Name: determining 3'-termini and sequences of nascent single-stranded viral dna molecules during hiv-1 reverse transcription in infected cells
Uploaded: 2019-01-30T14:00:00
Duration: 13 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells at JoVE.com

De auteurs erkennen de steun van leden van het Malim laboratorium, Luis Apolonia Jernej Ule en Rebecca Oakey. De auteurs bedanken Matt Arno op het King's College London Genomic Centre en Debbie Hughes op de University College London (UCL), Instituut voor neurologie Next Generation Sequencing faciliteit, voor hulp bij MiSeq sequencing loopt. Het werk werd gesteund door de Britse Medical Research Council (G1000196 en M.M. heer/M001199/1), de Wellcome Trust (106223/Z/14/Z tot M.M.), de Europese Commissie zevendekaderprogramma (KP7/2007-2013) onder de Subsidieovereenkomst geen. PIIF-GA-2012-329679 (tot D.P.) en het ministerie van volksgezondheid via een nationale instituten voor gezondheid onderzoek uitgebreide Biomedical Research Center award aan Guy's en St. Thomas' NHS Foundation Trust in samenwerking met King's College London en King's College Hospital NHS Foundation Trust.

<ol>
	<li>Herschhorn, A., Hizi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+reverse+transcriptases.">Retroviral reverse transcriptases.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (16), 2717-2747 (2010).</li><li>Hu, W. S., Hughes, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+reverse+transcription.">HIV-1 reverse transcription.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (10), (2012).</li><li>Levin, J. G., Mitra, M., Mascarenhas, A., Musier-Forsyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+HIV-1+nucleocapsid+protein+in+HIV-1+reverse+transcription.">Role of HIV-1 nucleocapsid protein in HIV-1 reverse transcription.</a> RNA Biology. 7 (6), 754-774 (2010).</li><li>Menendez-Arias, L., Sebastian-Martin, A., Alvarez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+reverse+transcriptases.">Viral reverse transcriptases.</a> Virus Research. , (2016).</li><li>Telesnitsky, A., Goff, S. P., Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Retroviruses. , (1997).</li><li>Pollpeter, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+sequencing+of+HIV-1+reverse+transcripts+reveals+the+multifaceted+antiviral+functions+of+APOBEC3G.">Deep sequencing of HIV-1 reverse transcripts reveals the multifaceted antiviral functions of APOBEC3G.</a> Nature Microbiology. 3 (2), 220-233 (2018).</li><li>Frohman, M. A., Dush, M. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+production+of+full-length+cDNAs+from+rare+transcripts:+amplification+using+a+single+gene-specific+oligonucleotide+primer.">Rapid production of full-length cDNAs from rare transcripts: amplification using a single gene-specific oligonucleotide primer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (23), 8998-9002 (1988).</li><li>Liu, X., Gorovsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+5'+and+3'+ends+of+Tetrahymena+thermophila+mRNAs+using+RNA+ligase+mediated+amplification+of+cDNA+ends+(RLM-RACE).">Mapping the 5' and 3' ends of Tetrahymena thermophila mRNAs using RNA ligase mediated amplification of cDNA ends (RLM-RACE).</a> Nucleic Acids Research. 21 (21), 4954-4960 (1993).</li><li>Ince, I. A., Ozcan, K., Vlak, J. M., van Oers, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+classification+and+mapping+of+non-polyadenylated+transcripts+of+an+invertebrate+iridovirus.">Temporal classification and mapping of non-polyadenylated transcripts of an invertebrate iridovirus.</a> Journal of General Virology. 94, 187-192 (2013).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-ligase-dependent+biases+in+miRNA+representation+in+deep-sequenced+small+RNA+cDNA+libraries.">RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries.</a> RNA. 17 (9), 1697-1712 (2011).</li><li>Kwok, C. K., Ding, Y., Sherlock, M. E., Assmann, S. M., Bevilacqua, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hybridization-based+approach+for+quantitative+and+low-bias+single-stranded+DNA+ligation.">A hybridization-based approach for quantitative and low-bias single-stranded DNA ligation.</a> Analytical Biochemistry. 435 (2), 181-186 (2013).</li><li>Abram, M. E., Tsiang, M., White, K. L., Callebaut, C., Miller, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+strategy+to+assess+intrinsic+inhibition+efficiencies+of+HIV-1+reverse+transcriptase+inhibitors.">A cell-based strategy to assess intrinsic inhibition efficiencies of HIV-1 reverse transcriptase inhibitors.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (2), 838-848 (2015).</li><li>Bishop, K. N., Verma, M., Kim, E. Y., Wolinsky, S. M., Malim, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APOBEC3G+inhibits+elongation+of+HIV-1+reverse+transcripts.">APOBEC3G inhibits elongation of HIV-1 reverse transcripts.</a> PLoS Pathogens. 4 (12), 1000231 (2008).</li><li>Zack, J. A., Haislip, A. M., Krogstad, P., Chen, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incompletely+reverse-transcribed+human+immunodeficiency+virus+type+1+genomes+in+quiescent+cells+can+function+as+intermediates+in+the+retroviral+life+cycle.">Incompletely reverse-transcribed human immunodeficiency virus type 1 genomes in quiescent cells can function as intermediates in the retroviral life cycle.</a> Journal of Virology. 66 (3), 1717-1725 (1992).</li><li>Adachi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+acquired+immunodeficiency+syndrome-associated+retrovirus+in+human+and+nonhuman+cells+transfected+with+an+infectious+molecular+clone.">Production of acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone.</a> Journal of Virology. 59 (2), 284-291 (1986).</li><li>Shah, V. B., Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+uncoating+of+HIV-1+cores.">In vitro uncoating of HIV-1 cores.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), (2011).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Science+Education+Database:+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology:+Passaging+Cells.">Science Education Database: Basic Methods in Cellular and Molecular Biology: Passaging Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database:+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology:+Using+a+Hemocytometer+to+Count+Cells.">JoVE Science Education Database: Basic Methods in Cellular and Molecular Biology: Using a Hemocytometer to Count Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>Zhou, M. Y., Gomez-Sanchez, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+TA+cloning.">Universal TA cloning.</a> Current Issues in Molecular Biology. 2 (1), 1-7 (2000).</li><li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purifying+plasmid+DNA+from+bacterial+colonies+using+the+QIAGEN+Miniprep+Kit.">Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).</li><li>Mangeat, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+antiretroviral+defence+by+human+APOBEC3G+through+lethal+editing+of+nascent+reverse+transcripts.">Broad antiretroviral defence by human APOBEC3G through lethal editing of nascent reverse transcripts.</a> Nature. 424 (6944), 99-103 (2003).</li><li>Gillick, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+HIV-1+infection+by+APOBEC3+proteins+in+primary+human+CD4(+)+T+cells+is+associated+with+inhibition+of+processive+reverse+transcription+as+well+as+excessive+cytidine+deamination.">Suppression of HIV-1 infection by APOBEC3 proteins in primary human CD4(+) T cells is associated with inhibition of processive reverse transcription as well as excessive cytidine deamination.</a> Journal of Virology. 87 (3), 1508-1517 (2013).</li><li>Harris, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+deamination+mediates+innate+immunity+to+retroviral+infection.">DNA deamination mediates innate immunity to retroviral infection.</a> Cell. 113 (6), 803-809 (2003).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytidine+deaminase+CEM15+induces+hypermutation+in+newly+synthesized+HIV-1+DNA.">The cytidine deaminase CEM15 induces hypermutation in newly synthesized HIV-1 DNA.</a> Nature. 424 (6944), 94-98 (2003).</li><li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iCLIP--transcriptome-wide+mapping+of+protein-RNA+interactions+with+individual+nucleotide+resolution.">iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).</li><li>Troutt, A. B., McHeyzer-Williams, M. G., Pulendran, B., Nossal, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligation-anchored+PCR:+a+simple+amplification+technique+with+single-sided+specificity.">Ligation-anchored PCR: a simple amplification technique with single-sided specificity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (20), 9823-9825 (1992).</li><li>Zhelkovsky, A. M., McReynolds, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+analysis+of+Methanobacterium+thermoautotrophicum+RNA+ligase+-+engineering+a+thermostable+ATP+independent+enzyme.">Structure-function analysis of Methanobacterium thermoautotrophicum RNA ligase - engineering a thermostable ATP independent enzyme.</a> BMC Molecular Biology. 13 (24), (2012).</li><li>Li, T. W., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-independent+and+quantitative+ligation+of+single-stranded+DNA.">Structure-independent and quantitative ligation of single-stranded DNA.</a> Analytical Biochemistry. 349 (2), 242-246 (2006).</li><li>Gansauge, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-stranded+DNA+library+preparation+from+highly+degraded+DNA+using+T4+DNA+ligase.">Single-stranded DNA library preparation from highly degraded DNA using T4 DNA ligase.</a> Nucleic Acids Research. 45 (10), 79 (2017).</li><li>Ding, Y., Kwok, C. K., Tang, Y., Bevilacqua, P. C., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiling+of+in+vivo+RNA+structure+at+single-nucleotide+resolution+using+structure-seq.">Genome-wide profiling of in vivo RNA structure at single-nucleotide resolution using structure-seq.</a> Nature Protocols. 10 (7), 1050-1066 (2015).</li></ol>

