Name: determining 3'-termini and sequences of nascent single-stranded viral dna molecules during hiv-1 reverse transcription in infected cells
Uploaded: 2019-01-30T14:00:00
Duration: 13 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells at JoVE.com

Forfatterne bekrefter støtte fra medlemmer av Malim laboratorium, Luis Apolonia, Jernej Ule og Rebecca Oakey. Forfatterne takker Matt Arno ved King's College London Genomic Centre og Debbie Hughes ved University College London (UCL), Institutt for Nevrologi neste generasjons sekvensering anlegget, hjelp med MiSeq sekvensering kjører. Arbeidet ble støttet av den britiske Medical Research Council (G1000196 og MR/M001199/1 mm), Wellcome Trust (106223/Z/14/Z til mm), EU-kommisjonens syvende rammeprogram (FP7/2007-2013) gi avtalen ingen. PIIF-GA-2012-329679 (til DP), og Department of Health via en nasjonale institutter for helse forskning omfattende Biomedical Research Center prisen til guys og St. Thomas' NHS Foundation Trust i samarbeid med King's College London og kongens College Hospital NHS Foundation Trust.

<ol>
	<li>Herschhorn, A., Hizi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+reverse+transcriptases.">Retroviral reverse transcriptases.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (16), 2717-2747 (2010).</li><li>Hu, W. S., Hughes, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+reverse+transcription.">HIV-1 reverse transcription.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (10), (2012).</li><li>Levin, J. G., Mitra, M., Mascarenhas, A., Musier-Forsyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+HIV-1+nucleocapsid+protein+in+HIV-1+reverse+transcription.">Role of HIV-1 nucleocapsid protein in HIV-1 reverse transcription.</a> RNA Biology. 7 (6), 754-774 (2010).</li><li>Menendez-Arias, L., Sebastian-Martin, A., Alvarez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+reverse+transcriptases.">Viral reverse transcriptases.</a> Virus Research. , (2016).</li><li>Telesnitsky, A., Goff, S. P., Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Retroviruses. , (1997).</li><li>Pollpeter, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+sequencing+of+HIV-1+reverse+transcripts+reveals+the+multifaceted+antiviral+functions+of+APOBEC3G.">Deep sequencing of HIV-1 reverse transcripts reveals the multifaceted antiviral functions of APOBEC3G.</a> Nature Microbiology. 3 (2), 220-233 (2018).</li><li>Frohman, M. A., Dush, M. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+production+of+full-length+cDNAs+from+rare+transcripts:+amplification+using+a+single+gene-specific+oligonucleotide+primer.">Rapid production of full-length cDNAs from rare transcripts: amplification using a single gene-specific oligonucleotide primer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (23), 8998-9002 (1988).</li><li>Liu, X., Gorovsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+5'+and+3'+ends+of+Tetrahymena+thermophila+mRNAs+using+RNA+ligase+mediated+amplification+of+cDNA+ends+(RLM-RACE).">Mapping the 5' and 3' ends of Tetrahymena thermophila mRNAs using RNA ligase mediated amplification of cDNA ends (RLM-RACE).</a> Nucleic Acids Research. 21 (21), 4954-4960 (1993).</li><li>Ince, I. A., Ozcan, K., Vlak, J. M., van Oers, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+classification+and+mapping+of+non-polyadenylated+transcripts+of+an+invertebrate+iridovirus.">Temporal classification and mapping of non-polyadenylated transcripts of an invertebrate iridovirus.</a> Journal of General Virology. 94, 187-192 (2013).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-ligase-dependent+biases+in+miRNA+representation+in+deep-sequenced+small+RNA+cDNA+libraries.">RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries.</a> RNA. 17 (9), 1697-1712 (2011).</li><li>Kwok, C. K., Ding, Y., Sherlock, M. E., Assmann, S. M., Bevilacqua, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hybridization-based+approach+for+quantitative+and+low-bias+single-stranded+DNA+ligation.">A hybridization-based approach for quantitative and low-bias single-stranded DNA ligation.</a> Analytical Biochemistry. 435 (2), 181-186 (2013).</li><li>Abram, M. E., Tsiang, M., White, K. L., Callebaut, C., Miller, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+strategy+to+assess+intrinsic+inhibition+efficiencies+of+HIV-1+reverse+transcriptase+inhibitors.">A cell-based strategy to assess intrinsic inhibition efficiencies of HIV-1 reverse transcriptase inhibitors.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (2), 838-848 (2015).</li><li>Bishop, K. N., Verma, M., Kim, E. Y., Wolinsky, S. M., Malim, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APOBEC3G+inhibits+elongation+of+HIV-1+reverse+transcripts.">APOBEC3G inhibits elongation of HIV-1 reverse transcripts.</a> PLoS Pathogens. 4 (12), 1000231 (2008).</li><li>Zack, J. A., Haislip, A. M., Krogstad, P., Chen, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incompletely+reverse-transcribed+human+immunodeficiency+virus+type+1+genomes+in+quiescent+cells+can+function+as+intermediates+in+the+retroviral+life+cycle.">Incompletely reverse-transcribed human immunodeficiency virus type 1 genomes in quiescent cells can function as intermediates in the retroviral life cycle.