Name: determining 3'-termini and sequences of nascent single-stranded viral dna molecules during hiv-1 reverse transcription in infected cells
Uploaded: 2019-01-30T14:00:00
Duration: 13 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells at JoVE.com

המחברים להכיר את התמיכה של חברי של מלים מעבדה, לואיס אפולוניה, אולה Jernej, רבקה אוקי. המחברים תודה מאט ארנו במרכז של המלך קולג בלונדון גנומית, דבי יוז ב לונדון מכללת אוניברסיטת (UCL), מנהלת המכון לנוירולוגיה הבא הדור רצף מתקן, על העזרה עם רצף MiSeq. העבודה נתמך על ידי בריטניה הרפואי המועצה למחקר (G1000196 ומר/M001199/1 כדי מ'מ), טרסט (106223/ת/14/Z כדי מ'מ), תכנית המסגרת השביעית של הנציבות האירופית (האיחוד FP7/2007-2013) בהסכם גרנט לא. PIIF-GA-2012-329679 (כדי D.P.), ועל את משרד הבריאות באמצעות המכונים הלאומיים פרס הבריאות מחקר מקיף ביו-רפואית מרכז מחקר לקרן NHS של האיש, סנט תומס אמון בשותפות בקינגס קולג '-לונדון, המלך מכללת בית החולים NHS קרן נאמנות.

<ol>
	<li>Herschhorn, A., Hizi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+reverse+transcriptases.">Retroviral reverse transcriptases.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (16), 2717-2747 (2010).</li><li>Hu, W. S., Hughes, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+reverse+transcription.">HIV-1 reverse transcription.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (10), (2012).</li><li>Levin, J. G., Mitra, M., Mascarenhas, A., Musier-Forsyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+HIV-1+nucleocapsid+protein+in+HIV-1+reverse+transcription.">Role of HIV-1 nucleocapsid protein in HIV-1 reverse transcription.</a> RNA Biology. 7 (6), 754-774 (2010).</li><li>Menendez-Arias, L., Sebastian-Martin, A., Alvarez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+reverse+transcriptases.">Viral reverse transcriptases.</a> Virus Research. , (2016).</li><li>Telesnitsky, A., Goff, S. P., Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Retroviruses. , (1997).</li><li>Pollpeter, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+sequencing+of+HIV-1+reverse+transcripts+reveals+the+multifaceted+antiviral+functions+of+APOBEC3G.">Deep sequencing of HIV-1 reverse transcripts reveals the multifaceted antiviral functions of APOBEC3G.</a> Nature Microbiology. 3 (2), 220-233 (2018).</li><li>Frohman, M. A., Dush, M. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+production+of+full-length+cDNAs+from+rare+transcripts:+amplification+using+a+single+gene-specific+oligonucleotide+primer.">Rapid production of full-length cDNAs from rare transcripts: amplification using a single gene-specific oligonucleotide primer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (23), 8998-9002 (1988).</li><li>Liu, X., Gorovsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+5'+and+3'+ends+of+Tetrahymena+thermophila+mRNAs+using+RNA+ligase+mediated+amplification+of+cDNA+ends+(RLM-RACE).">Mapping the 5' and 3' ends of Tetrahymena thermophila mRNAs using RNA ligase mediated amplification of cDNA ends (RLM-RACE).</a> Nucleic Acids Research. 21 (21), 4954-4960 (1993).</li><li>Ince, I. A., Ozcan, K., Vlak, J. M., van Oers, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+classification+and+mapping+of+non-polyadenylated+transcripts+of+an+invertebrate+iridovirus.">Temporal classification and mapping of non-polyadenylated transcripts of an invertebrate iridovirus.</a> Journal of General Virology. 94, 187-192 (2013).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-ligase-dependent+biases+in+miRNA+representation+in+deep-sequenced+small+RNA+cDNA+libraries.">RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries.</a> RNA. 17 (9), 1697-1712 (2011).</li><li>Kwok, C. K., Ding, Y., Sherlock, M. E., Assmann, S. M., Bevilacqua, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hybridization-based+approach+for+quantitative+and+low-bias+single-stranded+DNA+ligation.">A hybridization-based approach for quantitative and low-bias single-stranded DNA ligation.</a> Analytical Biochemistry. 435 (2), 181-186 (2013).</li><li>Abram, M. E., Tsiang, M., White, K. L., Callebaut, C., Miller, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+strategy+to+assess+intrinsic+inhibition+efficiencies+of+HIV-1+reverse+transcriptase+inhibitors.">A cell-based strategy to assess intrinsic inhibition efficiencies of HIV-1 reverse transcriptase inhibitors.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (2), 838-848 (2015).</li><li>Bishop, K. N., Verma, M., Kim, E. Y., Wolinsky, S. M., Malim, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APOBEC3G+inhibits+elongation+of+HIV-1+reverse+transcripts.">APOBEC3G inhibits elongation of HIV-1 reverse transcripts.</a> PLoS Pathogens. 4 (12), 1000231 (2008).</li><li>Zack, J. A., Haislip, A. M., Krogstad, P., Chen, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incompletely+reverse-transcribed+human+immunodeficiency+virus+type+1+genomes+in+quiescent+cells+can+function+as+intermediates+in+the+retroviral+life+cycle.">Incompletely reverse-transcribed human immunodeficiency virus type 1 genomes in quiescent cells can function as intermediates in the retroviral life cycle.</a> Journal of Virology. 66 (3), 1717-1725 (1992).</li><li>Adachi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+acquired+immunodeficiency+syndrome-associated+retrovirus+in+human+and+nonhuman+cells+transfected+with+an+infectious+molecular+clone.">Production of acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone.</a> Journal of Virology. 59 (2), 284-291 (1986).</li><li>Shah, V. B., Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+uncoating+of+HIV-1+cores.">In vitro uncoating of HIV-1 cores.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), (2011).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Science+Education+Database:+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology:+Passaging+Cells.">Science Education Database: Basic Methods in Cellular and Molecular Biology: Passaging Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database:+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology:+Using+a+Hemocytometer+to+Count+Cells.">JoVE Science Education Database: Basic Methods in Cellular and Molecular Biology: Using a Hemocytometer to Count Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>Zhou, M. Y., Gomez-Sanchez, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+TA+cloning.">Universal TA cloning.</a> Current Issues in Molecular Biology. 2 (1), 1-7 (2000).</li><li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purifying+plasmid+DNA+from+bacterial+colonies+using+the+QIAGEN+Miniprep+Kit.">Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).</li><li>Mangeat, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+antiretroviral+defence+by+human+APOBEC3G+through+lethal+editing+of+nascent+reverse+transcripts.">Broad antiretroviral defence by human APOBEC3G through lethal editing of nascent reverse transcripts.</a> Nature. 424 (6944), 99-103 (2003).</li><li>Gillick, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+HIV-1+infection+by+APOBEC3+proteins+in+primary+human+CD4(+)+T+cells+is+associated+with+inhibition+of+processive+reverse+transcription+as+well+as+excessive+cytidine+deamination.">Suppression of HIV-1 infection by APOBEC3 proteins in primary human CD4(+) T cells is associated with inhibition of processive reverse transcription as well as excessive cytidine deamination.</a> Journal of Virology. 87 (3), 1508-1517 (2013).</li><li>Harris, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+deamination+mediates+innate+immunity+to+retroviral+infection.">DNA deamination mediates innate immunity to retroviral infection.</a> Cell. 113 (6), 803-809 (2003).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytidine+deaminase+CEM15+induces+hypermutation+in+newly+synthesized+HIV-1+DNA.">The cytidine deaminase CEM15 induces hypermutation in newly synthesized HIV-1 DNA.</a> Nature. 424 (6944), 94-98 (2003).</li><li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iCLIP--transcriptome-wide+mapping+of+protein-RNA+interactions+with+individual+nucleotide+resolution.">iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).</li><li>Troutt, A. B., McHeyzer-Williams, M. G., Pulendran, B., Nossal, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligation-anchored+PCR:+a+simple+amplification+technique+with+single-sided+specificity.">Ligation-anchored PCR: a simple amplification technique with single-sided specificity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (20), 9823-9825 (1992).</li><li>Zhelkovsky, A. M., McReynolds, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+analysis+of+Methanobacterium+thermoautotrophicum+RNA+ligase+-+engineering+a+thermostable+ATP+independent+enzyme.">Structure-function analysis of Methanobacterium thermoautotrophicum RNA ligase - engineering a thermostable ATP independent enzyme.</a> BMC Molecular Biology. 13 (24), (2012).</li><li>Li, T. W., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-independent+and+quantitative+ligation+of+single-stranded+DNA.">Structure-independent and quantitative ligation of single-stranded DNA.</a> Analytical Biochemistry. 349 (2), 242-246 (2006).</li><li>Gansauge, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-stranded+DNA+library+preparation+from+highly+degraded+DNA+using+T4+DNA+ligase.">Single-stranded DNA library preparation from highly degraded DNA using T4 DNA ligase.</a> Nucleic Acids Research. 45 (10), 79 (2017).</li><li>Ding, Y., Kwok, C. K., Tang, Y., Bevilacqua, P. C., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiling+of+in+vivo+RNA+structure+at+single-nucleotide+resolution+using+structure-seq.">Genome-wide profiling of in vivo RNA structure at single-nucleotide resolution using structure-seq.</a> Nature Protocols. 10 (7), 1050-1066 (2015).</li></ol>