De auteurs verklaren dat zij niets hebben te onthullen.

De beschikbaarheid van snelle, betrouwbare en kosteneffectieve diepe sequencing heeft een revolutie teweeggebracht in vele aspecten op het gebied van de biowetenschappen, waardoor grote diepte in sequencing gebaseerde analyses. Een resterende uitdaging ligt in het innovatieve ontwerp en de creatie van vertegenwoordiger sequencing bibliotheken. Hier beschrijven we een protocol om vast te leggen van de ontluikende virale cDNA moleculen, specifiek de tussenproducten van de HIV-1 omgekeerde transcriptie proces.
De meest kritische stap in deze strategie is de afbinding van een adapter naar de open 3'-termini kwantitatieve en onbevooroordeelde wijze. Efficiëntie van de ligations tussen twee ssDNA termini, zowel inter- en intramoleculaire, zijn onderzocht en geoptimaliseerd voor verschillende toepassingen11,26,27,28,29. De keuze van het gebruik van een adapter haarspeld met T4 DNA ligase onder de voorwaarden beschreven in stap 3.3 is het resultaat van empirische optimalisatie waarin we geëvalueerd verschillende ligases, adapters en reagentia voor de afbinding van synthetische oligonucleotides vertegenwoordigen HIV-1 sequenties (tabel 2) (gegevens niet worden weergegeven). In deze in vitro test reacties, we het bevestigd dat de T4 DNA-ligase Afbinding van de haarspeld adapter gemedieerde, zoals beschreven door Kwok et al.. 11, heeft een zeer lage vooroordeel, en bereikt in de buurt van volledige Afbinding van acceptor moleculen wanneer de adapter wordt gebruikt in een overschrijdingstolerantie. De efficiëntie van de afbinding werd niet beïnvloed door de toevoeging van nucleotide sequentie te maken van de adapter compatibel voor het multiplex primer-systeem (Zie Figuur 4). In vergelijking vonden we dat een thermostable 5' DNA/RNA ligase ("Ligase A", Zie Tabel van materialen voor exacte ligases in vergelijking hier), oftewel een gemanipuleerde RNA ligase die gedeeltelijk is ontwikkeld om te verbeteren op de efficiëntie van de afbinding met ssDNA als de acceptor 27, was inderdaad meer effectief in het ligating van twee ssDNA moleculen dan RNA ligase ("Ligase-B"), maar had een aanzienlijke vertekening, met sterke verschillen in de efficiëntie van de afbinding zelfs tussen oligonucleotides met enkele basis lengte verschillen [tabel 2 ; HTP con mid G (a) en (b)]. Bovendien vonden we alleen een minimale vertekening in de reacties met "Ligase C" gecombineerd met een adapter die een gerandomiseerde 5'-termini (een strategie gebruikt ter compensatie van de bekende nucleotide bias van "Ligase C"; Zie bijvoorbeeld Ding et al.. 30). toch de "Ligase C"-gemedieerde intermoleculaire ligations waren incompleet, waardoor de T4 DNA ligase systeem de superieure keuze.
Verschillende stappen van de kwaliteitscontrole over het verloop van het protocol en het opnemen van positieve en negatieve controles voldoende zijn voor de detectie van potentiële problemen voordat assay voortzetting en als leidraad voor het oplossen van de inspanningen. De qPCR ondermeer in stappen 2.2.2 en 2.3.12 zorgen ervoor dat de hoeveelheid van het uitgangsmateriaal voldoende is. Typische cDNA kopie getallen in het bereik van de elutie (uit stap 2.1) 200 µL van ongeveer 10.000 tot 300.000 per µL. De hybride opname stap kan resulteren in een verlies van totale HIV-1 cDNA hoeveelheid maar moet resulteren in een sterke verrijking van specifieke HIV-1 cDNA over cellulaire DNA, wat kan worden vastgesteld met behulp van passende inleidingen te kwantificeren genomic DNA vóór en na de verrijking door qPCR of door het meten van de totale concentratie van DNA. Herstelde cDNA van HIV-1 nadat de hybride vangen stappen moet ten minste 10% van de invoer. Lage grondstof kan anders verklaren een succesvolle oligonucleotide positieve controle (zie stap 3.3.2) maar beperkt leest bereikt in de monsters. Lage lezen nummers algemene kan ook worden verklaard door de overschatting van de concentratie van de bibliotheek als gevolg van de aanwezigheid van irrelevante DNA soorten zonder MiSeq adapters. Dit zou leiden tot lage cluster dichtheid en kan worden verbeterd door de bepaling van de concentratie van HIV-1 sequenties in de bibliotheek door qPCR naast het totaalbedrag van DNA door fluorimetrische analyses. Vanwege de gevoelige aard van de methode, moet speciale zorg worden genomen om zelfs low-level verontreiniging, zowel vanuit andere monsters (met name uit de hoge concentratie controle oligonucleotide voorraden) en uit laboratoriumapparatuur te voorkomen. Werken in een UV steriliseren van PCR werkstation is gunstig in dit opzicht. De geautomatiseerde gelelektroforese van de definitieve bibliotheek (stap 6.1.2) is een verdere maatregel van de kwaliteitscontrole. Het nucleïnezuur groottewaaier doorgaans waargenomen is tussen 150 tot 500 nt. inleidingen die kunnen worden ontdekt in de optionele controle na de PCR en voor de zuivering (zienoot in stap 5.2) moet nu afwezig. In een representatief resultaat, de steekproef intensiteit curve heeft een piek rond 160 tot 170 nt en een tweede scherper piek rond 320 tot 350 nt. Dit weerspiegelt waarschijnlijk de vaak gezien hogere overvloed in zowel relatief kort (1 tot en met 20 nt invoegen lengte) reverse afschriften en full-length sterke-stop (180 tot en met 182 nt invoegen lengte) (Figuur 3b).
Terwijl de gepresenteerde protocol en geselecteerde primers specifiek voor vroege HIV-1 omgekeerde transcriptie constructies zijn, is de methode in het algemeen toepasselijk voor onderzoek gericht op het bepalen van de open 3'-termini van DNA. De belangrijkste wijzigingen nodig zijn in een andere context zullen de methode voor hybride capture en de primer design strategie. Bijvoorbeeld, als het doel zich aan late HIV-1 afschriften worden aangepast, een groter aantal verschillende vastleggen biotinyleerd oligonucleotides gloeien over de lengte van de cDNA zou wenselijk zijn en het verlies in de hybride opname stap waarschijnlijk zal afnemen. Zoals vermeld in de inleiding, is het belangrijk dat beperkingen bij het ontwerpen van het bereik waarover 3'-termini zijn worden gedetecteerd om te voorkomen dat verschillende bronnen van bias. Ten eerste kan er een vertekening in de PCR reacties als de sjablonen met de adapter met enorm verschillende lengten. Ten tweede, de sequencing platform gebruikt hier (bijvoorbeeld MiSeq) heeft een bereik van de lengte voorkeur invoegen voor optimale clustering, en aanzienlijk kortere en langere producten kunnen niet worden sequenced met de dezelfde efficiëntie. Gedeeltelijk, dit kan worden aangepakt computationeel, zoals ook is gebeurd door te berekenen een correctiefactor voor lineaire lengte bias (Zie Figuur 4, onderste grafiek). Echter, als de provincie waar de 3'-termini mapping is gewenst lang is (> 1000 nt), het is meer aan te raden te splitsen van de reacties met de ligaturen transcripten en meerdere upstream inleidingen kunt beoordelen 3'-termini in secties.
De analyseprogramma is in-house geschreven voor het specifieke doel van het analyseren van zowel het laatste nucleotide van de HIV-1 reeks grenzend aan de volgorde van de vaste adapter evenals de basis variatie van alle rechtsgrondslagen voor het identificeren van alle mutaties. De afzonderlijke stappen omvatten het volgende: ten eerste, de adapter-sequenties zijn bijgesneden met de toolkit van de fastx-0.0.13; vervolgens worden alle sequenties die worden gedupliceerd (dat wil zeggen identiek sequenties, met inbegrip van de streepjescode) verwijderd. Alle resterende unieke leest zijn dan afgestemd op de volgorde van de HIV-1 Bowtie (http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml) met de maximale mismatch vastgesteldop van drie basen. De sjabloon-reeks bestaat uit de eerste 635 nt van HIV-1 cDNA (NL4.3-stam), waarin de volgorde - sss en het eerste strand overdracht product tot het nummer van de polypurine (U5-R-U3-PPT; Zie Figuur 1). Aldus, zijn de meegeleverde software en sjablonen alleen direct geschikt als de methode wordt gebruikt voor dezelfde toepassing (detectie van vroege omgekeerde afschriften van de HIV-1NL4.3). Aanpassingen zullen moeten worden gemaakt voor andere doel-sequenties. De posities van de 3'-termini voor elke lezen werden bepaald door de positie in de uitlijning. Basis gesprekken voor elke positie worden opgenomen en mutatie tarieven worden berekend op basis van de totale dekking van elke basis, die varieert, zoals leest van verschillende lengtes zijn en lange inzetstukken kunnen niet volledig worden gedekt door de sequencing van de 125-base in Read2.
Tot slot, wij geloven de beschreven methode om een waardevolle tool voor vele soorten studies. Voor de hand liggende toepassingen omvatten onderzoeken van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de omgekeerde transcriptie remming door middel van antiretrovirale geneesmiddelen of cellulaire beperking factoren. Echter moet slechts relatief kleine aanpassingen nodig zijn om te passen het systeem aan de 3'-termini toewijzen binnen andere single-stranded DNA virale tussenproducten, die aanwezig zijn, bijvoorbeeld bij parvovirus-replicatie. Bovendien kan het uitgangspunt van de methode, met name de geoptimaliseerde afbinding stap, een fundamenteel onderdeel van bibliotheek voorbereiding ontwerp zorgen voor de karakterisatie van eventuele uitbreidingen van de 3'-DNA, met inbegrip van versnellingen gekatalyseerd door cellulaire double-stranded DNA polymerase.

