a3g 对 rt 介导的 cdna 合成的抑制作用的总读取量, 此前由 qpcr6、13、21、22描述和测量。在图 3b 中, 显示了前 182 nt 内每个可能长度的分子的分数。对于在没有 a3g 的情况下感染 hiv-1 病毒, 最丰富的物种是主要的180分强阻分子本身, 在较短的范围内 (23 至40分) (上图, 蓝色直方图) 中积累了一些读数。a3g 的加入改变了这一轮廓, 因为在检测到几个非常具体、可重复的位置 (中、下图) 的短、截断的 cdna 分子急剧增加。由于 a3g 是一种胞苷脱氨酶, 当 a3g 存在于感染病毒21、23、24时, cdna 中的胞苷-尿嘧啶 (被识别为 c 到 t) 突变发生。利用所获得的测序信息, 在同一图 (红色虚线) 上绘制了 c 到 t 突变的百分比。应该注意的是, 突变剖面来自所有独特的读数组合和每个核苷酸的覆盖范围将有所不同。然而, 如果所需的序列信息可以与每个分子相关, 并与特定的 3 '-终点相关。所提供的数据来自 pollpeter等人.6和突变与 cdna 长度分布之间的相关性被证明是由于检测和裂解的脱层 cdna 由细胞 dna 修复机械。
通过处理已知序列、长度和浓度的合成寡核苷酸池, 可以很容易地对 3 '-映射方法进行阳性控制。此控件在步进的适配器连接处添加3.3.2 并建议包含在所有多路复用库中。从对照样本获得的数据应具有预期输入比率的所有寡核苷酸, 只有非常小的背景读取。图 4显示了17个化学合成寡核苷酸的阳性控制集的结果 (对于序列, 见表 2), 这些结果按等量比混合。正如所料, 所有的分子都出现在接近相同的丰度, 只有很小的变化 (上图)。虽然在-ss dna 序列中没有寡核苷酸回归零读数计数的大多数位置, 我们观察到的小物种比实际对照寡核苷酸短1或2。我们没有进一步调查这些小物种, 但假定它们代表了可能存在于所提供的寡核苷酸种群中的降解或不完整产品 (寡核苷酸被订购为高效液相色谱纯化,纯度为 80%)。下图显示了来自不同库运行的控制样本, 其中17个寡核苷酸之间的变化略高, 并且与总长度相关, 因为较长的控制分子的检测效率比较短的分子更高。这可能是由于在 pcr 反应或在 miseq 测序过程中的聚类分析中稍有偏差, 而 mseq 测序的插入尺寸是最佳的, 并且可能发生在具有特别宽的插入范围的库中。解决这种偏差的一个基本方法是应用基于斜率的归一化因子, 该斜率指示与分子长度 (粉红色线) 相关的偏置。所需的计算包括在分析程序中 (请参阅协议中的步骤 8.3)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58715/58715fig1.jpg"> 图 1:显示 hiv-1 逆转录酶的第一步的图表.这个过程从 tRNA(Lys,3) (橙色) 退火到基因组病毒 rna (步骤 1) 中的引物结合位点 (pbs) 开始, 它允许病毒 cdna 的启动和伸长 (蓝色, 步骤 2)。同时, 模板基因组 rna 被 rt 的 rnaseh 活性降解 (第3步)。逆转录酶过程中的第一个完整中间体是微链-停止 (-) sss cdna, 当 rt 催化聚合到达 grna 重复区域的 5 '-终点 (步骤 3) 时完成。(-) sss 中间体通过退火到互补的 3 ' 长的末端重复 (ltr) r 区域, 转移到基因组 rna 模板的 3 '-末端。从这里开始, 聚合继续 (第4步)。在所述方法中, 逆转录酶的进展是通过映射新生病毒 cdna (蓝色) 的确切长度来确定的。ppt, 聚吡咯道;u5, 唯一的 5 '-序列;u3, 唯一的 3 '-序列。此数字将从以前的出版物6中重新发布。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58715/58715fig1large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58715/58715fig2v3.jpg"> 图 2: 适配器结扎和 pcr 扩增策略的工作流程大纲和原理图.(a) 工作流程概述了所述技术的主要步骤, 以确定受感染细胞中 hiv-1 逆转录病毒文字记录的 3 '-终端。该图改编自以前的一份出版物6。(b) 适配器结扎原理图和 pcr 扩增策略。在前面的步骤中纯化的不同长度的鼻腔 cdna 分子被连接到使用 t4 dna 连接酶的单链 dna 适配器上。发夹适配器 (名为 "完整的郭 + 三塞", 见表 1) 的设计灵感来自郭等人. 11. 适配器带有一个随机的6nt 条形码序列, 允许基对, 以方便连接, 同时作为唯一读取的标识符。适配器的 3 '-终端带有一个间隔器 (spc3), 以防止自结扎。通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (page) 将结扎产物从多余的适配器中分离出来。凝胶中的核酸被染色, 并切割成三个独立的, 大小相等的凝胶件在该区域从上面的适配器, 以及在25.在洗脱、沉淀和再悬浮后, 产品通过引物退火扩增到适配器的已知序列 (引物1、多路寡核苷酸试剂盒, 见材料表) 和携带 hiv-1 前22分的底漆5 '-ltr 序列紧跟 trna (引物 2, mp1.0 + 22hiv)。所选引物的 5 '-终端携带所选测序平台 (p5 和 p7) 的适配器以及在同一库中运行的单个样本的索引序列。指出了测序读取引物的起点。蓝色框表示感兴趣的区域, 以确定捕获的分子的原始 3 '-终端。这一数字改编自以前的一份出版物6。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58715/58715fig2v3large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58715/58715fig3.jpg"> 图 3: 具有代表性的结果.(a) 使用所述议定书处理的代表性样品的读总数。