</a> Journal of Virology. 66 (3), 1717-1725 (1992).</li><li>Adachi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+acquired+immunodeficiency+syndrome-associated+retrovirus+in+human+and+nonhuman+cells+transfected+with+an+infectious+molecular+clone.">Production of acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone.</a> Journal of Virology. 59 (2), 284-291 (1986).</li><li>Shah, V. B., Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+uncoating+of+HIV-1+cores.">In vitro uncoating of HIV-1 cores.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), (2011).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Science+Education+Database:+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology:+Passaging+Cells.">Science Education Database: Basic Methods in Cellular and Molecular Biology: Passaging Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database:+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology:+Using+a+Hemocytometer+to+Count+Cells.">JoVE Science Education Database: Basic Methods in Cellular and Molecular Biology: Using a Hemocytometer to Count Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>Zhou, M. Y., Gomez-Sanchez, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+TA+cloning.">Universal TA cloning.</a> Current Issues in Molecular Biology. 2 (1), 1-7 (2000).</li><li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purifying+plasmid+DNA+from+bacterial+colonies+using+the+QIAGEN+Miniprep+Kit.">Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).</li><li>Mangeat, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+antiretroviral+defence+by+human+APOBEC3G+through+lethal+editing+of+nascent+reverse+transcripts.">Broad antiretroviral defence by human APOBEC3G through lethal editing of nascent reverse transcripts.</a> Nature. 424 (6944), 99-103 (2003).</li><li>Gillick, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+HIV-1+infection+by+APOBEC3+proteins+in+primary+human+CD4(+)+T+cells+is+associated+with+inhibition+of+processive+reverse+transcription+as+well+as+excessive+cytidine+deamination.">Suppression of HIV-1 infection by APOBEC3 proteins in primary human CD4(+) T cells is associated with inhibition of processive reverse transcription as well as excessive cytidine deamination.</a> Journal of Virology. 87 (3), 1508-1517 (2013).</li><li>Harris, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+deamination+mediates+innate+immunity+to+retroviral+infection.">DNA deamination mediates innate immunity to retroviral infection.</a> Cell. 113 (6), 803-809 (2003).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytidine+deaminase+CEM15+induces+hypermutation+in+newly+synthesized+HIV-1+DNA.">The cytidine deaminase CEM15 induces hypermutation in newly synthesized HIV-1 DNA.</a> Nature. 424 (6944), 94-98 (2003).</li><li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iCLIP--transcriptome-wide+mapping+of+protein-RNA+interactions+with+individual+nucleotide+resolution.">iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).</li><li>Troutt, A. B., McHeyzer-Williams, M. G., Pulendran, B., Nossal, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligation-anchored+PCR:+a+simple+amplification+technique+with+single-sided+specificity.">Ligation-anchored PCR: a simple amplification technique with single-sided specificity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (20), 9823-9825 (1992).</li><li>Zhelkovsky, A. M., McReynolds, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+analysis+of+Methanobacterium+thermoautotrophicum+RNA+ligase+-+engineering+a+thermostable+ATP+independent+enzyme.">Structure-function analysis of Methanobacterium thermoautotrophicum RNA ligase - engineering a thermostable ATP independent enzyme.</a> BMC Molecular Biology. 13 (24), (2012).</li><li>Li, T. W., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-independent+and+quantitative+ligation+of+single-stranded+DNA.">Structure-independent and quantitative ligation of single-stranded DNA.</a> Analytical Biochemistry. 349 (2), 242-246 (2006).</li><li>Gansauge, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-stranded+DNA+library+preparation+from+highly+degraded+DNA+using+T4+DNA+ligase.">Single-stranded DNA library preparation from highly degraded DNA using T4 DNA ligase.</a> Nucleic Acids Research. 45 (10), 79 (2017).</li><li>Ding, Y., Kwok, C. K., Tang, Y., Bevilacqua, P. C., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiling+of+in+vivo+RNA+structure+at+single-nucleotide+resolution+using+structure-seq.">Genome-wide profiling of in vivo RNA structure at single-nucleotide resolution using structure-seq.</a> Nature Protocols. 10 (7), 1050-1066 (2015).</li></ol>

Forfatterne erklærer at de ikke har noe å avsløre.

Tilgjengeligheten av rask, pålitelig og kostnadseffektiv dyp sekvensering har revolusjonert mange aspekter innen biovitenskap, slik at stor dybde i sekvensering-baserte analyser. En gjenværende utfordring ligger innovative design og etablering av representant sekvensering biblioteker. Her beskriver vi en protokoll for å fange nye viral cDNA molekyler, spesielt intermediates av HIV-1 omvendt transkripsjon prosessen.