המחברים מצהירים כי יש להם כלום לחשוף.

הזמינות של רצף עמוק מהירה, אמינה וחסכונית יש מהפכה היבטים רבים בתחום מדעי החיים, המאפשר עומק רב ניתוחים המבוססת על רצף. אתגר הנותרים טמון חדשני לעיצוב ויצירה של נציג רצף ספריות. כאן נתאר פרוטוקול כדי ללכוד nascent ויראלי cDNA מולקולות, במיוחד intermediates של תהליך שעתוק במהופך HIV-1.
השלב הקריטי ביותר באסטרטגיה זו הוא מצדו של מתאם ל פתוח 3'-טרמיני באופן כמותי לא משוחדת. היעילות של ligations בין שני ssDNA טרמיני (termini), שניהם אינטר- ואת התפלגות, חקר, אופטימיזציה עבור מגוון יישומים11,26,27,28,29. הבחירה של באמצעות מתאם סיכת ראש עם T4 DNA ליגאז בתנאים המתוארים שלב 3.3 הוא התוצאה של אופטימיזציה אמפירי שבו אנו מוערכים ligases שונים, מתאמים, ריאגנטים עבור מצדו של oligonucleotides סינתטיים המייצגים רצפים HIV-1 (טבלה 2) (נתונים לא מוצג). בתגובות מבחן אלה במבחנה , אישרנו T4 DNA ליגאז מתווכת מצדו של מתאם סיכת ראש, כפי שתואר על ידי קווק ואח. 11, יש דעה קדומה נמוכה מאוד, והוא משיג ליד מוחלטת מצדו של מולקולות מקבל כאשר המתאם משמש עודף. היעילות מצדו לא הושפע התוספת של נוקלאוטיד ברצף כדי להבהיר את המתאם תואם למערכת פריימר מולטיפלקס (ראה איור 4). לשם השוואה, מצאנו כי thermostable 5' DNA/RNA ליגאז (ראה "ליגאז A", בטבלה של חומרים עבור המדויק ligases בהשוואה כאן), שהינו מהונדסים RNA ליגאז שפותחה באופן חלקי כדי לשפר את יעילות מצדו עם ssDNA כמו מקבל 27, היה אכן יותר יעיל נבדק שתי מולקולות ssDNA מאשר רנ א ליגאז (ליגאז B") אבל נאלץ דעה קדומה משמעותי, עם הבדלים חריפים יעילות מצדו אפילו בין oligonucleotides עם הבדלים אורך בסיס יחיד [בטבלה 2 ; HTP con אמצע G (א) ו- (ב)]. יתר על כן, מצאנו רק דעה קדומה מינימלי בתגובות עם "ליגאז C" בשילוב עם מתאם נושא של אקראי 5'-termini (אסטרטגיה להשתמש כדי לקזז נוקלאוטיד ידוע הטייה של "ליגאז C"; ר' למשל דינג et al. 30). עם זאת, ליגאז C-ligations הבין-מולקולרי בתיווך לא היו שלמים, עיבוד T4 DNA ליגאז המערכת הבחירה מעולה.
מספר פעולות בקרת איכות על הקורס של הפרוטוקול והכללה של פקדים חיוביים ושליליים לאפשר איתור בעיות פוטנציאליות לפני המשך assay ולספק הדרכה לפתרון מאמצים. Quantifications qPCR בשלבים 2.2.2 ו 2.3.12 להבטיח כי כמות החומר קלט מספיקה. CDNA טיפוסי עותק המספרים בטווח • תנאי (מתוך שלב 2.1) 200 µL מ בסביבות 10,000 ל 300 אלף µL. הצעד לכידת היברידית יכול לגרום לאובדן של HIV-1 הכוללת חלק cDNA כמות אך צריך לגרום לכך העשרת חזקה של cDNA HIV-1 ספציפית על הסלולר הדנ א, אשר יכול להיקבע על-ידי שימוש תחל המתאים כדי לכמת את הדנ א לפני ואחרי העשרה על-ידי qPCR או על ידי מדידת ריכוז ה-DNA מוחלט. התאושש cDNA HIV-1 לאחר ההיברידית ללכוד צעדים צריך להיות לפחות 10% של הקלט. נמוך החל חומר עשוי להסביר אחרת פקד חיובי oligonucleotide מוצלח (ראה שלב 3.3.2) אבל רק מוגבלת קריאות מושגת הדגימות. נמוך לקרוא מספרים הכוללת גם יכול להיות מוסבר על ידי מופרזת של הריכוז ספריית בשל נוכחותם של מינים לא רלוונטי DNA ללא מתאמים MiSeq. זה יגרום בצפיפות נמוכה אשכול, ניתן לשפר באמצעות קביעת הריכוז של HIV-1 רצפים בספרייה מאת qPCR בנוסף הסכום הכולל של ה-DNA על ידי מבחני fluorometric. בשל אופיו רגישה מאוד של השיטה, טיפול מיוחד יש לנקוט כדי למנוע זיהום אפילו ברמה נמוכה, שניהם מדגימות אחרים (בפרט, מתוך המניות שליטה ריכוז גבוה oligonucleotide) כמו גם כמו של ציוד מעבדה. עובד באולטרה לחיטוי PCR תחנת העבודה הוא מועיל בהקשר זה. בג'ל אוטומטיות של הספרייה הסופי (שלב 6.1.2) הוא מדד בקרת איכות נוספים. הטווח גודל חומצת גרעין בדרך כלל שנצפה הוא בין 150-500 nt. תחל שניתן לאתר בפקד אופציונלי לאחר את ה-PCR, ולפני טיהור (ראה הערה בשלב 5.2) אמור הנעדר. תוצאה נציג, עקומת העוצמה המדגם כולל לשיא בסביבות 160 170 nt וחד יותר השני של שיא בסביבות 320 ל 350 nt. זה משקף ככל הנראה לעתים קרובות-ראה שפע גבוה יותר קצר יחסית תעתיקים הפוכה (1-20 nt הוספה אורך) והן באורך מלא חזק הפסקה (180 עד 182 nt הוספה אורך) (איור 3ב').
בעוד הפרוטוקול הציג לבין תחל שנבחרו הן ספציפיות עבור בונה מוקדם של שעתוק במהופך HIV-1, השיטה זו חלים באופן כללי על כל מחקר במטרה לקבוע פתוח 3'-טרמיני (termini) של ה-DNA. השינויים העיקריים הנדרשים בהקשרים אחרים תהיה השיטה עבור לכידת היברידית ואסטרטגיה עיצוב של פריימר. לדוגמה, אם המטרה היא להיות מותאם מאוחר תעתיקים HIV-1, מספר גדול יותר של שונים oligonucleotides biotinylated לכידת חישול על פני אורך cDNA יהיה מומלץ, יקטן ככל הנראה את ההפסד בשלב לכידת היברידית. כאמור במבוא, חשוב לקחת בחשבון את מגבלות בעת עיצוב הטווח שבו 3'-termini הם יזוהו להימנע מקורות שונים של הטיה. ראשית, ייתכן דעה קדומה תגובות PCR אם התבניות עם מתאם אורך משתנה במידה רבה. שנית, רצף פלטפורמת המשמש כאן (למשל, MiSeq) יש טווח אורך הוספה המועדפת עבור קיבוץ באשכולות אופטימלית, ולא באופן משמעותי מוצרים קצר וארוך עשוי לא להיות וסודרו עם יעילות זהה. בחלקה זו ניתן לטפל שהמפתחות, כפי שנעשה על-ידי חישוב מקדם תיקון עבור אורך קדומה (ראה איור 4, הגרף התחתון). עם זאת, אם האזור שבו רצוי 3'-termini מיפוי ארוך (nt > 1000), רצוי יותר לפצל את התגובות עם התרשימים מחוברים ולהשתמש primers נגד הזרם מרובים כדי להעריך 3'-termini בסעיפים.
התוכנית ניתוח נכתב בתוך הבית עבור מטרה ספציפית של ניתוח שני נוקלאוטיד האחרון את רצף HIV-1 סמוכים רצף מתאם קבוע, כמו גם את הווריאציה הבסיס של כל בסיסים לזהות מוטציות כל. השלבים הבודדים המרכיבים הבאים: ראשית, רצפי מתאם נסגרים באמצעות ערכת הכלים fastx-0.0.13; לאחר מכן, יוסרו כל רצפי אשר משוכפלות (כלומר רצפים זהים כולל הברקוד). כל קורא ייחודי הנותרים מיושרים ואז הרצף HIV-1 באמצעות עניבת הפרפר (http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml) עם ההתאמה המרבית שוכן בגובה שלושה בסיסים. הרצף תבנית מורכבת של 635 הראשון nt של HIV-1 cDNA (זן NL4.3), הכוללת את הרצף - בועז, המוצר הראשון של העברת סטרנד עד המסלול polypurine (U5-R-U3-PPT; ראה איור 1). ובכך, התוכנה שסופקה ואת תבניות מתאימים רק ישירות אם השיטה משמשת אותו יישום (זיהוי מוקדם הפוכה תעתיקים של HIV-1NL4.3). התאמות תצטרך להתבצע עבור רצפי יעד אחרים. העמדות של 3'-טרמיני עבור כל קריאה נקבעו על ידי העמדה היישור. השיחות הבסיס לכל תפקיד מוקלטות, מוטציה המחירים מחושבים מתוך סה כ סיקור כל בסיס, אשר משתנה, כמו קורא באורכים שונים, מוסיף הרבה זמן אולי לא לגמרי יכוסה על ידי רצף 125-בסיס ב- Read2.
לסיכום, אנו מאמינים השיטה המתוארת כדי להיות כלי רב ערך עבור סוגים רבים של מחקרים. ברור יישומים כוללים חקירות של המנגנונים עיכוב שעתוק במהופך דרך תרופות תרופתי או הגבלת הסלולר גורמים. אולם, התאמות קלות יחסית צריך שיהיה צורך להתאים את המערכת כדי 3'-termini מיפוי בתוך אחרים חד גדילי DNA נגיפי intermediates, אשר נמצאים, לדוגמה, בשכפול הפרוו. יתר על כן, העיקרון של השיטה, במיוחד שלה צעד מצדו ממוטבת, באפשרותך לספק חלק הליבה של הספרייה הכנה עיצוב עבור אפיון כל הרחבות 3'-DNA, כולל elongations על ידי תאי DNA גדילי כפול polymerases.