这包括所有被确定为 hiv-1 分子的唯一读取的序列, 其 3 '-末端在负链 cdna 的前635分 (直到 ppt, 见图 1)。感染 hiv-1 不携带 a3g 产生的读取次数最多, 而 a3g 抑制 cdna 合成, 从而减少总读取计数。未感染的细胞起到了负面控制的作用, 而一组合成寡核苷酸则提供了积极的控制。b) hiv-1nl4.3序列 (x 轴) 的位置23和 182 (全长-sss cDNAs 为180至 182 nt) 之间的每个长度的 cDNAs 相对丰度以蓝色直方图显示 (左 y 轴上的刻度)。cdna 的相对丰度是根据-sss cdna 序列中终止于给定核苷酸的序列的绝对数量计算的, 除以测量182nt 或更少的所有读数的总和。在虚线中显示的红线是在相应位置 (右 y-轴上的刻度) 携带 c 到 tmu 突变的读取的百分比。图 3b从以前的出版物6中重新发布。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58715/58715fig3large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58715/58715fig4.jpg"> 图 4: 具有代表性的控制样本结果.对于含有17种不同长度的合成寡核苷酸的等色量的池, 显示了两个剖面。这些寡核苷酸的序列来自 hiv-1nl4.3,并被选择用于覆盖不同的长度, 并将所有4个碱基呈现为 3 '-核苷酸 (见表 2)。上图显示了图 3a中的正控制样本。没有明显的偏置分子长度或开放 3 '-终端被检测到。底部图显示了不同的库运行, 这在排序上产生了轻微的长度偏差。在这种情况下, 建议应用归一化因子, 该因子是从表示大小偏差的斜率 (以粉红色显示) 派生的。此数字将从以前的出版物6中重新发布。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58715/58715fig4large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">奥利戈名称</td>
			<td>长度 (单位)</td>
			<td colspan="12">序列</td>
			<td colspan="2">目的</td>
			<td colspan="2">制造商 (净化)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">完整的郭 + 三塞</td>
			<td>61</td>
			<td colspan="12">5 '-pho-tgagaggaggtagttagtcgtknnnngtgggccgaggcacctc-spc3-3 '</td>
			<td colspan="2">适配器</td>
			<td colspan="2">idt dna 技术 (hplc)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">2xBiotin ss 诱饵</td>
			<td>40</td>
			<td colspan="12">5 '-biotin-cagtggggg割塔卡</td>
			<td colspan="2">混合捕获</td>
			<td colspan="2">mwg eurofins (hplc)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">生物素 1-16 ss</td>
			<td>22</td>
			<td colspan="12">5 '-cagtgtggggaatctttagag-biteg-3 '</td>
			<td colspan="2">混合捕获</td>
			<td colspan="2">mwg eurofins (hplc)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">生物素 trna + ctg</td>
			<td>16</td>
			<td colspan="12">5 '-cagggccccccgcga-biteg-3 '</td>
			<td colspan="2">混合捕获</td>
			<td colspan="2">mwg eurofins (hplc)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">mp1.0 + 22hiv</td>
			<td>82</td>
			<td colspan="12">5 '-aatgatggggggacgacgactcttctccctcccacgctctctcgatctagatctagtcactcactg-3 '</td>
			<td colspan="2">pcr 扩增</td>
			<td colspan="2">mwg eurofins (hplc)</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: 所述协议中使用的寡核苷酸表, 包括长度、序列和修改.该表格改编自以前的出版物6。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58715/Table1_Pollpeter.xlsx" target="_blank">请点击这里下载此表作为 excel 文件.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">奥利戈名称</td>
			<td>长度 (单位)</td>
			<td colspan="12">序列</td>
			<td colspan="2">制造商 (净化)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">htp con long c</td>