Om te ontleden en begrijpen van de virale replicatie volledig, steeds meer geraffineerde technieken die replicatie vangen zijn tussenproducten vereist. In het bijzonder de precieze definitie van virale nucleïnezuur soorten in het kader van geïnfecteerde cellen kan bieden nieuwe inzichten, aangezien veel virale replicatie mechanismen hebben tot nu toe is onderzocht in geïsoleerde in vitro reacties. Een goed voorbeeld is het proces van omgekeerde transcriptie in retrovirussen, zoals humaan immunodeficiëntie virus (HIV-1) 1. De verschillende stappen van HIV-1 omgekeerde transcriptie, waarin het virale enzym reverse transcriptase (RT) het single-stranded RNA genoom naar double-stranded DNA kopieert, voornamelijk in de primer extensie testen met gezuiverde eiwitten bestudeerde en stikstofbase geweest zuren1,2,3,4,5. Terwijl fundamentele beginselen zijn vastgesteld, wordt deze gehaltebepalingen alle virale en cellulaire componenten niet te nemen en kunnen niet overeen met biologisch relevante stoichiometries van betrokken factoren. Dus, we ontwierpen een krachtige techniek om te bepalen van de spectra van omgekeerde transcriptie tussenproducten met hun precieze cDNA 3'-termini (dat wil zeggen, bepalen hun exacte lengtes) en nucleotidesequenties in het kader van infecties van het leven cellen6. Verzameling van gegevens van tijd cursus experimenten kunnen worden gebruikt om het vergelijken van het profiel van afschriften onder verschillende omstandigheden, zoals de aanwezigheid van antivirale moleculen of eiwitten, die invloed op de efficiëntie en processivity van DNA-synthese hebben kunnen en accumulatie. Hierdoor kan een meer gedetailleerd inzicht in de levenscyclus van de natuurlijke ziekteverwekker, die vaak de basis voor gerichte drug design en succesvolle therapeutische interventie is.
HIV-1 omgekeerde transcriptie bestaat uit een reeks van opeenvolgende gebeurtenissen gestart door het gloeien van een tRNA primer aan de genomic RNA-sjabloon, die vervolgens wordt uitgebreid door RT te produceren van een afschrift van de korte single-stranded cDNA genoemd een minteken fronten sterk-stop (-sss) (Zie Figuur 1). Vervolgens - sss cDNA wordt overgebracht van de 5'-lange terminal herhalen (LTR) aan de 3'-LTR van de genomic RNA, waar het anneals en fungeert als de primer voor voortdurende RT rek van de minus gemedieerde strand DNA (Bekijk beoordelingen op omgekeerde transcriptie1 , 2 , 3 , 4). deze eerste strand overdracht is één van de snelheidslimieten stappen van omgekeerde transcriptie; Vandaar, cDNA - sss is bekend om te accumuleren. Het basisontwerp workflow en bibliotheek vast te leggen van de omgekeerde transcriptie-producten in de geïnfecteerde cellen is uiteengezet in Figuur 2a. De specifieke primers en analyse instellingen die worden gebruikt in het protocol en in tabel 1 genoemde doel al vroeg reverse transcriptie cDNA tussenproducten binnen het bereik van de lengte van 23 tot ~ 650 nt, waarin de 180-182 nt - sss DNA. Echter zal passende kleine aanpassingen aan de strategie niet alleen laat omgekeerde transcriptie producten, maar ook andere virussen en systemen, toepassing laten waar het doel is om op te sporen met DNA van 3'-OH eindigt. Belangrijke beperkingen te overwegen omvat het bereik van de lengte van het eindproduct van PCR in de bibliotheek; in het bijzonder zal sjablonen in die de afstand tussen de adapter op de open 3'-terminus en de site van upstream primer meer dan ~ 1000 nt waarschijnlijk worden minder efficiënt sequenced, potentieel invoering van misleidende technische vooroordelen tijdens bibliotheek voorbereiding) Zie de beschrijving voor meer details en aanpassing suggesties).
Eerder hebben gerapporteerde technieken voor de systematische bepaling van 3'-termini van nucleïnezuur strengen gericht op RNA, geen DNA, moleculen. Een voorbeeld is 3' RACE (snelle versterking van cDNA eindigt)7, dat afhankelijk van de polyadenylatie van mRNA is. Daarnaast werden adapter afbinding gebaseerde strategieën met RNA ligases ontwikkeld, die RLM-RACE (RNA ligase-gemedieerde RACE)8 of LACE (afbinding gebaseerde versterking van cDNA eindigt)9hebt opgenomen. Het is belangrijk om te benadrukken dat afbinding gebaseerde amplifications gevoelig voor vooringenomenheid geïntroduceerd door de afbinding reactie zelf zijn. Bijvoorbeeld, wellicht afbinding min of meer efficiënte afhankelijk van een bepaalde nucleotide in de 3'-positie, de volgorde, totale molecuul lengte of plaatselijke structuur. Dergelijke ligase voorkeuren leiden tot onvolledige vangen van moleculen en onjuiste voorstelling van zaken in de uitlezing, die wij en anderen hebben waargenomen9,10. U wilt minimaliseren afbinding vooringenomenheid tijdens de adapter toevoeging stappen in het protocol hierin beschreven, we een aantal afbinding strategieën getest en gevonden van het gebruik van T4 DNA ligase met een haarspeld single-stranded DNA adapter (zoals beschreven door Kwok et al.. 11) als de enige procedure met in de buurt van kwantitatieve afbinding dat niet leiden aanzienlijke verschillen in afbinding efficiëntie tot wanneer beoordeeld met een speciaal geselecteerde besturingselement oligonucleotides6. De keuze van deze strategie Afbinding is daarom een belangrijk element in het succes van dit protocol.
Tot op heden, monitoring van HIV-1 RT progressie in de geïnfecteerde cellen is voornamelijk bereikt door het meten van de producten van de omgekeerde transcriptie van verschillende lengte met kwantitatieve PCR (qPCR) met behulp van primer-sonde sets die uniek korter of langer meten (begin en laat, respectievelijk) cDNA producten12,13,14. Terwijl deze qPCR benadering geschikt is voor het bepalen van de intrinsieke efficiëntie van het proces van omgekeerde transcriptie in cellulaire systemen, is de output van relatief lage resolutie, met geen opeenvolgingsinformatie wordt afgeleid. Onze nieuwe aanpak, gebaseerd op geoptimaliseerde adapter afbinding, PCR-gemedieerde bibliotheek generatie en diepe sequencing adressen de technologische kloof en biedt een kans om te controleren van omgekeerde transcriptie tijdens HIV-1 infectie kwantitatief en één nucleotide resolutie.
We hebben laten zien dat het nut van deze methode in een studie die een onderscheid tussen twee voorgestelde modellen voor de capaciteit van de HIV-1 beperking factor APOBEC3G (apolipoproteïne B mRNA bewerken enzym katalytische polypeptide-achtige 3G gemaakt) te mengen met het productie van virale omgekeerde afschriften6.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:743px;" width="743">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">293T cells</td>
			<td style="width:160px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-3216</td>
			<td style="width:209px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15150-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">HeraCell Vios 250i CO2 Incubator</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td>51030966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Laminar flow hood - CAS BioMAT2</td>
			<td style="width:160px;">Wolflabs</td>
			<td style="width:119px;">CAS001-C2R-1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">10mm TC-treated culture dish</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">TrypLE&#8482; Express (1x), Stable Trypsin Replacement Enzyme</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">OptiMEM&#174; (Minimal Essential Medium)</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31985-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3)</td>
			<td style="width:160px;">NIH Aids reagent program</td>
			<td style="width:119px;">114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Polyethylenimine (PEI) - MW:25000</td>
			<td style="width:160px;">PolySciences Inc</td>
			<td>23966-2</td>
			<td>dissolved at 1mg/ml and adjusted to pH7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">RQ1- Rnase free Dnase</td>
			<td style="width:160px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">M6101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Filter 0.22 &#956;m</td>
			<td style="width:160px;">Triple Red Limited</td>
			<td>FPE404025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">15 mL polypropylene tubes</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td>CLS430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Sucrose</td>
			<td style="width:160px;">Calbiochem</td>
			<td>573113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:160px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">344060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:160px;">Sorval</td>
			<td style="width:119px;">WX Ultra Series</td>
			<td>Th-641 Rotor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Alliance HIV-1 p24 antigen ELISA kit</td>
			<td style="width:160px;">Perkin Elmer</td>
			<td>NEK050001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">CEM-SS cells</td>
			<td style="width:160px;">NIH Aids reagent program</td>
			<td>776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Roswell Park Memorial Institute Medium</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31870-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">CoStar&#174; TC treated multiple well plates</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">CLS3513-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Benchtop centrifuge: Heraus&#8482; Multifuge&#8482; X3 FR</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td>75004536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">TX-1000 Swinging Bucket Rotor</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td>75003017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Microcentrifuge: 5424R</td>