Det viktigste trinnet i denne strategien er ligation av en adapter til åpne 3-jernbanestasjonen termini i en kvantitativ og objektiv måte. Effektiviteten av ligations mellom to ssDNA termini, både blant- og intramolekylære, har blitt undersøkt og optimalisert for ulike programmer11,26,27,28,29. Valget mellom å bruke en hårnål adapter med T4 DNA ligase under forholdene som er beskrevet i trinn 3.3 er empirisk optimeringen der vi vurdert forskjellige ligases, adaptere og reagensene ligation av syntetisk oligonucleotides representerer HIV-1 sekvenser (tabell 2) (data ikke vist). I disse i vitro test reaksjoner bekreftet vi at T4 DNA ligase mediert ligation av hårnål-adapter, som beskrevet av Kwok et al. 11, har en svært lav bias, og oppnår nær fullstendig ligation av acceptor molekyler når adapteren brukes i overkant. Hemorroider effektiviteten var upåvirket av tillegg av nukleotid sekvens gjengi adapteren kompatibel for multiplex primer systemet (se Figur 4). I sammenligning fant vi at en thermostable 5' DNA/RNA ligase ("Ligase A", se Tabellen for materiale for nøyaktig ligases forhold her), som er en konstruert RNA-ligase som ble utviklet i en del å forbedre ligation effektivitet med ssDNA som acceptor 27, var faktisk mer effektiv på ligating to ssDNA molekyler enn RNA ligase (Ligase B"), men hadde en betydelig skjevhet, med sterk forskjeller i ligation effektivitet mellom oligonucleotides med enkelt base lengde forskjeller [tabell 2 ; HTP con midt G (a) og (b)]. Videre vi fant bare en minimal skjevhet i reaksjoner med "Ligase C" kombinert med en adapter bærer en randomisert 5'-termini (en strategi brukes til offset kjent nukleotid skjevhet av "Ligase C", se for eksempel Ding et al. 30). imidlertid "Ligase C"-mediert intermolekylære ligations var ufullstendig, rendering T4 DNA ligase systemet et bedre valg.
Flere kvalitetskontroll trinn over kurset av protokollen og inkludering av positive og negative kontroller tillater påvisning av potensielle problemer før analysen videreføring og gir retningslinjer for feilsøking. QPCR quantifications i trinn 2.2.2 og 2.3.12 Kontroller at mengden materiale som inndata er tilstrekkelig. Typisk cDNA kopi tall i 200 µL elueringsrør (fra trinn 2.1) varierer fra rundt 10.000 til 300.000 per µL. Hybrid fange trinnet kan resultere i tap av generelle HIV-1 cDNA antall men skal resultere i en sterk anriking av bestemte HIV-1 cDNA over mobilnettet DNA, som kan bestemmes ved hjelp av riktig primer for å kvantifisere genomisk DNA før og etter berikelse av qPCR eller ved å måle totale DNA konsentrasjon. Gjenopprettede HIV-1 cDNA når hybrid tatt skritt bør være minst 10% av input. Lav starter materiale kan ellers forklare en vellykket oligonucleotide positive kontroll (se trinn 3.3.2) men bare begrenset leser i prøvene. Lav lese tall samlet kan også forklares med overvurdering av biblioteket konsentrasjonen på grunn av tilstedeværelsen av irrelevante DNA uten MiSeq adaptere. Dette resulterer i lav klynge tetthet kan forbedres ved å bestemme konsentrasjonen av HIV-1 sekvenser i biblioteket av qPCR i tillegg til totalbeløpet DNA av fluorometric analyser. På grunn av svært følsomme natur metoden, bør forsiktighet tas å unngå selv lavnivå forurensning, både fra andre prøver (spesielt fra høy konsentrasjon kontroll oligonucleotide aksjer) samt fra laboratorieutstyr. Arbeider i en UV sterilisering PCR arbeidsstasjon er gunstig i denne forbindelse. Den automatiserte gel geleelektroforese av siste biblioteket (trinn 6.1.2) er et ytterligere kvalitetskontroll mål. Nukleinsyre størrelse området vanligvis observert er mellom 150 til 500 nt. primer som kan oppdages i valgfri kontrollen etter at PCR og før rensing (se merknad i trinn 5.2) skal nå være borte. Representant følge eksemplet intensitet kurven har en topp rundt 160-170 nt og en andre skarpere topp rundt 320-350 nt. Dette sannsynligvis gjenspeiler ofte sett høyere overflod både relativt kort (1 til 20 nt sett inn lengde) omvendt utskrifter og full lengde sterk-stop (180 til 182 nt sett inn lengde) (Figur 3b).
Mens presentert protokollen og valgte primere er spesifikke for tidlig HIV-1 omvendt transkripsjon konstruksjoner, er metoden generelt gjelder noen studier å bestemme åpne 3-termini DNA. De viktigste endringene som kreves i andre sammenhenger blir metoden for hybrid fangst og primer utformingen strategi. For eksempel hvis målet skal tilpasses slutten HIV-1 transkripsjoner, et større antall forskjellige fange biotinylated oligonucleotides annealing over lengden på cDNA ville være tilrådelig og vil trolig redusere tap i hybrid fange trinn. Som nevnt i innledningen, er det viktig å vurdere begrensninger når du utformer området som 3-termini skal oppdages for å unngå forskjellige kilder skjevhet. Først kan det være en skjevhet i PCR reaksjonene, hvis malene med adapteren er svært varierende lengde. Andre sekvensering plattformen brukes her (f.eks MiSeq) har en foretrukket sett inn lengdeintervall for optimal klynger, og betydelig kortere og lengre produkter kan ikke være sekvensielt med samme effektivitet. Delvis dette kan rettes beregningsmessig, som ble gjort ved å beregne en korrigeringsfaktoren for lineær lengde bias (se Figur 4nederste diagram). Men hvis området der 3-termini kartlegging er ønsket er lang (> 1000 nt), det er mer fornuftig å dele reaksjonene med ligated utskrifter og bruke flere oppstrøms primere for å vurdere 3-termini i deler.