			<td>1120</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="6">5 '-cggagagattacactacactacactacactactactactaagtgtggggggggtgtgtgtgtagtagtacacacacgggtccttcttagttagta-3 '</td>
			<td colspan="2">mwg eurofins (hplc)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">htp con long g</td>
			<td>119</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="6">5 '-cggagagattacactacactacactactactactacttaagtgggggggggggtggtgtgtagtagtacacacacacgggtccttcttagtagtagtagttagtagttagtagta-3 '</td>
			<td colspan="2">mwg eurofins (hplc)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">htp con long t</td>
			<td>116</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="6">5 '-cggtagagattactactactactactactactactaagtgtgggggggggggtggtggtgtagtagtacacacacacacactttgggtgtcactctttttttttt-3 '</td>
			<td colspan="2">mwg eurofins (hplc)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">htp con long a</td>
			<td>118</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="6">5 '-cggagagattactacactacactactactactacttaagtggggggggggggtgtgtgtagtagtagtacacacacacgggtccttctctagttaga-3 '</td>
			<td colspan="2">mwg eurofins (hplc)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">htp con 中 c</td>
			<td>76</td>
			<td colspan="12">5 '-ctggagagattattacacgacgactaaagtgggtgtgtgtgtgtgttagttagtagacacacgcacgcacgcaccacc-3 '</td>
			<td colspan="2">mwg eurofins (hplc)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">htp con 中 g (a)</td>
			<td>71</td>
			<td colspan="12">5 '-cgggagagattacacacgactaaagtggggggggtggtgtgtgttagtagtacacacacacacacacacacacacga-3 '</td>
			<td colspan="2">mwg eurofins (hplc)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">htp con 中 g (b)</td>
			<td>72</td>
			<td colspan="12">5 '-cgggagattattacacacgtaaagtgggggtggtgtgtgtgttagtagtagacacacacaggggc-3 '</td>
			<td colspan="2">mwg eurofins (hplc)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">htp con a 中</td>
			<td>69</td>
			<td colspan="12">5 '-cgggagagattattacacactaaagtgtggtggtgtgtgtgtgttagtagtcacacacacacacaga-3 '</td>
			<td colspan="2">mwg eurofins (hplc)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">htp con 中 t</td>
			<td>85</td>
			<td colspan="12">5 '-cgggagagattattacacacgacgactaaagtggggggtggtgtgtgtgtgtgttagtacacacacacacacacacacacacactt-3 '</td>
			<td colspan="2">mwg eurofins (hplc)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">htp con short a</td>
			<td>40</td>
			<td colspan="12">5 '-cggggagattattccacactataagtgggggggggggggggga-3 '</td>
			<td colspan="2">mwg eurofins (hplc)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">htp con short t</td>
			<td>33</td>
			<td colspan="12">5 '-ctggagagattttacacacgactaagggt-3 '</td>