			<td style="width:160px;">Eppendorf</td>
			<td>5404000060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Total DNA extraction kit (DNeasy Blood and Tissue kit)</td>
			<td style="width:160px;">Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Nuclease free H2O</td>
			<td style="width:160px;">Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Cutsmart buffer</td>
			<td style="width:160px;">New England Biolabs (part of DpnI enzyme)</td>
			<td style="width:119px;">R0176S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">DpnI restriction enzyme</td>
			<td style="width:160px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R0176S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Oligonucleotides for qPCR</td>
			<td style="width:160px;">MWG Eurofins</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>HPSF purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">TaqMan PCR Universal Mastermix</td>
			<td style="width:160px;">Thermo</td>
			<td>4304437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">LoBind Eppendorf&#174; tubes</td>
			<td style="width:160px;">Eppendorf</td>
			<td>30108078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Axygen&#8482; aerosol filter pipette tips, 1000 &#956;L</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td>TF-000-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Axygen&#8482; aerosol filter pipette tips, 200 &#956;L</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td>TF-200-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Axygen&#8482; aerosol filter pipette tips, 20 &#956;L</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td>TF-20-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Axygen&#8482; aerosol filter pipette tips, 10 &#956;L</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">TF-10-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">PCR clean hood</td>
			<td style="width:160px;">LabCaire</td>
			<td style="width:119px;">Model PCR-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">DynaMag&#8482;2-magnet</td>
			<td style="width:160px;">Thermo</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Streptavidin MagneSphere&#174; paramagnetic particles</td>
			<td style="width:160px;">Promega</td>
			<td>Z5481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Casein</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">37582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">End over end rotator, Revolver&#8482; 360&#176;</td>
			<td style="width:160px;">Labnet</td>
			<td style="width:119px;">H5600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tris-Base</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td>H1758-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">EDTA disodium salt dihydrate</td>
			<td style="width:160px;">Electran (VWR)</td>
			<td style="width:119px;">443885J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Dri-Block&#174; Analog Block Heater</td>
			<td style="width:160px;">Techne</td>
			<td>UY-36620-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">PCR tubes and domed caps</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td>AB0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">PCR machine</td>
			<td style="width:160px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">Mastercycler&#174; series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:160px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0202M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">40% Polyethylene glycol solution (PEG) in H2O, MW: 8000</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td>P1458-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Betaine solution, 5M</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td>B0300-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Gel loading buffer II (formamide buffer)</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td>AM8546G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Precast 6% TBE urea gels</td>
			<td style="width:160px;">Invitrogen</td>
			<td>EC6865BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Mini cell electrophoresis system</td>
			<td style="width:160px;">Invitrogen, Novex</td>
			<td>XCell SureLock&#8482;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tris/Borate/EDTA solution (10x)</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td>10031223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Needle 21 G x1 1/2</td>
			<td style="width:160px;">VWR</td>
			<td>613-2022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">SYBR Gold nucleic acid stain (10000x)</td>
			<td style="width:160px;">Life Technologies</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Dark Reader DR46B transilluminator</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td>NC9800797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ammonium acetate</td>
			<td style="width:160px;">Merck</td>
			<td>101116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">SDS solution 20% (w/v)</td>
			<td style="width:160px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">161-0418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Centrifuge tube filter</td>
			<td style="width:160px;">Appleton Woods</td>
			<td style="width:119px;">BC591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Filter Glass Fibre Gf/D 10mm</td>
			<td style="width:160px;">Whatman (VWR)</td>
			<td>512-0427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">polyadenylic acid (polyA) RNA</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td>10108626001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Glycogen, molecular biology grade</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td>R0561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Isopropanol (2-propanol)</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td>15809665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ethanol, molecular biology grade</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td>10041814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Accuprime&#8482; Supermix I (DNA polymerase premix)</td>
			<td style="width:160px;">Life Technologies</td>
			<td>12342-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">NEBNext&#174; Multiplex Oligo for Illumina (Index Primer Set 1 and 2)</td>
			<td style="width:160px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">E7335S; E7500S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Tapestation D1000 Screentape High sensitivity</td>
			<td style="width:160px;">Agilent Technologies</td>
			<td>5067- 5584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tapestation D1000 Reagents</td>
			<td style="width:160px;">Agilent Technologies</td>
			<td>5067- 5585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">2200 Tapestation - automated gel electrophoresis system</td>
			<td style="width:160px;">Agilent Technologies</td>
			<td>G2965AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Agencourt&#174; AMPure&#174; beads XP</td>
			<td style="width:160px;">Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Qubit&#8482; dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td style="width:160px;">Invitrogen</td>
			<td>Q32851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Qubit&#8482; 2.0 Fluorometer</td>
			<td style="width:160px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Topo&#8482; TA cloning Kit</td>
			<td style="width:160px;">Invitrogen</td>
			<td>450071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Sequencing platform: MiSeq System</td>
			<td style="width:160px;">Illumina</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:255px;">Experiment Manager (Sample sheet software)</td>
			<td style="width:160px;">Illumina</td>
			<td style="width:119px;">Note: Use TruSeq LT as a template</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Miseq&#8482; Reagent kit V3 (150 cycle)</td>
			<td style="width:160px;">Illumina</td>
			<td>MS-102-3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Sequencing hub: Basespace</td>
			<td style="width:160px;">Illumina</td>
			<td style="width:119px;">https://basespace.illumina.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ligase A: Thermostable 5&#8217; App DNA/RNA ligase</td>
			<td style="width:160px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0319S</td>
			<td style="width:209px;">Not used in this protocol, but tested in optimization process with results described in the discussion.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ligase B: T4 RNA ligase 1</td>
			<td style="width:160px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0204</td>
			<td style="width:209px;">Not used in this protocol, but tested in optimization process with results described in the discussion.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ligase C: CircLigase</td>
			<td style="width:160px;">Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">CL4111K</td>
			<td style="width:209px;">Not used in this protocol, but tested in optimization process with results described in the discussion.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining 3'-termini and sequences of nascent single-stranded viral dna molecules during hiv-1 reverse transcription in infected cells