על מנת לנתח ולהבין שכפול ויראלי לחלוטין, יותר ויותר מעודן טכניקות ללכוד שכפול intermediates נדרשים. בפרט, ההגדרה המדויקת של מינים חומצת גרעין ויראלי בתוך ההקשר של תאים נגועים יכולה לספק תובנות חדשות, שכן מנגנוני שכפול ויראלי רבים יש לתאריך כבר בדק בתגובות מבודד במבחנה . דוגמה הוא התהליך של שעתוק במהופך בתוך רטרווירוסים, כגון וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV-1) 1. השלבים השונים של שעתוק במהופך HIV-1, במהלכו רוורס טרנסקריפטאז אנזים ויראלי (RT) מעתיק הגנום RNA חד-גדילי לתוך שני גדילי ה-DNA, היו למד בעיקר בתחום מבחני הארכת תחל עם חלבונים מטוהרים ולא nucleic חומצות1,2,3,4,5. בעוד עקרונות היסוד הוקמו, מבחני כזה לא לשלב את כל הרכיבים ויראלי וסלולריות, אינן משקפות בהכרח רלוונטי מבחינה ביולוגית stoichiometries של גורמים המעורבים. לכן, עיצבנו טכניקה חזקה כדי לקבוע את הספקטרום של שעתוק במהופך intermediates עם cDNA מדויק 3'-termini (קרי, קביעת אורך המדויק שלהם) נוקלאוטיד רצפים בהקשר של זיהומים של החיים שלהם תאים6. אוסף של נתונים בזמן הקורס ניסויים יכול להיות מנוצל כדי להשוות את הפרופיל של הפרוטוקולים תחת תנאים שונים, כגון הנוכחות של מולקולות אנטי ויראליים או חלבונים, עשוי להשפיע את היעילות ואת processivity לסינתזת DNA ו הצטברות. דבר זה מאפשר הבנה מפורטת יותר של מחזור החיים של פתוגן טבעי, אשר לעיתים קרובות בסיס עיצוב שיגור תרופות, התערבות טיפולית מוצלחת.
שעתוק במהופך HIV-1 כוללת סדרה של אירועים רצופים שיזם חישול של פריימר tRNA לתבנית RNA הגנומי, אשר לאחר מכן מורחב על ידי RT לייצר תעתיק קצר cDNA חד גדילי שנקרא חיסור-strand חזק-עצירה (-sss) (ראה איור 1). לאחר מכן, cDNA - בועז מועבר מטרמינל 5' באורך חוזר (משמאל לימין) 3'-LTR של RNA הגנומי, איפה זה anneals ואני מגישה למתחילים המשך RT המתווך התארכות של המינוס לנטישה דנ א (ראה את הדעת על שעתוק במהופך1 , 2 , 3 , 4). זו העברה סטרנד הראשון הוא אחד הצעדים הגבלת קצב של שעתוק במהופך; לפיכך, cDNA - בועז ידוע לצבור. העיצוב הבסיסי של זרימת וספריית כדי ללכוד את המוצרים שעתוק במהופך תאים נגועים המותווה איור2 א. תחל ספציפי וניתוח הגדרות אשר נמצאים בשימוש בפרוטוקול ולרשום טבלה 1 . המטרה כל מוקדם הפוך שעתוק intermediates cDNA בטווח באורך של 23 ל 650 ~ nt, הכולל את 180-182 nt - בועז הדנ א. עם זאת, עיבודים קלים המתאים את האסטרטגיה יאפשר ליישום לא רק מוצרים שעתוק במהופך מאוחר אבל גם וירוסים אחרים ומערכות, שבו המטרה היא לזהות את הקצוות DNA המכיל 3'-הו. מגבלות חשוב לשקול לכלול את טווח אורך של המוצר הסופי PCR הספריה; בפרט, תבניות שבו המרחק בין את המתאם-פתוח 3'-הסופית באתר upstream פריימר לחרוג nt ~ 1000 סביר היה פחות ביעילות לסדרם, פוטנציאל היכרות עם מטעה הטיות טכני במהלך ספריית הכנה ( ראה דיון לקבלת פרטים נוספים והצעות הסתגלות).
בעבר דווח על טכניקות מצפני שיטתי 3'-טרמיני (termini) של חומצת גרעין קווצות התמקדו RNA DNA, מולקולות. דוגמה אחת היא 3' המירוץ (מהירה הגברה קצות cDNA)7, אשר נשענת על פוליאדנילציה של mRNA. בנוסף, מתאם מבוססי מצדו אסטרטגיות העסקת RNA ligases פותחו, אשר כללו RLM-מרוץ (RNA בתיווך ליגאז גזע)8 או תחרה (הגברה מבוססת מצדו של הקצוות cDNA)9. חשוב להדגיש כי amplifications מבוססי מצדו רגישים לכל הטיה שהציג את התגובה מצדו עצמו. לדוגמה, מצדו עשוי להיות יעיל יותר או פחות בהתאם נוקלאוטיד מסוים המיקום 3', רצף, מולקולה סה כ אורך, או מבנה מקומי. העדפות ליגאז כזה להוביל לכידת לא שלם של מולקולות, סילוף של המדידה, אשר אנחנו ואחרים הבחינו9,10. כדי לצמצם הטיה מצדו במהלך השלבים בנוסף מתאם בפרוטוקול כפי שיתואר בהמשך, אנחנו מספר אסטרטגיות מצדו נבדק ונמצא את השימוש T4 DNA ליגאז עם מתאם דנ א חד גדילי סיכת ראש (כפי שתואר על ידי קווק et al. 11) להיות ההליך היחיד עם יד מצדו כמותית זה לא לגרום הבדלים משמעותיים מצדו יעילות כאשר העריך עם קבוצת הבקרה oligonucleotides6שנבחרו במיוחד. הבחירה של אסטרטגיה זו מצדו הוא, לכן, תכונה מפתח להצלחת פרוטוקול זה.
עד כה, ניטור של התקדמות RT HIV-1 תאים נגועים בעיקר, הושג על ידי מדידת מוצרים שעתוק במהופך של אורך שונים עם ה-PCR כמותי (qPCR) באמצעות ערכות פריימר-בדיקה המודדים באופן ייחודי ארוכה או קצרה יותר (בראשית ו מאוחר, בהתאמה) cDNA מוצרים12,13,14. בעוד גישה qPCR זו הוא המתאים לקביעת היעילות מהותי מתהליך שעתוק במהופך בתוך מערכות סלולריות, הפלט הוא של רזולוציה נמוכה יחסית, ללא מידע רצף להיות נגזר. הגישה החדשה שלנו, בהתבסס על מתאם ממוטבת מצדו, ספריית בתיווך PCR הדור, רצף עמוק כתובות הפער טכנולוגיה, מציע הזדמנות לעקוב אחר שעתוק במהופך במהלך זיהום ב- HIV-1 באופן כמותי, נוקלאוטיד יחיד רזולוציה.
לנו יש מאויר השירות של שיטה זו במחקר זה להבחין בין שני מודלים מוצעים עבור הקיבולת של הגורם הגבלת HIV-1 APOBEC3G (אפוליפופרוטאין B mRNA העריכה אנזים קטליטי מפוליפפטיד כמו דור 3) להתערב עם הפקה של נגיפי תעתיקים הפוכה6.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:743px;" width="743">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">293T cells</td>
			<td style="width:160px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-3216</td>
			<td style="width:209px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15150-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">HeraCell Vios 250i CO2 Incubator</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td>51030966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Laminar flow hood - CAS BioMAT2</td>
			<td style="width:160px;">Wolflabs</td>
			<td style="width:119px;">CAS001-C2R-1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">10mm TC-treated culture dish</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">TrypLE&#8482; Express (1x), Stable Trypsin Replacement Enzyme</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">OptiMEM&#174; (Minimal Essential Medium)</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31985-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3)</td>
			<td style="width:160px;">NIH Aids reagent program</td>
			<td style="width:119px;">114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Polyethylenimine (PEI) - MW:25000</td>
			<td style="width:160px;">PolySciences Inc</td>
			<td>23966-2</td>
			<td>dissolved at 1mg/ml and adjusted to pH7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">RQ1- Rnase free Dnase</td>
			<td style="width:160px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">M6101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Filter 0.22 &#956;m</td>
			<td style="width:160px;">Triple Red Limited</td>
			<td>FPE404025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">15 mL polypropylene tubes</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td>CLS430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Sucrose</td>
			<td style="width:160px;">Calbiochem</td>
			<td>573113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:160px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">344060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:160px;">Sorval</td>
			<td style="width:119px;">WX Ultra Series</td>
			<td>Th-641 Rotor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Alliance HIV-1 p24 antigen ELISA kit</td>
			<td style="width:160px;">Perkin Elmer</td>
			<td>NEK050001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">CEM-SS cells</td>
			<td style="width:160px;">NIH Aids reagent program</td>
			<td>776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Roswell Park Memorial Institute Medium</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31870-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">CoStar&#174; TC treated multiple well plates</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">CLS3513-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Benchtop centrifuge: Heraus&#8482; Multifuge&#8482; X3 FR</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td>75004536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">TX-1000 Swinging Bucket Rotor</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td>75003017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Microcentrifuge: 5424R</td>
			<td style="width:160px;">Eppendorf</td>
			<td>5404000060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Total DNA extraction kit (DNeasy Blood and Tissue kit)</td>
			<td style="width:160px;">Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Nuclease free H2O</td>
			<td style="width:160px;">Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Cutsmart buffer</td>
			<td style="width:160px;">New England Biolabs (part of DpnI enzyme)</td>
			<td style="width:119px;">R0176S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">DpnI restriction enzyme</td>
			<td style="width:160px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R0176S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Oligonucleotides for qPCR</td>
			<td style="width:160px;">MWG Eurofins</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>HPSF purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">TaqMan PCR Universal Mastermix</td>