Analyseprogrammet ble skrevet internt for spesifikke formål å analysere både den siste nukleotid av HIV-1 sekvensen ved fast adapter sekvensen og base variasjonen av alle baser for å identifisere eventuelle mutasjoner. De individuelle trinnene omfatter følgende: først adapter sekvensene er trimmet med fastx-0.0.13-toolkit; så, noen sekvenser dupliserte (som betyr identiske sekvenser inkludert strekkoden) er fjernet. Alle gjenværende unike leser justeres deretter til HIV-1 sekvensen med Bowtie (http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml) maksimal misforholdet satt på tre baser. Malen sekvensen består av de første 635 nt av HIV-1 cDNA (NL4.3 press), som inkluderer - sss sekvensen og det første strand overføre produktet til polypurine spor (U5-R-U3-PPT, se figur 1). Dermed er den medfølgende programvaren og maler bare egnet hvis metoden brukes til det samme programmet (gjenkjenning av tidlig omvendt transkripsjoner av HIV-1NL4.3). Justeringer må gjøres for andre målet sekvenser. Plasseringen av de 3-termini for hver leseoperasjon ble fastsatt av plasseringen i justeringen. Base samtaler for hver posisjon registreres og mutasjon priser beregnes fra totale dekningen av hver base, som varierer, leser er forskjellige lengder og lange innlegg kan ikke være helt dekket av 125-base-sekvenser i Read2.
For å konkludere, tror vi metoden beskrevet å være et verdifullt verktøy for mange typer studier. Åpenbare programmer omfatter undersøkelser av mekanismene bak omvendt transkripsjon hemming gjennom antiretrovirale medisiner eller cellular begrensning faktorer. Bare relativt mindre justeringer bør imidlertid være nødvendig å tilpasse systemet til 3-termini kartlegging i andre single-strandet DNA viral mellomprodukter, som er til stede, for eksempel i parvovirus replikering. Videre, prinsippet om metoden spesielt sin optimalisert ligation skritt, kan gi en sentral del av biblioteket forberedelse design for karakterisering av noen 3-DNA utvidelser, inkludert videreutvikling katalysert av mobilnettet double-strandet DNA polymerases.

Det kreves mellomprodukter for å analysere og forstå viral replikasjon fullt, stadig mer raffinerte teknikker som fange replikering. Spesielt den nøyaktige definisjonen av viral nukleinsyre arter innen rammen av infiserte celler kan gi ny innsikt, siden mange viral replikasjon mekanismer har hittil vært undersøkt i isolert i vitro reaksjoner. Et godt eksempel er prosessen omvendt transkripsjon i retroviruses, som humant immunsviktvirus 1 (HIV-1). De ulike trinnene av HIV-1 omvendt transkripsjon, der viral enzymet revers transkriptase (RT) kopierer én-strandet RNA genomet til double-strandet DNA, har vært studert i primer forlengelsen analyser med renset proteiner og nukleinsyre syrer1,2,3,4,5. Mens grunnleggende prinsipper ble etablert slike analyser inkorporere ikke alle virus og cellulære komponenter og gjenspeiler kanskje ikke biologisk relevante stoichiometries involvert faktorer. Derfor designet vi en kraftfull teknikk for å bestemme spektra av omvendt transkripsjon mellomprodukter med presise cDNA 3-termini (dvs. å bestemme sin nøyaktige lengder) og nukleotid sekvenser i sammenheng med infeksjoner av levende celler6. Innsamling av data fra tid kurs eksperimenter kan brukes til å sammenligne profilen til transkripsjoner under ulike tilstander, som antivirale molekyler eller proteiner, som kan påvirke effektiviteten og processivity av DNA-syntese og akkumulering. Dette gir en mer detaljert forståelse av naturlige patogen levetid, som ofte er grunnlaget for målrettet narkotika design og vellykket terapeutisk intervensjon.
HIV-1 omvendt transkripsjon består av en rekke påfølgende hendelser initiert av avspenning av en tRNA primer genomisk RNA malen, som deretter utvidet av RT å produsere en kort enkelt-strandet cDNA transkripsjon kalt en sterk minus-strand stopp (-sss) (se Figur 1). Deretter - sss cDNA overføres fra 5'-lang terminalen gjenta (VTH) til den 3-LITERS av den genomisk der det anneals og serverer som primer for fortsatt RT mediert forlengelse av minus strand DNA (se anmeldelser på omvendt transkripsjon1 , 2 , 3 , 4). denne første strand overføringen er ett av trinnene hastighetsbegrensning omvendt transkripsjon; Derfor er - sss cDNA kjent for å akkumulere. Grunnleggende arbeidsflyt og biblioteket design å fange omvendt transkripsjon produktene i infiserte celler er skissert i figur 2a. Den spesifikke primere og analyse innstillinger som brukes i protokollen og oppført i tabell 1 målrette alle tidlig reversere transkripsjon cDNA mellomprodukter innen lengden av 23 til ~ 650 nt, som inkluderer 180-182 nt - sss DNA. Imidlertid kan riktig mindre tilpasninger til strategi ikke bare sent omvendt transkripsjon produkter, men også andre virus og systemer, der målet er å oppdage 3-OH inneholder DNA ender. Viktige begrensninger å inkludere lengdeintervall på sluttproduktet PCR i biblioteket; spesielt vil maler som avstanden mellom adapteren på den åpne 3-terminalen og oppstrøms primer området overskrider ~ 1000 nt trolig være mindre effektivt sekvensert, potensielt innføre villedende tekniske biases under bibliotek forberedelse ( se diskusjon om mere detaljene og tilpasning forslag).