Controle van nucleïnezuur tussenproducten tijdens virus replicatie biedt inzicht in de effecten en de mechanismen van het optreden van antivirale verbindingen en host cel eiwitten op virale DNA-synthese. We behandelen hier het ontbreken van een cel-gebaseerde high-dekking en hoge-resolutie bepaling dat kan definiëren retrovirale omgekeerde transcriptie tussenproducten in het fysiologische kader van virusbesmetting. De beschreven methode vangt de 3'-termini van ontluikende complementaire DNA (cDNA) moleculen binnen HIV-1 besmette cellen met één nucleotide resolutie. Het protocol gaat oogsten van hele cel DNA, gerichte verrijking van virale DNA via hybride vastleggen, adapter afbinding, grootte fractionering door gel zuivering, PCR versterking, diepe sequencing en data-analyse. Een belangrijke stap is de efficiënte en onpartijdige Afbinding van adapter moleculen te openen van de 3'-DNA termini. Toepassing van de beschreven methode bepaalt de overvloed van omgekeerde afschriften van elke specifieke lengte in een monster. Het biedt ook informatie over de (interne) opeenvolging variatie in omgekeerde afschriften en daarmee een potentiële mutaties. De bepaling is in het algemeen, geschikt voor vragen met betrekking tot DNA 3'-uitbreiding, op voorwaarde dat de volgorde van de sjabloon heet.