			<td style="width:160px;">Thermo</td>
			<td>4304437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">LoBind Eppendorf&#174; tubes</td>
			<td style="width:160px;">Eppendorf</td>
			<td>30108078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Axygen&#8482; aerosol filter pipette tips, 1000 &#956;L</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td>TF-000-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Axygen&#8482; aerosol filter pipette tips, 200 &#956;L</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td>TF-200-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Axygen&#8482; aerosol filter pipette tips, 20 &#956;L</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td>TF-20-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Axygen&#8482; aerosol filter pipette tips, 10 &#956;L</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">TF-10-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">PCR clean hood</td>
			<td style="width:160px;">LabCaire</td>
			<td style="width:119px;">Model PCR-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">DynaMag&#8482;2-magnet</td>
			<td style="width:160px;">Thermo</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Streptavidin MagneSphere&#174; paramagnetic particles</td>
			<td style="width:160px;">Promega</td>
			<td>Z5481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Casein</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">37582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">End over end rotator, Revolver&#8482; 360&#176;</td>
			<td style="width:160px;">Labnet</td>
			<td style="width:119px;">H5600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tris-Base</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td>H1758-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">EDTA disodium salt dihydrate</td>
			<td style="width:160px;">Electran (VWR)</td>
			<td style="width:119px;">443885J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Dri-Block&#174; Analog Block Heater</td>
			<td style="width:160px;">Techne</td>
			<td>UY-36620-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">PCR tubes and domed caps</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td>AB0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">PCR machine</td>
			<td style="width:160px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">Mastercycler&#174; series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:160px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0202M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">40% Polyethylene glycol solution (PEG) in H2O, MW: 8000</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td>P1458-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Betaine solution, 5M</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td>B0300-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Gel loading buffer II (formamide buffer)</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td>AM8546G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Precast 6% TBE urea gels</td>
			<td style="width:160px;">Invitrogen</td>
			<td>EC6865BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Mini cell electrophoresis system</td>
			<td style="width:160px;">Invitrogen, Novex</td>
			<td>XCell SureLock&#8482;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tris/Borate/EDTA solution (10x)</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td>10031223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Needle 21 G x1 1/2</td>
			<td style="width:160px;">VWR</td>
			<td>613-2022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">SYBR Gold nucleic acid stain (10000x)</td>
			<td style="width:160px;">Life Technologies</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Dark Reader DR46B transilluminator</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td>NC9800797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ammonium acetate</td>
			<td style="width:160px;">Merck</td>
			<td>101116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">SDS solution 20% (w/v)</td>
			<td style="width:160px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">161-0418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Centrifuge tube filter</td>
			<td style="width:160px;">Appleton Woods</td>
			<td style="width:119px;">BC591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Filter Glass Fibre Gf/D 10mm</td>
			<td style="width:160px;">Whatman (VWR)</td>
			<td>512-0427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">polyadenylic acid (polyA) RNA</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td>10108626001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Glycogen, molecular biology grade</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td>R0561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Isopropanol (2-propanol)</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td>15809665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ethanol, molecular biology grade</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td>10041814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Accuprime&#8482; Supermix I (DNA polymerase premix)</td>
			<td style="width:160px;">Life Technologies</td>
			<td>12342-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">NEBNext&#174; Multiplex Oligo for Illumina (Index Primer Set 1 and 2)</td>
			<td style="width:160px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">E7335S; E7500S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Tapestation D1000 Screentape High sensitivity</td>
			<td style="width:160px;">Agilent Technologies</td>
			<td>5067- 5584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tapestation D1000 Reagents</td>
			<td style="width:160px;">Agilent Technologies</td>
			<td>5067- 5585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">2200 Tapestation - automated gel electrophoresis system</td>
			<td style="width:160px;">Agilent Technologies</td>
			<td>G2965AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Agencourt&#174; AMPure&#174; beads XP</td>
			<td style="width:160px;">Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Qubit&#8482; dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td style="width:160px;">Invitrogen</td>
			<td>Q32851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Qubit&#8482; 2.0 Fluorometer</td>
			<td style="width:160px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Topo&#8482; TA cloning Kit</td>
			<td style="width:160px;">Invitrogen</td>
			<td>450071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Sequencing platform: MiSeq System</td>
			<td style="width:160px;">Illumina</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:255px;">Experiment Manager (Sample sheet software)</td>
			<td style="width:160px;">Illumina</td>
			<td style="width:119px;">Note: Use TruSeq LT as a template</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Miseq&#8482; Reagent kit V3 (150 cycle)</td>
			<td style="width:160px;">Illumina</td>
			<td>MS-102-3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Sequencing hub: Basespace</td>
			<td style="width:160px;">Illumina</td>
			<td style="width:119px;">https://basespace.illumina.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ligase A: Thermostable 5&#8217; App DNA/RNA ligase</td>
			<td style="width:160px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0319S</td>
			<td style="width:209px;">Not used in this protocol, but tested in optimization process with results described in the discussion.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ligase B: T4 RNA ligase 1</td>
			<td style="width:160px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0204</td>
			<td style="width:209px;">Not used in this protocol, but tested in optimization process with results described in the discussion.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ligase C: CircLigase</td>
			<td style="width:160px;">Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">CL4111K</td>
			<td style="width:209px;">Not used in this protocol, but tested in optimization process with results described in the discussion.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining 3'-termini and sequences of nascent single-stranded viral dna molecules during hiv-1 reverse transcription in infected cells