			<td colspan="2">mwg eurofins (hplc)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">htp con short g</td>
			<td>41</td>
			<td colspan="12">5 '-cggggagattattccacactaaagtgggggggggggggg3-3 '</td>
			<td colspan="2">mwg eurofins (hplc)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">htp con short c</td>
			<td>34</td>
			<td colspan="12">5 '-ctggagagattttacacacgtaagtaagtc-3 '</td>
			<td colspan="2">mwg eurofins (hplc)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">htp con 46 (t)</td>
			<td>46</td>
			<td colspan="12">5 '-ctggagagattatttccacactg actaagtgggggggtctct-3 '</td>
			<td colspan="2">mwg eurofins (hplc)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">htp con 83 (c)</td>
			<td>83</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="7">5 '-cgggagattattattattacactg actaagtgggggggggtggtgtgtgtgttagtagtacacacacacacacacacacacacacacacacacacactc-3 '</td>
			<td colspan="2">mwg eurofins (hplc)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">htp con 103 (c)</td>
			<td>103</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="6">5 '-cgggagagattattccacactg actaagtggggggggggggggggggggggggggtacacacggcacacactttgactactactactactactactattcactactactactactactactactactactactactactattattatttattactactactactactactactactactactactactactcactcactcactcactcactactactactactattactactactactactactactactacttachtactactactactactac</td>
			<td colspan="2">mwg eurofins (hplc)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">htp con 107 (a)</td>
			<td>107</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="6">5 '-cgggagattattattattacactg actaagtgggggggggggggggggggtgtgtagtacacacacacgggcacactttttgcactctttttt3 '</td>
			<td colspan="2">mwg eurofins (hplc)</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2: 作为阳性对照样品的17个合成对照寡核苷酸表.前13个寡核苷酸是根据大小 [长 (116 至120非)、中 (69 至 85 t)、短 (33 至 41 nt)] 以及它们的 3 '-末端选择的。该表格改编自以前的出版物6。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58715/Table2_Pollpeter.xlsx" target="_blank">请点击这里下载此表作为 excel 文件.</a>

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Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

hiv-1 反向转录过程中鼻部单链病毒 dna 分子的 3 '-特米尼和序列的测定

在这里, 我们提出了一个深度测序方法, 提供了一个公正的确定新生 3 '-终端以及突变的分布的单链 dna 分子。主要应用是对新生的抗逆转录病毒补充 dna (cDNAs) 的表征, 这是在逆转录病毒逆转录酶过程中产生的中间体。

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