De techniek die in dit artikel beschreven werd toegepast op een bredere studie inspelen op de mechanismen die ten grondslag liggen aan de remming van HIV-1 omgekeerde transcriptie door de antiretrovirale menselijke eiwit APOBEC3G (A3G)6. Figuur 3 toont representatieve resultaten verkregen na de dienst van het protocol in monsters van CEM-SS T-cellen geïnfecteerd met vif-deficiënte HIV-1 in de afwezigheid of de aanwezigheid van A3G. Het totale aantal unieke leest elk monster verkregen na het uitfilteren van PCR duplicaten die de zelfde 6 hebben nt barcode en dezelfde lengte (uitgevoerd door de analysesoftware die) worden uitgezet in Figuur 3een. Toename van A3G minder totale lees als gevolg van de remmende werking van A3G op RT gemedieerde cDNA synthese eerder beschreven en gemeten door qPCR6,13,21,22. In Figuur 3, onderb, de Fractie van de moleculen op elke mogelijke lengte binnen de eerste 182 nt staan. Voor HIV-1 infectie in de afwezigheid van A3G, de meest voorkomende soort is de belangrijkste 180 nt sterke-stop molecuul zelf, met enkele accumulatie van luidt in het korter bereik (23 tot en met 40 nt) (bovenaan de grafiek, blauwe histogrammen). De toevoeging van A3G wijzigingen die dit profiel als een scherpe toename van kortere, afgekapt cDNA moleculen op enkele zeer specifieke, reproduceerbare posities is gedetecteerd (middelste en onderste grafieken). Aangezien A3G een cytosinetrifosfaat Dipyridamol, cytosine-naar-uridine is (aangeduid als C-te-T) optreden mutaties in de cDNA wanneer A3G aanwezig in de infecteren virionen21,23,24 is. Met behulp van de informatie verkregen sequencing, was het percentage van C-naar-T mutaties uitgezet op dezelfde grafiek (rode stippellijn). Opgemerkt moet worden dat het vogelgriepvirus profiel is afgeleid van alle unieke leest gecombineerd en dekking van elk nucleotide zullen variëren. Echter, indien vereist opeenvolgingsinformatie kan worden gerelateerde terug naar elke molecuul en gecorreleerd met een specifieke 3'-terminus. De verstrekte gegevens werden ontleend aan Pollpeter et al. 6 en de correlatie tussen vogelgriepvirus en cDNA lengte profielen bleek te wijten aan de detectie- en splitsing van deaminated cDNA door de cellulaire DNA repair machines.
Een positieve controle voor de aanpak van de 3'-toewijzing kan gemakkelijk worden geproduceerd door een pool van synthetische oligonucleotides voor de bekende reeks, lengte en concentratie te verwerken. Dit besturingselement is toegevoegd aan de afbinding van de adapter in stap 3.3.2 en geadviseerd om te worden opgenomen in alle multiplexed bibliotheken. Gegevens die zijn verkregen uit een controlemonster moet alle de oligonucleotides op de verwachte input verhoudingen, met slechts zeer lichte achtergrond leest. Figuur 4 ziet u resultaten van een positieve controle set 17 chemisch samengestelde oligonucleotides (voor reeksen, Zie tabel 2), die werden gemixt in mengsel ratio's. Zoals verwacht, verschijnen alle moleculen in dicht bij gelijke overvloed met slechts kleine variaties (bovenste grafiek). Terwijl de meeste posities binnen de opeenvolging van de DNA - sss die niet werden vertegenwoordigd door een oligonucleotide nul Lees graven terugkeren, zien we minder gangbare diersoorten die 1 of 2 nt korter is dan de feitelijke controle oligonucleotides. We hebben niet verder onderzocht deze minder gangbare soorten maar veronderstellen dat zij aangetaste of onvolledige producten potentieel aanwezig in de meegeleverde oligonucleotide voorraden bij aankoop vertegenwoordigen (oligonucleotides werden besteld zoals HPLC gezuiverd, waarvoor de de fabrikant geeft aan zuiverheid van > 80%). De onderste grafiek toont de controlemonster uit een andere bibliotheek uitvoert, waar variatie enigszins hoger is geplaatst tussen de 17 oligonucleotides en correleert met totale lengte in die zin dat langere controle moleculen efficiënter worden gedetecteerd dan kortere audiobestanden splitsen. Dit kan worden veroorzaakt door een kleine vertekening in PCR reacties of clustering tijdens MiSeq sequencing, die een optimale invoegen grootte heeft en kan optreden met bibliotheken uitvoering met name brede invoegen bereiken. Een simpele manier om aan te pakken dit bias is de toepassing van een normalisatie-factor op basis van de helling die aangeeft van de bias correleren aan molecuul lengte (roze lijn). De vereiste berekeningen zijn opgenomen in de analyseprogramma (zie stap 8.3 in het protocol).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58715/58715fig1.jpg"> Figuur 1: Diagram toont de eerste stappen van HIV-1 reverse transcriptie. Het proces begint met het gloeien van tRNA(Lys,3) (sinaasappel) naar de primer bindende site (PBS) in de genomische virale RNA (stap 1), waarmee de inleiding en de rek van virale cDNA (blauw, stap 2). Gelijktijdig, is de sjabloon genomic RNA afgebroken door RNaseH activiteit voor RT (stap 3). De eerste volledige intermediaire in het proces van omgekeerde transcriptie is de min-strand sterke-halte (-) sss cDNA, die is voltooid wanneer de RT gekatalyseerd polymerisatie het 5'-eindpunt van de gRNA (R) herhalingsgebied (stap 3 bereikt). De tussenliggende (-)-sss wordt overgedragen aan de 3'-terminus van de genomic RNA-sjabloon door gloeien aan de complementaire terminal 3'-lange (LTR) R herhalingsgebied. Hiervandaan blijft polymerisatie (stap 4). In de beschreven methode wordt de omgekeerde transcriptie progressie bepaald door kaart brengen van de exacte lengte van de ontluikende virale cDNA (blauw). PPT, polypurine darmkanaal; U5, unieke 5'-reeks; U3, unieke 3'-reeks. Dit cijfer wordt gepubliceerd van een eerdere publicatie6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58715/58715fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58715/58715fig2v3.jpg"> Figuur 2 : Workflow overzicht en schema's van de PCR versterking strategie en adapter afbinding. (a) workflow overzicht van de belangrijkste stappen van de beschreven techniek om te bepalen van de 3'-termini voor HIV-1 omkeren afschriften in geïnfecteerde cellen. De figuur wordt aangepast van een eerdere publicatie6. (b) Schematische voorstelling van de adapter afbinding en PCR versterking strategie. Ontluikende cDNA moleculen van verschillende lengten die zijn gezuiverd in vorige stappen naar een single-stranded DNA adapter met behulp van T4 DNA ligase als ligatuur zijn verbonden. De haarspeld-adapter (benoemde "volledige Kwok + MiSeq", Zie tabel 1) ontwerp is geïnspireerd door Kwok et al. 11. de adapter draagt een willekeurige 6 nt barcode reeks, die zorgt voor base-paring om afbinding en tegelijkertijd dient als een identifier voor unieke leest. De 3'-termini van de adapter draagt een spacer (SpC3) om te voorkomen dat de zelf-Afbinding. Ligaturen producten zijn gescheiden van overtollige adapter door denaturering van polyacrylamide gelelektroforese (pagina). Nucleic zuren in de gel zijn gekleurd en snijd in drie afzonderlijke, gelijke-grootte gel stukken in het gebied boven de adapter aan op de put, zoals gedaan in25. De producten zijn na elutie, neerslag en resuspensie, PCR versterkt met inleidingen gloeien in de bekende reeks van de adapter (primer 1, multiplex oligonucleotide kit, Zie Tabel van materialen) en een uitvoering van de eerste 22 primer nt van de HIV-1 5'-LTR reeks onmiddellijk na het tRNA (primer 2, MP1.0 + 22HIV). De 5'-termini van de gekozen inleidingen voeren adapters voor het gekozen sequencing platform (P5 en P7) evenals een index opeenvolging te onderscheiden van de afzonderlijke monsters worden uitgevoerd in dezelfde bibliotheek. Uitgangspunten van de sequencing Lees inleidingen worden aangegeven. De blue box geeft de regio van belang zijn voor het bepalen van de oorspronkelijke 3'-termini van de vastgelegde molecule. Dit percentage is aangepast van een eerdere publicatie6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58715/58715fig2v3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58715/58715fig3.jpg"> Figuur 3 : Representatieve resultaten. (a) de