ניטור של חומצת גרעין intermediates במהלך שכפול הוירוס מספק תובנות לגבי ההשפעות של מנגנוני הפעולה של תרכובות אנטי ויראליים וחלבונים התא המארח לסינתזת DNA נגיפי. כאן אנחנו כתובת חוסר assay מבוססת תא, גבוהה-סיקור ו ברזולוציה גבוהה המסוגלת הגדרת intermediates retroviral שעתוק במהופך בתוך ההקשר פיזיולוגיים להידבקות בווירוס. השיטה המתוארת לוכדת את 3'-טרמיני (termini) של מולקולות DNA (cDNA) משלימים המתהווה בתוך תאים נגועים ב- HIV-1 ברזולוציה נוקלאוטיד יחיד. הפרוטוקול כרוך קציר של התא כולו ה-DNA, העשרת יישוב של ה-DNA נגיפי באמצעות לכידת היברידית, מתאם מצדו, גודל fractionation על ידי ג'ל לטיהור, PCR הגברה, רצף עמוק, ניתוח נתונים. צעד המפתח הוא מצדו רציונלית ובלתי יעיל של מולקולות מתאם לפתוח 3'-DNA טרמיני (termini). היישום של השיטה המתוארת קובע את השפע של הפרוטוקולים הפוכה של כל אורך מסוים במדגם נתון. הוא גם מספק מידע על וריאציית רצף (פנימי) תעתיקים הפוכה, ובכך יש מוטציות פוטנציאליים. באופן כללי, וזמינותו מתאים שאלות הנוגעות דנ א 3'-סיומת, ובלבד הרצף תבנית ידועה.