Tidligere har rapporterte teknikker for systematisk fastsettelse av 3-termini av nukleinsyre tråder fokusert på RNA, ikke DNA, molekyler. Et eksempel er 3 rase (rask forsterkning av cDNA slutter)7, som baserer seg på polyadenylation av mRNA. I tillegg ble adapter hemorroider-baserte strategier ansette RNA ligases utviklet, som har inkludert RLM-løp (RNA ligase-mediert rase)8 eller BLONDER (hemorroider-baserte forsterkning av cDNA slutter)9. Det er viktig å understreke at hemorroider-baserte amplifications er følsomme for skjevheter introdusert av hemorroider reaksjonen selv. For eksempel kan hemorroider være mer eller mindre effektivt avhengig av en bestemt nucleotide i 3 posisjon, sekvens, totalt molekyl lengde eller lokale struktur. Slike ligase innstillinger føre til ufullstendig erobringen av molekyler og feilaktig fremstilling i avlesning, som vi og andre har observert9,10. For å minimere ligation bias under adapter tillegg trinnene i protokollen beskrevet her, vi testet en rekke ligation strategier og funnet ut bruk av T4 DNA ligase med en hairpin single-strandet DNA adapter (som beskrevet av Kwok et al. 11) være den eneste prosedyren med nær kvantitative ligation som ikke har resultert i betydelige forskjeller i ligation effektivitet når vurderes med en spesielt valgt kontroll oligonucleotides6. Valg av denne ligation strategien er derfor en viktig funksjon i suksessen til denne protokollen.
Hittil overvåking av HIV-1 RT progresjon i infiserte celler er primært oppnådd ved å måle omvendt transkripsjon produkter av ulike lengde med kvantitative PCR (qPCR) med primer-sonden sett som unikt måle kortere eller lengre (tidlig og sent, henholdsvis) cDNA produkter12,13,14. Denne qPCR er riktig å bestemme iboende effektivitet av omvendt transkripsjon cellulær systemer, er utgangen relativt lav oppløsning, med ingen oppstartsrekkefølgen er avledet. Vår nye tilnærming, basert på optimalisert adapter hemorroider, PCR-mediert biblioteket generasjon og dyp sekvensering adresser teknologigapet og en mulighet til å overvåke omvendt transkripsjon i HIV-1 smitte kvantitativt og single nukleotid oppløsning.
Vi har illustrert nytten av denne metoden i en studie som skilles mellom to foreslåtte modeller for kapasiteten av HIV-1 begrensning faktor APOBEC3G (apolipoprotein B mRNA redigering enzym katalytisk polypeptid-lignende 3G) å forstyrre med den produksjon av viral omvendt transkripsjoner6.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:743px;" width="743">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">293T cells</td>
			<td style="width:160px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-3216</td>
			<td style="width:209px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15150-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">HeraCell Vios 250i CO2 Incubator</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td>51030966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Laminar flow hood - CAS BioMAT2</td>
			<td style="width:160px;">Wolflabs</td>
			<td style="width:119px;">CAS001-C2R-1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">10mm TC-treated culture dish</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">TrypLE&#8482; Express (1x), Stable Trypsin Replacement Enzyme</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">OptiMEM&#174; (Minimal Essential Medium)</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31985-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3)</td>
			<td style="width:160px;">NIH Aids reagent program</td>
			<td style="width:119px;">114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Polyethylenimine (PEI) - MW:25000</td>
			<td style="width:160px;">PolySciences Inc</td>
			<td>23966-2</td>
			<td>dissolved at 1mg/ml and adjusted to pH7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">RQ1- Rnase free Dnase</td>
			<td style="width:160px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">M6101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Filter 0.22 &#956;m</td>
			<td style="width:160px;">Triple Red Limited</td>
			<td>FPE404025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">15 mL polypropylene tubes</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td>CLS430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Sucrose</td>
			<td style="width:160px;">Calbiochem</td>
			<td>573113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:160px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">344060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:160px;">Sorval</td>
			<td style="width:119px;">WX Ultra Series</td>
			<td>Th-641 Rotor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Alliance HIV-1 p24 antigen ELISA kit</td>
			<td style="width:160px;">Perkin Elmer</td>
			<td>NEK050001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">CEM-SS cells</td>
			<td style="width:160px;">NIH Aids reagent program</td>
			<td>776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Roswell Park Memorial Institute Medium</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31870-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">CoStar&#174; TC treated multiple well plates</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">CLS3513-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Benchtop centrifuge: Heraus&#8482; Multifuge&#8482; X3 FR</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td>75004536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">TX-1000 Swinging Bucket Rotor</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td>75003017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Microcentrifuge: 5424R</td>
			<td style="width:160px;">Eppendorf</td>
			<td>5404000060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Total DNA extraction kit (DNeasy Blood and Tissue kit)</td>
			<td style="width:160px;">Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Nuclease free H2O</td>
			<td style="width:160px;">Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Cutsmart buffer</td>