totale Lees telling van representatieve monsters verwerkt met het protocol beschreven. Dit omvat alle sequenties die werden geïdentificeerd als unieke leest van HIV-1 moleculen met hun 3'-termini binnen de eerste 635 nt van de minus strand cDNA (tot de PPT, Zie Figuur 1). Infectie met HIV-1 niet uitvoering A3G levert het hoogste aantal leest, overwegende dat A3G cDNA synthese remt en daardoor het totaal lezen tellen vermindert. Niet-geïnfecteerde cellen diende als een negatieve controle, terwijl een aantal synthetische oligonucleotides een positieve controle biedt. b) het relatieve overvloed van cDNAs voor elke lengte tussen nt posities 23 en 182 (full-length - sss cDNA is 180 tot en met 182 nt) van de HIV-1NL4.3 sequentie (x-as) is getoond in blauw histogrammen (schaal op de linker y-as). De relatieve overvloed van cDNA was berekend op basis van het absolute aantal sequenties gespreksafgifte op een bepaalde nucleotide binnen de - sss cDNA volgorde gedeeld door de som van alle luidt het meten van 182nt of minder. Weergegeven in onderbroken rode lijnen zijn de percentages van luidt uitvoering van C-naar-T/U mutaties op de respectieve positie (schaal op de juiste y--assen). Figuur 3 b wordt gepubliceerd van een eerdere publicatie6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58715/58715fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58715/58715fig4.jpg"> Figuur 4 : Representatieve resultaten van controlemonsters. Komt te staan, zijn twee profielen voor zwembaden met mengsel bedragen van 17 verschillende lengte synthetische oligonucleotides. Deze oligonucleotides hebben sequenties van HIV-1NL4.3 en werden geselecteerd om de dekking van verschillende lengtes en alle 4 bases als een 3'-nucleotide (Zie tabel 2). De bovenste grafiek toont de positieve controlemonster uit Figuur 3een. Geen significante overhellen naar de lengte van het molecuul of het open 3'-termini is gedetecteerd. De onderste grafiek toont een andere bibliotheek uitvoert, die een kleine lengte bias in sequencing geproduceerd. In dit geval is het aan te raden om het toepassen van een factor van normalisatie, die wordt afgeleid uit de helling (afgebeeld in roze) die de grootte bias vertegenwoordigt. Dit cijfer wordt gepubliceerd van een eerdere publicatie6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58715/58715fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Oligo-naam</td>
			<td>Lengte in nt</td>
			<td colspan="12">Volgorde</td>
			<td colspan="2">Doel</td>
			<td colspan="2">Fabrikant (zuivering)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">volledige Kwok + MiSeq</td>
			<td>61</td>
			<td colspan="12">5'-PHO-tgaagagcctagtcgctgttcannnnnnctgcccatagagagatcggaagagcacacgtct-SpC3-3'</td>
			<td colspan="2">Adapter</td>
			<td colspan="2">IDT DNA-technologieën (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">2xBiotin SS aas</td>
			<td>40</td>
			<td colspan="12">5'-Biotine-cagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggac-Biotine-3'</td>
			<td colspan="2">Hybride Capture</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Biotine 1-16 ss</td>
			<td>22</td>
			<td colspan="12">5'-cagtgtggaaaatctctagcag-BiTEG-3'</td>
			<td colspan="2">Hybride Capture</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Biotine tRNA + CTG</td>
			<td>16</td>
			<td colspan="12">5'-cagtggcgcccgaaca-BITEG-3'</td>
			<td colspan="2">Hybride Capture</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">MP1.0 + 22HIV</td>
			<td>82</td>
			<td colspan="12">5'-aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatctcactgctagagattttccacactg-3'</td>
			<td colspan="2">PCR versterking</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: inhoudsopgave oligonucleotides waaronder lengte, reeksen en wijzigingen die worden gebruikt in het protocol beschreven. De tabel wordt aangepast van een eerdere publicatie6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58715/Table1_Pollpeter.xlsx" target="_blank">Gelieve Klik hier om deze tabel als een excel-bestand te downloaden.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Oligo-naam</td>
			<td>Lengte in nt</td>
			<td colspan="12">Volgorde</td>
			<td colspan="2">Fabrikant (zuivering)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con lange C</td>
			<td>120</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="6">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagctttattgaggcttaagc-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con lange G</td>
			<td>119</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="6">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagctttattgaggcttaag-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con lange T</td>
			<td>116</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="6">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagctttattgaggctt-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con lange A</td>
			<td>118</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="6">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagctttattgaggcttaa-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con medio C</td>
			<td>76</td>
			<td colspan="12">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcac-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con medio G (a)</td>
			<td>71</td>
			<td colspan="12">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacg-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con medio G (b)</td>
			<td>72</td>
			<td colspan="12">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgg-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con medio A</td>
			<td>69</td>
			<td colspan="12">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacaga-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con medio T</td>
			<td>85</td>
			<td colspan="12">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactt-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con korte A</td>
			<td>40</td>
			<td colspan="12">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgaggga-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con korte T</td>
			<td>33</td>
			<td colspan="12">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggt-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con korte G</td>
			<td>41</td>
			<td colspan="12">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgaggg-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con korte C</td>
			<td>34</td>
			<td colspan="12">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtc-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP Con 46 (T)</td>
			<td>46</td>
			<td colspan="12">5'-ctgctagagattttccacactg actaaaagggtctgagggatctct-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP Con 83 (C)</td>
			<td>83</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="7">5'-ctgctagagattttccacactg actaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactac-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP Con 103 (C)</td>
			<td>103</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="6">5'-ctgctagagattttccacactg actaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagc-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP Con 107 (A)</td>
			<td>107</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="6">5'-ctgctagagattttccacactg actaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagcttta-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: tabel van 17 controle van synthetische oligonucleotides gebruikt als een positieve controlemonster. De top 13 oligonucleotides werden gekozen op basis van grootte [lange (116 tot en met 120 nt), mid (69 tot en met 85 nt), korte (33 tot en met 41 nt)] evenals hun 3'-termini. De tabel wordt aangepast van een eerdere publicatie6.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58715/Table2_Pollpeter.xlsx" target="_blank">Gelieve Klik hier om deze tabel als een excel-bestand te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells at JoVE.com