Watch this Scientific Journal Video about Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells at JoVE.com

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

3'-Termini הקובע ורצפים של מולקולות Nascent חד גדילי ה-DNA הנגיפי במהלך HIV-1 הפוך שעתוק בתאים נגועים

כאן אנו מציגים בגישה רצף עמוק המספקת של קביעה לא משוחדת של nascent-3' טרמיני, כמו גם פרופילים mutational של מולקולות דנ א חד גדילי. היישום העיקרי הוא אפיון nascent retroviral משלימים DNAs (cDNAs), intermediates שנוצר במהלך התהליך של retroviral שעתוק במהופך.

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

שיטה חדשה זו לניתוח שעתוק הפוך יכולה לספר לנו דברים חדשים על תחום הווירולוגיה רטרו. לדוגמה, אנו יכולים ללמוד על הפרטים של איך גורמים הגבלות הסלולר לעבוד או איך תרופות תרופתיות לעכב סינתזת DNA HIV1. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שלא רק מספק מידע על הרצף של Tran Scrips הפוך המתהווה, אבל זה מאפשר מיפוי מדויק שלהם 3-prime DNA termini ברזולוציה גרעינית הדוקה אחת.העשרת DNAs משלימים HIV1 מ- DNA הסיטונאי של תאים נגועים HIV1, נעשה על ידי לכידה היברידית צריך להתבצע בתחנת עבודה PCR. הכינו תערובת ראשית של גם גם 100 מיקרוליטרים של חרוזים לדגימה לצינור מיקרו צנטריפוגה אחד, והנחו את הצינור על מגנט המתאים לצינורות מיקרו צנטריפוגה. לאחר חרוזים התיישבו לכיוון הצד המגנט של הצינור, להסיר את מאגר האחסון, להסיר את הצינור מן המגנט, ולהשעות מחדש את חרוזים ב500 microliters של לשטוף קלידנט או חיץ BW.מניחים את הצינור בחזרה על המגנט, לחכות חרוזים לנדוד למגנט, ולהסיר את העל טבעי. מוציאים את הצינור מהמגנט, מוסיפים 500 מיקרוליטרים של תסנובת קזין, משהים מחדש את החמרוזים, ומדוגים בטמפרטורת החדר במשך עשר דקות. לאחר עשר דקות, לשטוף את חרוזים עם חיץ BW.מניחים את הצינור בחזרה על המגנט, להסיר את supernatant ולהשעות מחדש את חרוזים ב500 microliters של חיץ BW. הוסף חמישים picomoles של כל oligonucleotide biotinylated שנתפסו לכל מדגם. דגירה בטמפרטורת החדר תוך נדנדה בסופו של דבר מעל מערבל קצה במשך שלושים דקות.לאחר מכן, להחזיר את הצינור למגנט, להסיר את supernatant, להסיר את הצינור מן המגנט, להוסיף חמש מאות microliters של חיץ 1x עשר, ולהשעות מחדש את חרוזים. לאחר לשטוף השני להשעות את חרוזים עם אוליגונוקלאוטידים משותקים בעשרה microliters של 1x עשר חיץ לכל מדגם. עבור כל דגימה, סמן צינור microcetrofuge אחד ולהוסיף עשרה microliters של השעיית חרוזים, מאה ושבעים microliters של DNA, ותשעים מיקרוליטרים של חיץ 3x עשר.דגירה בבלוק חום יבש ב92 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות כדי דה הטבע את ה-DNA. מעבירים את הצינורות לגוש חום יבש אחר, אשר מוגדר חמישים ושתי מעלות צלזיוס, ודגירה במשך שעה אחת. כל עשר דקות במהלך הדגירה הזאת, להפוך את הצינורות לערבב.כאשר הדגירה של שעה אחת נעשית, לשטוף את חרוזים פעם אחת עם חמש מאות microliters של חיץ 1x עשר, ולהשעות מחדש בשלושים וחמישה microliters של מים ללא גרעין. ודא את חרוזים להתיישב היטב על ידי השארת הצינורות על המגנט במשך כשלוש דקות לפני הסרת כל נוזל. כדי לשאוב, דגירה הצינורות ב 92 מעלות צלזיוס בבלוק חום יבש במשך שתי דקות.לאחר מכן, הזז במהירות את הצינורות אל המגנט, צינור אחד בכל פעם. לאחר חרוזים מחויבים לצד של הצינור, להעביר את העל טבעי המכיל את ה-DNA HIV1 לצינור טרי. כדי להתחיל בהליך זה, להשעות מחדש את המתאם lyophilized ב 100 micromolar במים חופשיים נוקלאאז ומערבולת הצינור.לדגימה, בתוספת דגימת בקרה אחת, לשלב נקודת אפס ארבע חמש microliters של חיץ 10x T4 DNA ligase, ארבעה microliters של מתאם, ונקודה אפס חמישה microliters של מים חופשיים גרעין. מחממים ל-92 מעלות במשך שתי דקות, ואז נותנים לו להתקרר לאט ל-16 מעלות צלזיוס במכונת PCR. זה יאפשר מתאם ליצור מבנה סיכת שיער.הצעד העיקרי בהליך זה הוא קשירה יעילה ובלתי משוחדת של מולקולות מותאמות לפתיחת טרמיני DNA 3-prime. מולקולות cDNA מטוהרות באורך משתנה מקשתות למתאם דנ"א יחיד עם סיכת ראש באמצעות קשירה T4 DNA. המתאם נושא רצף ברקוד אקראי של שישה נוקלאוטידים, המאפשר ניתוח כדי להקל על קשירה, ובו זמנית משמש כמזהה עבור קריאות ייחודיות.מתאם טרמיני 3-prime נושא רווח כדי למנוע קשירה עצמית. כדי להגדיר שישים מיקרוליטר תגובות קשירת נפח סופית, להוסיף את הדברים הבאים לכל צינור PCR:שישה microliters של חיץ 10x T4 DNA ligase, עשרים וארבעה microliters של ארבעים אחוז PEG, שישה microliters של חמישה בטאין טוחנת, ארבע נקודה חמש microliters של מתאם, נקודה אחת שני microliters של רצועות DNA T4, ו 18 נקודות מיקרוליטרים של DNA. לאחר ערבוב התגובות היטב, דגירה במכונת PCR ב 16 מעלות צלזיוס לילה.ביום שלאחר רצועות המתאם, בשלושים מיקרוליטרים של formamide המכיל מאגר טעינת ג'ל DNA לכל תגובת קשירה ומערבבים היטב על ידי כותרת צינור. מחממים במכונת PCR בתשעים וארבע מעלות צלזיוס במשך שתי דקות ואז מיד לשים על קרח. השלב הבא הוא להתכונן לניתוק אלקטרופורזה של ג'ל.