			<td style="width:160px;">New England Biolabs (part of DpnI enzyme)</td>
			<td style="width:119px;">R0176S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">DpnI restriction enzyme</td>
			<td style="width:160px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R0176S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Oligonucleotides for qPCR</td>
			<td style="width:160px;">MWG Eurofins</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>HPSF purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">TaqMan PCR Universal Mastermix</td>
			<td style="width:160px;">Thermo</td>
			<td>4304437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">LoBind Eppendorf&#174; tubes</td>
			<td style="width:160px;">Eppendorf</td>
			<td>30108078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Axygen&#8482; aerosol filter pipette tips, 1000 &#956;L</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td>TF-000-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Axygen&#8482; aerosol filter pipette tips, 200 &#956;L</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td>TF-200-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Axygen&#8482; aerosol filter pipette tips, 20 &#956;L</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td>TF-20-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Axygen&#8482; aerosol filter pipette tips, 10 &#956;L</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">TF-10-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">PCR clean hood</td>
			<td style="width:160px;">LabCaire</td>
			<td style="width:119px;">Model PCR-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">DynaMag&#8482;2-magnet</td>
			<td style="width:160px;">Thermo</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Streptavidin MagneSphere&#174; paramagnetic particles</td>
			<td style="width:160px;">Promega</td>
			<td>Z5481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Casein</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">37582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">End over end rotator, Revolver&#8482; 360&#176;</td>
			<td style="width:160px;">Labnet</td>
			<td style="width:119px;">H5600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tris-Base</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td>H1758-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">EDTA disodium salt dihydrate</td>
			<td style="width:160px;">Electran (VWR)</td>
			<td style="width:119px;">443885J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Dri-Block&#174; Analog Block Heater</td>
			<td style="width:160px;">Techne</td>
			<td>UY-36620-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">PCR tubes and domed caps</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td>AB0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">PCR machine</td>
			<td style="width:160px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">Mastercycler&#174; series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:160px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0202M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">40% Polyethylene glycol solution (PEG) in H2O, MW: 8000</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td>P1458-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Betaine solution, 5M</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td>B0300-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Gel loading buffer II (formamide buffer)</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td>AM8546G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Precast 6% TBE urea gels</td>
			<td style="width:160px;">Invitrogen</td>
			<td>EC6865BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Mini cell electrophoresis system</td>
			<td style="width:160px;">Invitrogen, Novex</td>
			<td>XCell SureLock&#8482;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tris/Borate/EDTA solution (10x)</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td>10031223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Needle 21 G x1 1/2</td>
			<td style="width:160px;">VWR</td>
			<td>613-2022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">SYBR Gold nucleic acid stain (10000x)</td>
			<td style="width:160px;">Life Technologies</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Dark Reader DR46B transilluminator</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td>NC9800797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ammonium acetate</td>
			<td style="width:160px;">Merck</td>
			<td>101116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">SDS solution 20% (w/v)</td>
			<td style="width:160px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">161-0418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Centrifuge tube filter</td>
			<td style="width:160px;">Appleton Woods</td>
			<td style="width:119px;">BC591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Filter Glass Fibre Gf/D 10mm</td>
			<td style="width:160px;">Whatman (VWR)</td>
			<td>512-0427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">polyadenylic acid (polyA) RNA</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td>10108626001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Glycogen, molecular biology grade</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td>R0561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Isopropanol (2-propanol)</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td>15809665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ethanol, molecular biology grade</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td>10041814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Accuprime&#8482; Supermix I (DNA polymerase premix)</td>
			<td style="width:160px;">Life Technologies</td>
			<td>12342-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">NEBNext&#174; Multiplex Oligo for Illumina (Index Primer Set 1 and 2)</td>