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

Bepalende 3'-Termini en sequenties van ontluikende Single-Stranded virale DNA moleculen tijdens HIV-1 Reverse transcriptie in geïnfecteerde cellen

Hier presenteren we een diepe rangschikken benadering waarmee een onbevooroordeelde bepaling van ontluikende 3'-termini en vogelgriepvirus profielen van single-stranded DNA moleculen. De belangrijkste toepassing is de karakterisatie van ontluikende retrovirale complementaire Ani (cDNAs), de tussenproducten die tijdens het proces van retrovirale omgekeerde transcriptie gegenereerd.

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

Deze nieuwe methode voor het analyseren van omgekeerde transcriptie kan ons nieuwe dingen vertellen over het gebied van retro virologie. We kunnen bijvoorbeeld meer te weten komen over hoe cellulaire beperkingen werken of hoe antiretrovirale geneesmiddelen de HIV1-DNA-synthese remmen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat niet alleen informatie over de volgorde van Ontluikende Reverse Tran scrips biedt, maar het maakt het mogelijk om hun precieze 3-prime DNA termini in kaart te brengen bij een enkele nucleaire strakke resolutie.De verrijking van HIV1 gratis NC's uit groothandel DNA van HIV1 geïnfecteerde cellen, wordt gedaan door hybride capture en moet worden uitgevoerd in een PCR-werkstation. Bereid een master mix van magnetische streptavidin kralen door pijp post honderd microliter kralen per monster in een enkele microcentrifuge buis plaats de buis op een magneet geschikt voor microcentrifuge buizen. Nadat de kralen zijn neergedaald naar de magneetzijde van de buis, verwijder de opslagbuffer, verwijder de buis van de magneet en schorten de kralen opnieuw op in vijfhonderd microliter van bindent wash of BW buffer.Plaats de buis terug op de magneet, wacht tot de kralen te migreren naar de magneet, en verwijder de supernatant. Haal de buis uit de magneet, voeg vijfhonderd microliter caseïneoplossing toe, hang de kralen opnieuw op en broed tien minuten op kamertemperatuur. Na tien minuten, was de kralen met BW buffer.Plaats de buis terug op de magneet, verwijder de supernatant en opnieuw zweven de kralen in vijfhonderd microliter van BW buffer. Voeg vijftig picomolen van elk gevangen biotinylated oligonucleotide per monster. Incubeer bij kamertemperatuur terwijl het schommelen in een eind over eindmixer dertig minuten.Vervolgens, breng de buis terug naar de magneet, verwijder de supernatant, verwijder de buis van de magneet, voeg vijfhonderd microliter van 1x tien buffer, en opnieuw opschorten de kralen. Na de tweede wasbeurt opnieuw opschorten de kralen met de geïmmobiliseerde oligonucleotiden in tien microliter van 1x tien buffer per monster. Voor elk monster, label een microcetrofuge buis en voeg tien microliter van kraal suspensie, honderdzeventig microliter dna, en negentig microliters van 3x tien buffer.Incubeer in een droog hitteblok bij tweeënnegentig graden celsius gedurende twee minuten om het DNA te ontaarden. Verplaats de buizen naar een ander droog warmteblok, dat is ingesteld op tweeënvijftig graden Celsius, en incubeer gedurende een uur. Elke tien minuten tijdens deze incubatie, omkeren van de buizen te mengen.Wanneer de incubatie van een uur wordt gedaan, was de kralen eenmaal met vijfhonderd microliters van 1x tien buffer, en opnieuw op te schorten in vijfendertig microliters van nuclease vrij water. Zorg ervoor dat de kralen goed regelen door het verlaten van de buizen op de magneet voor ongeveer drie minuten voor het verwijderen van een vloeistof. Om elute, incubeer de buizen op tweeënnegentig graden Celsius in een droge warmte blok gedurende twee minuten.Beweeg vervolgens snel de buizen op de magneet, één buis tegelijk. Zodra de kralen zijn gebonden aan de zijkant van de buis, breng de supernatant met de HIV1 DNA naar een verse buis. Om deze procedure te beginnen, opnieuw opschorten de lyophilized adapter op honderd micromolar in nuclease gratis water en vortex de buis.Per monster, plus een controle monster, combineren nul punt vier vijf microliters van 10x T4 DNA ligase buffer, vier microliters van adapter, en punt nul vijf microliters van nuclease gratis water. Verwarm tot tweeënnegentig graden Celsius gedurende twee minuten, en laat het langzaam afkoelen tot zestien graden Celsius in een PCR-machine. Hierdoor kan de adapter een haarspeldstructuur vormen.De belangrijkste stap in deze procedure is de efficiënte en onbevooroordeelde ligatie van aangepaste moleculen om 3-prime DNA termini te openen. Gezuiverde ontluikende cDNA moleculen van verschillende lengte worden gebondeerd aan een haarspeld enkele gestrande DNA adapter met behulp van T4 DNA ligase. De adapter draagt een willekeurige zes nucleotide barcode sequentie, die het mogelijk maakt voor paring om ligatie te vergemakkelijken, en dient tegelijkertijd als een identifier voor unieke leest.De 3-prime termini adapter draagt een spacer om zelfligatie te voorkomen. Om zestig microliter uiteindelijke volume ligatie reacties, voeg het volgende aan elke PCR buis: zes microliters van 10x T4 DNA ligase buffer, vierentwintig microliter van veertig procent PEG, zes microliters van vijf molaire Betaïne, vier punt vijf microliter adapter, een punt twee microliter van T4 DNA ligase, en achttien punt thee microliters van DNA. Na het mengen van de reacties goed, incubeer in een PCR machine op zestien graden Celsius 's nachts.Op de dag na de adapter ligatie, op dertig microliters van formamide met DNA-gel laden buffer aan elke ligatie reactie en meng goed door pijp post. Verwarm in een PCR-machine op vierennegentig graden Celsius gedurende twee minuten en zet dan meteen op ijs. De volgende stap is voor te bereiden op het denatureren van gel elektroforese.Plaats een voorgegoten zes procent TBE denaturerende ureum polyacrylamide gel in een geschikte gel tank en voeg 1x TBE lopende buffer. Voer de gel twintig minuten uit. Gebruik vervolgens een spuit en een eenentwintig meter naald om de gelzakken met lopende buffer uit te wassen.Laad vervolgens dertig microliter per put van hetzelfde monster in drie putten. Het is raadzaam om slechts één monster per gel uit te voeren om kruisbesmetting te voorkomen. Ren twintig minuten.Terwijl de gel loopt, bereiden drie nul punt vijf milliliter microcentrifuge buizen per monster met behulp van een eenentwintig meter spuitnaald om gaten in de bodem te steken. Steek elk van de bereide buizen in een twee milliliter microcentrifuge buis en label ze met de steekproef naam plus laag, midden, of hoog. Wanneer de donkerblauwe kleurstof voorkant is ongeveer halverwege de gel, stop de elektroforese en verwijder de gel cassette.Open de cassette en snijd de gel verticaal met een scheermesje. Om royaal accijnzen de strip met drie putten van geladen monsters. Voeg de gel strip aan een container met 1x TBE en vijf microliters van cyanine nucleïnezuur vlek en incubeer gedurende drie tot vijf minuten.Zorg ervoor dat de kleuring voldoende is om de bovenkant van de vrije adapter die later moet worden verwijderd, gemakkelijk te identificeren. Maak vervolgens het oppervlak van een blauw lichttransilluminator grondig schoon met gedestilleerd geïoniseerd water. Haal vervolgens het gelstuk uit de kleuringscontainer en plaats het op de lichtbak.Zet de lichtbak aan en inspecteer de gekleurde nucleïnezuren door het oranje filter. Een representatief gevedbonden DNA-monster op een gekleurde gel, wordt hier getoond. De adapter lijkt meestal overbelast en loopt als een grote blob met ligated HIV1 DNA loopt hierboven als een streep.De rode lijnen geven de plaatsen aan de gel moet worden gesneden om de vrije adapter te verwijderen en het monster in drie gelijke stukken te verdelen. Met behulp van een nieuw scheermes, snijd de zijkanten van de gel als er gebieden met geen monster geladen nog steeds aanwezig. Snijd vervolgens net boven de adapter om de adapter en onderste geldelen te verwijderen.Snijd ten slotte de bovenkant van de gel weg, inclusief ongeveer een millimeter van de gelzakken die vaak een scherp intens signaal van dna met een hoger moleculair gewicht hebben. Verdeel het resterende gelstuk dat het monster horizontaal in drie gelijke stukken bevat. Gebieden met een laag, midden en hoog moleculair gewicht.Snijd vervolgens elk van de drie gelfragmenten in twee bij twee millimeter stukken en breng ze over in de bereide nulpunt vijf milliliter microcentrifugebuizen. Draai één minuut op topsnelheid met open deksels. Om de gel stukken door het gat in de twee milliliter buis te persen om een gel slush te creëren.Als er geldeeltjes in de bodem van de nulpunt vijf milliliter buis blijven, breng ze dan handmatig naar de twee milliliter buis met behulp van een naald. Begin de DNA-extractie procedure door het toevoegen van een milliliter ureum gel extractie buffer aan de gel slush in elke microcentrifuge buis. Draai de buizen met een einde over-end mixer op kamertemperatuur voor een minimum van drie uur.De filterkolommen voorbereiden. Gebruik een schone set pincet om een klein rond glasvezelfilter toe te voegen aan elke centrifugekolom met celluloseacetaatmembraanfilters, die membraanverstopping voorkomen. Zet het filter op zijn plaats met een omgekeerde pijp koppunt.Draai de twee milliliterbuizen kort met gelslush en extractiebuffer in een microcentrifuge en breng zevenhonderd microliter van het supernatant over naar de voorbereide filterkolommen. Centrifugeren de filterkolommen in een microcentrifuge op topsnelheid gedurende een minuut. Breng vervolgens de stroom door naar een nieuwe twee milliliter microcentrifugebuis.Herlaad de kolommen met de resterende supernatant. Probeer zoveel mogelijk vloeistof uit de extractie slush te verkrijgen en maak je geen zorgen als er gelstukken zijn inbegrepen. Weer draaien.Combineer de stroom door dezelfde extractiemonsters en ga verder zoals beschreven in het tekstprotocol. Dit protocol werd gebruikt in monsters van CEMS-ST cellen besmet met Vif-deficiënte HIV-1 in de afwezigheid of aanwezigheid van de antiretrovirale menselijke eiwit A3G. Een plot van het totale aantal unieke reads verkregen uit elk monster geeft aan dat toenemende niveaus van A3G het totale leesaantal verminderen.Als gevolg van het remmende effect van A3G op omgekeerde transcriptase bemiddelde cdna synthese. In deze volgende drie percelen, de fractie van moleculen op elke mogelijke lengte binnen de eerste honderdtachtig tweeëntcleotiden, wordt weergegeven in blauwe histogrammen. De toevoeging van A3G kost een sterke toename van kortere afgekapte cdna moleculen op een paar zeer specifieke reproduceerbare posities.De gestippelde rode lijnen, tonen de percentages van reads die C naar T mutaties op de respectievelijke positie. Een positieve controle kan worden geproduceerd door de verwerking van een pool van synthetische oligonucleotiden van know sequentie, lengte en concentratie. Alle moleculen moeten verschijnen in nauwe gelijke overvloed met slechts kleine variaties.Als een bibliotheekuitloop een kleine lengtebias produceert, in het opeenvolgen, is het raadzaam om een normalisatiefactor toe te passen die van de helling wordt afgeleid die de groottebias vertegenwoordigt. Deze procedure kan gemakkelijk worden aangepast aan andere systemen waar het bepalen van de drie priemgevode uiteinden van DNA-moleculen zou belangrijke inzichten toe te voegen in ares van nucleïnezuur metabolisme. Vergeet niet dat het werken met HIV zeer gevaarlijk kan zijn en dat sommige infecties alleen mogen worden uitgevoerd in aangewezen veiligheidslaboratoria.

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In vitro transcriptie Testen en hun toepassing in Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

Volgorde-specifieke en selectieve erkenning van Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs van chemisch gewijzigd Peptide nucleïnezuren

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Immunokleuring voor DNA wijzigingen: computationele analyse van Confocal beelden

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Real-time analyse van transcriptiefactor bindend, transcriptie, vertaling en omzet globale u gebeurtenissen wilt weergeven tijdens de activatie van de cellulaire

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Een Protocol voor de productie van Integrase-deficiënte lentivirale vectoren voor CRISPR/Cas9-gemedieerde Gene knock-out in cellen verdelen

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Genoom-brede Surveillance van transcriptie fouten in eukaryote organismen

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Versterking van in de buurt van Full-length HIV-1 Proviruses voor Next-Generation Sequencing

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Reverse transcriptie-lus-gemedieerde isotherme amplificatie (RT-LAMP) Assay voor Zika-Virus en huishouden genen in Urine, Serum en Mosquito monsters

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Verbeterde gist One-hybride schermen te identificeren van de transcriptiefactor binden aan menselijke DNA-sequenties

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

Bepaling van het tarief van de bevruchting ei van Bemisia tabaci met behulp van een cytogenetische techniek

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...