מניחים יצוק מראש שישה אחוזים TBE denaturing אוריאה פוליאקרילמיד ג'ל במיכל ג'ל מתאים ולהוסיף חיץ ריצה 1x TBE. יש להפעיל מראש את הג'ל במשך עשרים דקות. לאחר מכן, השתמש במזרק ומחט מד עשרים ואחד לשטוף את כיסים ג'ל עם חיץ פועל.לאחר מכן לטעון שלושים microliters לתוך בארות אותו לתוך שלוש בארות. מומלץ להפעיל רק דגימה אחת לכל ג'ל כדי למנוע זיהום צולב. לרוץ במשך עשרים דקות.בזמן שהג'ל פועל, הכינו שלוש נקודות אפס חמש מיליליטר צינורות מיקרוצנטריפוגה לדגימה באמצעות מחט מזרק של עשרים ואחד מד כדי לתקוע חורים בתחתית. הכנס כל אחד מהצינורות המוכנים לצינור מיקרו צנטריפוגה של שני מיליליטר ותייג אותם בשם המדגם בתוספת נמוך, בינוני או גבוה. כאשר חזית הצבע הכחול הכהה היא בערך באמצע הג'ל, לעצור את האלקטרופורזה ולהסיר את קלטת הג'ל.חטטן לפתוח את הקלטת לחתוך את הג'ל אנכית עם razorblade. כדי למלמל בנדיבות את הרצועה עם שלוש בארות של דגימות טעונות. מוסיפים את רצועת הג'ל למיכל עם 1x TBE וחמישה מיקרוליטרים של כתם חומצת גרעין ציאנין ודגירה במשך שלוש עד חמש דקות.ודא כי הכתמים מספיקים כדי לזהות בקלות את החלק העליון של המתאם החופשי שיש להסירו מאוחר יותר. לאחר מכן, לנקות את פני השטח של transilluminator אור כחול ביסודיות עם מים מזוקקים דה מיוינים. לאחר מכן מוציאים את חתיכת הג'ל ממיכל הכתמים ומ מניחים אותה על קופסת האור.הפעל את תיבת האור ולבדוק את חומצות הגרעין המוכתמות דרך המסנן הכתום. דגימת דנ"א מגרירה מייצגת על ג'ל מוכתם, מוצגת כאן. המתאם בדרך כלל נראה עמוס מדי ורץ כמו כתם גדול עם DNA HIV1 קשור פועל מעל כמו פס.הקווים האדומים מציינים את האתרים שיש לחתוך את הג'ל כדי להסיר מתאם חופשי, ולחלק את המדגם לשלוש חתיכות אפילו. באמצעות razorblade חדש, לחתוך את הצדדים של הג'ל אם יש אזורים ללא מדגם טעון עדיין נוכח. לאחר מכן, חותכים ממש מעל המתאם כדי להסיר את המתאם ואת חלקי ג'ל נמוך.לבסוף, לחתוך את החלק העליון של הג'ל כולל כמילימטר אחד של כיסי ג'ל אשר לעתים קרובות יש אות אינטנסיבי חד של DNA משקל מולקולרי גבוה יותר. מחלקים את חתיכת הג'ל הנותרת המכילה את הדגימה אופקית לשלוש חתיכות אפילו. אזורים בעלי משקל מולקולרי נמוך, בינוני וגביה.לאחר מכן, חותכים כל אחד משלושת שברי הג'ל לשניים על שתי חתיכות מילימטר ומעבירים אותם לנקודת האפס המוכנה חמש צינורות מיקרוצנטריפוגה מיליליטר. סובב במהירות שיא עם מכסים פתוחים למשך דקה אחת. כדי לסחוט את חתיכות הג'ל דרך החור לתוך הצינור שני מיליליטר כדי ליצור רפש ג'ל.אם חלקיקי ג'ל כלשהם נשארים בתחתית הצינור של נקודת האפס חמישה מיליליטר, העבר אותם לצינור שני מיליליטר באופן ידני באמצעות מחט. התחל את הליך מיצוי ה-DNA על ידי הוספת מיליליטר אחד של חיץ מיצוי ג'ל אוריאה לתנופה ג'ל בכל צינור microcentrifuge. סובבו את הצינורות עם קצה מעל מערבל קצה בטמפרטורת החדר למשך שלוש שעות לפחות.הכן את עמודות הסינון. השתמש בקבוצה נקייה של פינצטה כדי להוסיף מסנן סיבי זכוכית עגול אחד קטן לכל עמוד צנטריפוגה עם מסנני קרום אצטט תאית, המונע סתימת קרום. שים את המסנן במקום עם קצה ראש צינור הפוך.סובבו בקצרה את שני הצינורות המיליליטריים עם רפש ג'ל וחוצץ מיצוי במיקרוצנטריפוגה, והעבירו 700 מיקרוליטרים של העל-טבעי לעמודי המסנן המוכנים. צנטריפוגה עמודות המסנן במיקרוצנטריפוגה במהירות שיא למשך דקה אחת. ואז להעביר את הזרימה דרך צינור מיקרוצנטריפוגה שני מיליליטר חדש.טען מחדש את העמודות עם העל-טבעי הנותר. נסו להשיג נוזלים רבים ככל האפשר מן רפש החילוץ ולא להיות מודאג אם חתיכות ג'ל כלולים. תסתובב שוב.שלב את הזרימה דרך אותן דגימות חילוץ והמשך כמתואר בפרוטוקול הטקסט. פרוטוקול זה הועסק בדגימות מתאים CEMS-ST נגועים ב- HIV-1 חסר Vif בהיעדר או נוכחות של החלבון האנושי האנטי-רטרו-ויראלי A3G. חלקה של המספר הכולל של קריאות ייחודיות המתקבלות מכל מדגם מצביעה על כך שרמות הולכות וגדלות של A3G מפחיתות את מספר הקריאה הכולל.המשקף את ההשפעה המעכבת של A3G על סינתזת cdna מתווית תעתיק הפוך. בשלוש החלקות הבאות, שבר המולקולות בכל אורך אפשרי בתוך מאה שמונים ושני הנוקלאוטידים הראשונים, מוצג בהיסטוגרמות כחולות. התוספת של A3G עלתה עלייה חדה של מולקולות cdna חתוך קצר יותר בכמה תנוחות מאוד ספציפיות לשחזור.הקווים האדומים המקווקווים, מראים את אחוזי ההקפות הנושאות מוטציות C עד T בעמדה המתאימה. שליטה חיובית יכולה להיות מיוצרת על ידי עיבוד מאגר של אוליגונוקלאוטידים סינתטיים של רצף יודע, אורך וריכוז. כל המולקולות צריכות להופיע קרוב לשפע שווה עם וריאציות קטנות בלבד.אם הפעלת ספריה יוצרת הטיית אורך משנית, ברצף, מומלץ להחיל גורם נורמליזציה הנגזר מהשיפוע המייצג את הטיית הגודל. הליך זה יכול להיות מותאם בקלות למערכות אחרות שבהן קביעת שלושת הקצוות העיקריים של מולקולות DNA יוסיף תובנות מפתח לתוך ערים של חילוף החומרים של חומצת גרעין. אנא אל תשכח כי עבודה עם HIV יכול להיות מסוכן מאוד וכמה זיהומים צריך להתבצע רק במעבדות בטיחות ייעודיות.