			<td style="width:160px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">E7335S; E7500S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Tapestation D1000 Screentape High sensitivity</td>
			<td style="width:160px;">Agilent Technologies</td>
			<td>5067- 5584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tapestation D1000 Reagents</td>
			<td style="width:160px;">Agilent Technologies</td>
			<td>5067- 5585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">2200 Tapestation - automated gel electrophoresis system</td>
			<td style="width:160px;">Agilent Technologies</td>
			<td>G2965AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Agencourt&#174; AMPure&#174; beads XP</td>
			<td style="width:160px;">Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Qubit&#8482; dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td style="width:160px;">Invitrogen</td>
			<td>Q32851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Qubit&#8482; 2.0 Fluorometer</td>
			<td style="width:160px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Topo&#8482; TA cloning Kit</td>
			<td style="width:160px;">Invitrogen</td>
			<td>450071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Sequencing platform: MiSeq System</td>
			<td style="width:160px;">Illumina</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:255px;">Experiment Manager (Sample sheet software)</td>
			<td style="width:160px;">Illumina</td>
			<td style="width:119px;">Note: Use TruSeq LT as a template</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Miseq&#8482; Reagent kit V3 (150 cycle)</td>
			<td style="width:160px;">Illumina</td>
			<td>MS-102-3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Sequencing hub: Basespace</td>
			<td style="width:160px;">Illumina</td>
			<td style="width:119px;">https://basespace.illumina.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ligase A: Thermostable 5&#8217; App DNA/RNA ligase</td>
			<td style="width:160px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0319S</td>
			<td style="width:209px;">Not used in this protocol, but tested in optimization process with results described in the discussion.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ligase B: T4 RNA ligase 1</td>
			<td style="width:160px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0204</td>
			<td style="width:209px;">Not used in this protocol, but tested in optimization process with results described in the discussion.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ligase C: CircLigase</td>
			<td style="width:160px;">Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">CL4111K</td>
			<td style="width:209px;">Not used in this protocol, but tested in optimization process with results described in the discussion.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining 3'-termini and sequences of nascent single-stranded viral dna molecules during hiv-1 reverse transcription in infected cells

Overvåking av nukleinsyre mellomprodukter under virus replikering gir innsikt i effekter og virkningsmekanismer av antivirale forbindelser og verten celle proteiner i viral DNA-syntese. Her adresse vi mangel på en cellebasert, høy-dekning og høy oppløsning analysen som kan definere retroviral omvendt transkripsjon mellomprodukter fysiologiske kontekst av smitte. Metoden beskrevet fanger de 3-termini begynnende komplementære DNA (cDNA) molekyler i HIV-1-infiserte celler single nukleotid oppløsning. Protokollen innebærer høsting av hele celle DNA, målrettet anriking av viral DNA via hybrid fange, adapter hemorroider, størrelse fraksjoneres av gel rensing, PCR forsterkning, dyp sekvensering og dataanalyse. Avgjørende er effektiv og upartiske ligation av adapter molekyler å åpne 3-DNA termini. Beskrevet påføringsmetode bestemmer overflod av omvendt transkripsjoner av hver bestemt lengde i et gitt utvalg. Det gir også informasjon om (intern) sekvens variasjon i omvendt utskrifter og dermed alle potensielle mutasjoner. Generelt er analysen egnet for spørsmål knyttet til DNA 3-utvidelse, forutsatt at malen sekvensen er kjent.

Teknikken er beskrevet i denne artikkelen ble brukt til en større studie å ta mekanismene bak hemming av HIV-1 omvendt transkripsjon av antiretroviral menneskelige protein APOBEC3G (A3G)6. Figur 3 viser representant resultatene etter ansette protokollen i prøver fra CEM-SS T-celler infisert med vif-mangelfull HIV-1 i fravær eller tilstedeværelse av A3G. Totalt antall unike leser innhentet fra hver prøve etter filtrere ut PCR like poster som har de samme 6 nt strekkoden og samme lengde (spilt av analyse programvaren) tegnes i Figur 3et. Økende nivåer av A3G redusere Les antall reflekterer den hemmende effekten av A3G på RT mediert cDNA syntese tidligere beskrevet og målt ved qPCR6,13,21,22. I Figur 3b, brøkdel av molekyler på hver mulig lengde i de første 182 nt vises. HIV-1 smitte i fravær av A3G, den mest tallrike arten er viktigste 180 nt sterk-stop molekyl, med noen akkumulering av lyder i kortere rekkevidde (23 til 40 nt) (topp grafen, blå histogrammer). Tillegg av A3G endringer denne profilen som en kraftig økning av kortere, avkortet cDNA molekyler på noen svært spesifikke, reproduserbare posisjoner er oppdaget (midterste og nedre grafer). Siden A3G er en cytidine deaminase, cytosine til uridine (identifisert som C-til-T) oppstår mutasjoner i cDNA når A3G finnes i infisere virions21,23,24. Bruke informasjon innhentet sekvensering, prosenten av C-til-T mutasjoner var tegnet inn i samme diagram (rød stiplet linje). Det bør bemerkes at mutational profilen er avledet fra alle unike leser kombinert og dekning av hver nucleotide vil variere. Men hvis oppstartsrekkefølgen kan være knyttet til hvert molekyl og korrelert med en bestemt 3-terminus. Oppgitt ble tatt fra Pollpeter et al. 6 og sammenhengen mellom mutational og cDNA lengde profiler ble vist for å være gjenkjenning og spalting av deaminated cDNA av mobilnettet DNA-reparasjon maskiner.