这种分析逆转录的新方法可以告诉我们关于逆转录病毒学领域的新事物。例如，我们可以了解细胞限制因子如何起作用的细节，或者抗逆转录病毒药物如何抑制HIV1 DNA合成。这项技术的主要优点是，不仅提供了有关纳纳宁反向Tran Scrips序列的信息，而且它允许以单核紧密分辨率绘制其精确的3个主DNA术语。HIV1免费DNA的扩充来自HIV1感染细胞的DNA批发，通过混合捕获完成，应在PCR工作站中进行。准备磁链球菌珠的主混合，通过管道将每个样品的一百微升珠头放入单个微型离心管中，将管放在适用于微型离心管的磁铁上。磁珠朝管的磁侧安顿下来后，取出存储缓冲液，从磁铁上取出管子，并在五百微升的压箱洗涤或 BW 缓冲液中重新悬浮珠子。将管子放回磁铁上，等待磁珠迁移到磁铁，然后取出上一液。从磁铁上取下管子，加入五百微升的卡明溶液，重新悬浮珠子，并在室温下孵育十分钟。十分钟后，用BW缓冲液清洗珠子。将管子放回磁铁上，取出上流液，在五百微升的BW缓冲液中重新悬浮珠子。每个样品添加每个捕获的生物基化寡核苷酸的五十个皮莫。在室温下孵育，同时在结束搅拌机上摇摆30分钟。接下来，将管子返回磁铁，取出上流板，从磁铁上取下管子，加入五百微升的1倍十缓冲液，然后重新悬浮珠子。第二次洗涤后，用固定化的寡核苷酸将珠子重新悬浮在十微升中，每个样品1倍10缓冲液。对于每个样品，标签一个微分管，并添加10微升珠悬浮液，170微升DNA，和90微升3x1缓冲液。在92摄氏度的干热块中孵育两分钟，以解育DNA。将管子移动到不同的干热块，该热块设置为 52 摄氏度，并孵育一小时。在此孵育期间，每十分钟一次，反转管子进行混合。一小时的孵育完成后，用五百微升的十倍缓冲液洗一次珠子，再悬浮在三十五微升的核酸酶自由水中。在取出任何液体之前，将管子留在磁铁上约三分钟后，确保磁珠沉淀良好。为了在干燥的热块中孵育管子，在92摄氏度下孵育两分钟。然后，快速将管子移动到磁铁上，一次一个管子。一旦珠子被绑定到管的一侧，将含有HIV1DNA的上一液转移到一个新鲜的管子上。要开始此过程，请将冻干适配器重新悬浮在无核酸酶无素水中的一百微摩尔，并旋转管。每个样本，加上一个控制样本，结合零点四五微升的10x T4 DNA连结酶缓冲液，四个微升适配器，和点零五微升的核酸酶自由水。加热到92摄氏度两分钟，然后在PCR机中慢慢冷却到16摄氏度。这将允许适配器形成发针结构。这个过程的关键步骤是有效和公正的结合适应分子打开3总理DNA基尼。不同长度的纯化新生cDNA分子使用T4 DNA连体与发夹单绞合DNA适配器连接。适配器具有随机的六核苷酸条形码序列，允许解析以方便结扎，同时用作唯一读取的标识符。3 至 10 月 1 日适配器携带一个空间，以防止自结扎。要建立60微升最终体积结扎反应，在每个PCR管中加入以下：6微升10x T4 DNA连接酶缓冲液，24微升40%PEG，6微升5摩尔贝塔，4点5微升适配器，1点2微升T4DNA连接酶，18点DNA微升。混合反应后，在PCR机中孵育，温度为16摄氏度。在适配器结扎后的第二天，在三十微升的甲酰胺含有DNA凝胶加载缓冲液到每个结扎反应和混合良好的管道标题。在94摄氏度的PCR机中加热两分钟，然后立即加冰。下一步是准备变性凝胶电泳。将预铸6%TBE变性尿素聚丙烯酰胺凝胶放在适当的凝胶罐中，并加入1xTBE运行缓冲液。预运行凝胶二十分钟。接下来，使用注射器和二十一针，用运行缓冲液洗净凝胶口袋。然后将同一样品的井中每个孔的三十微升装入三口井中。建议每个凝胶只运行一个样品，以避免交叉污染。跑二十分钟。当凝胶运行时，使用21个量表注射器针将孔戳到底部，每个样品准备三个零点五毫升微离心管。将每个准备好的管子插入两毫升微型离心管中，并贴上样品名称加低、中或高标签。当深蓝色染料正面大约在凝胶的一半，停止电泳并取出凝胶盒。撬开盒式磁带，用剃刀垂直切割凝胶。慷慨地用三口装有的样品来切除带子。将凝胶条加入一个容器中，加入1x TBE和5微升氰酸染色的容器，孵育3至5分钟。确保染色足够，以便轻松识别稍后要移除的免费适配器的顶部。接下来，用蒸馏的去电离水彻底清洁蓝光转光器的表面。然后从染色容器中拿出凝胶片，放在灯箱上。打开灯箱，通过橙色过滤器检查染色的核酸。此处显示了染色凝胶上具有代表性的连结DNA样本。适配器通常显示为过载，并运行作为一个大斑点与连接的HIV1 DNA运行以上作为条纹。红线表示凝胶要切割的位点，以去除自由适配器，并将样品分成三个均匀的部分。使用新的剃须刀刀片，如果仍有未加载样品的区域，则切开凝胶的两侧。接下来，在适配器的上方切割以去除适配器和下部凝胶部件。最后，切开凝胶的顶部，包括大约一毫米的凝胶口袋，通常有一个尖锐的强烈信号，更高的分子量DNA。将剩余的含有样品的凝胶片水平分成三个均匀的块。低、中、高分子量区域。然后，将三个凝胶片段各切成两片两毫米，然后将它们转移到准备好的零点五毫升微离心管中。以最高速度旋转，打开盖子一分钟。将凝胶片通过孔挤压到两毫升管中，以形成凝胶泥浆。如果任何凝胶颗粒仍留在零点五毫升管的底部，请用针头手动将它们转移到两毫升管中。在每个微离心管中的凝胶泥浆中加入一毫升尿素凝胶萃取缓冲液，开始DNA提取过程。在室温下用端在端混合器端旋转管至少三个小时。准备筛选器列。使用一套干净的钳子，将一个小的圆形玻璃纤维过滤器添加到每个离心柱中，使用醋酸纤维素膜过滤器，防止膜堵塞。将过滤器与倒置的管头尖端放在一起。在微离心中用凝胶泥浆和萃取缓冲液短暂旋转两个毫升管，然后将七百微升的上清液转移到准备好的过滤柱上。以最高速度将滤芯柱以最高速度离心一分钟。然后将流量转移到新的两毫升微离心管。用剩余的上线重新加载列。尽量从萃取泥浆中获取尽可能多的液体，如果含有凝胶片，不要担心。再次旋转。合并流通过相同的提取样本，然后按照文本协议中所述继续。在缺乏抗逆转录病毒人类蛋白A3G的情况下，从感染Vif缺乏HIV-1的CEMS-ST细胞的样本中采用了此种协议。从每个样本获得的唯一读取总数图表明，A3G 水平的增加减少了总读取数。反映A3G对逆转录酶的抑制作用中化cdna合成。在这接下来的三个图中，前一百八十二个核苷酸中每个可能长度的分子的分数以蓝色直方图显示。添加 A3G 的成本在一些非常特定的可重复位置的较短截断的 cdna 分子的显著增加。虚线红线，显示在相应位置携带 C 到 T 突变的读取百分比。通过处理一组具有知道序列、长度和浓度的合成寡核苷酸，可以产生正对。所有分子应以接近相等的丰度出现，只有很小的变化。如果库运行产生次要长度偏差，在排序中，建议应用从表示大小偏置的斜率派生的规范化因子。这个过程可以很容易地适应其他系统，其中确定DNA分子的三个主要端点将增加对核酸代谢的有一些关键见解。请不要忘记，使用艾滋病毒可能是极其危险的，有些感染只应在指定的安全实验室进行。

Research

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