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

במבחנת תמלול מבחנים ויישומם ותרופות דיסקברי

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

זיהוי רצף ספציפי, סלקטיבי של גדילי כפול RNAs מעל חד גדילי RNAs על ידי שינוי כימי חומצות גרעין פפטיד

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Immunostaining עבור שינויים DNA: ניתוח חישובית של תמונות קונפוקלי

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

ניתוח בזמן אמת של גורם שעתוק כריכה, תמלול, תרגום, מחזור ולהציג אירועים גלובליים במהלך ההפעלה הסלולרית

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

פרוטוקול עבור הייצור של וקטורים Lentiviral חשוכת-Integrase עבור CRISPR/Cas9-מתווכת נוקאאוט גנטי חלוקת תאים

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

מעקב ברמת הגנום של שגיאות תיעתוק היצורים האיקריוטים

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

הגברה של יד באורך מלא הפרו-וירוס HIV-1 עבור הדור הבא רצפי

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

הפוך שעתוק לולאה-בתיווך איזותרמי הגברה (RT-המנורה) Assay Zika וירוס, ניקיון בגנים שתן, סרום, ודוגמאות יתוש

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

מסכי אחד-היברידית משופרת שמרים לזהות גורם שעתוק מחייב את רצפי דנ א אנושי

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

קביעת שיעור הפריה הביצית של כנימת עש הטבק בטכניקה Cytogenetic

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...