En positiv kontroll for 3-kartlegging tilnærming kan lett bli produsert av en pool av syntetisk oligonucleotides kjente sekvens, lengde og konsentrasjon. Denne kontrollen er lagt på adapter hemorroider i trinn 3.3.2 og rådet skal inkluderes i alle multiplex biblioteker. Data fra en kontroll prøven burde ha alle oligonucleotides til de forventede input prosenter, med bare svært små bakgrunn leser. Figur 4 viser resultatene av positiv kontroll 17 kjemisk syntetisk oligonucleotides (se tabell 2for sekvenser,), som ble blandet på ekvimolare prosenter. Som forventet, vises alle molekyler i nærheten lik overflod med kun små variasjoner (øverste diagram). Mens de fleste stillinger innen - sss DNA sekvensen som ikke er representert med en oligonucleotide returnerer null Les teller, observerte vi mindre arter som er 1 eller 2 nt kortere enn de faktiske kontrollen oligonucleotides. Vi har ikke videre undersøkt disse mindre arter, men antar at de representerer degradert eller ufullstendig produkter potensielt tilstede i de angitte oligonucleotide på kjøp (oligonucleotides bestilt som HPLC renset, som den produsenten angir > 80% renhet). Bunnen grafen viser kontroll prøven fra et annet bibliotek kjører, der variasjon er litt høyere mellom 17 oligonucleotides og korrelerer med lengde i at lengre kontroll molekyler oppdages mer effektivt og kortere seg. Dette kan skyldes en mindre bias i PCR reaksjoner eller i klynger under MiSeq sekvenser, som har en sett inn størrelse optimal oppstå med biblioteker bærer spesielt bred sett inn områder. En enkel måte å takle denne skjevhet er anvendelsen av en normalisering faktor basert på skråningen som indikerer partiskhet samkjøre molekyl lengde (rosa linje). De nødvendige beregningene er inkludert i analyseprogrammet (se trinn 8.3 i protokollen).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58715/58715fig1.jpg"> Figur 1: Diagram som viser de første trinnene i HIV-1 reversere transkripsjon. Prosessen starter med annealing av tRNA(Lys,3) (oransje) til primer binding området (PBS) i den genomisk viral RNA (trinn 1), som tillater initiering og forlengelse av viral cDNA (blå, trinn 2). Samtidig, er mal genomisk RNA nedverdiget ved RNaseH aktivitet RT (trinn 3). Det første full mellomliggende under omvendt transkripsjon er minus-strand sterk-stopp (-) sss cDNA, som er komplett når RT katalysert polymerisasjon når 5'-endestasjonen til gRNA gjenta (R) regionen (trinn 3). (-) Sss mellomliggende overføres til 3-endestasjonen til malen for genomisk RNA av avspenning til utfyllende terminal 3-lang gjenta (VTH) R regionen. Herfra fortsetter polymerisasjon (trinn 4). I metoden beskrevet bestemmes omvendt transkripsjon progresjon ved å tilordne den nøyaktige lengden på den gryende viral cDNA (blå). PPT, polypurine skrift; U5, unike 5-sekvens; U3, unike 3-sekvens. Dette tallet er publiseres fra en tidligere publikasjon6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58715/58715fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58715/58715fig2v3.jpg"> Figur 2 : Arbeidsflyt disposisjon og skjematisk av kortet ligatur og PCR forsterkning strategi. (a) arbeidsflyt skisserte hovedtrinn av beskrevet teknikken å finne 3-termini i HIV-1 omvendt utskrifter i infiserte celler. Figuren er tilpasset fra en tidligere publikasjon6. (b) skjematisk adapter ligatur og PCR forsterkning strategi. Begynnende cDNA molekyler av varierende lengde som har blitt renset i trinnene er samskrevet til en enkelt-strandet DNA adapter med T4 DNA ligase. Hårnål-adapter (kalt "full Kwok + MiSeq", se tabell 1) design var inspirert av Kwok et al. 11. adapteren bærer en tilfeldig 6 nt strekkode rekkefølge, som gir base-sammenkobling for å lette ligatur og samtidig fungerer som en identifikator for unike lyder. 3-jernbanestasjonen termini av adapteren bærer en avstand (SpC3) for å hindre selv hemorroider. Samskrevet produkter er separert fra overflødig adapter denaturing polyakrylamid gel geleelektroforese (side). Nukleinsyrer i gel er farget og kuttet i tre separate, like store gel biter i området ovenfra adapteren til brønnen som i25. Etter elueringsrør, nedbør og rørets, produktene er PCR forsterket med primere annealing til den kjente serie av adapteren (primer 1, multiplex oligonucleotide kit, se Tabellen for materiale) og en primer bærer de første 22 nt av HIV-1 5'-LTR sekvens umiddelbart etter tRNA (primer 2, MP1.0 + 22HIV). 5'-jernbanestasjonen termini valgte primerne bære adaptere for valgte sekvensering plattformen (P5 og P7) samt en indeks sekvens å skille enkelte eksempler i samme bibliotek. Startpunkt for sekvensering lese primere angis. Den blå boksen angir regionen rundt å bestemme de opprinnelige 3-termini i fanget molekylet. Dette tallet er tilpasset fra en tidligere publikasjon6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58715/58715fig2v3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58715/58715fig3.jpg"> Figur 3 : Representant resultater. (a) Les antallet representative utvalg behandlet med beskrevet protokollen. Dette inkluderer alle sekvenser som ble identifisert som unik leser av HIV-1 molekyler med deres 3-termini innen de første 635 nt av minus tråd cDNA (opp til PPT, se figur 1). Infeksjon med HIV-1 ikke bærer A3G gir flest leser, mens A3G hemmer cDNA syntese og dermed reduserer totalen antall leste. Infisert celler var en negativ kontroll, mens en rekke syntetisk oligonucleotides gir en positiv kontroll. b) den relative overfloden av cDNAs for hver lengde mellom nt posisjoner 23 og 182 (full lengde - sss cDNA er 180 til 182 nt) av HIV-1-NL4.3 sekvens (x-aksen) vises i blå histogrammer (skala på den venstre y-aksen). Den relative overfloden av cDNA ble beregnet fra absolutte antallet sekvenser avslutning på en gitt nucleotide i - sss cDNA sekvensen delt på summen av alle leser måle 182nt eller mindre. Stiplede røde linjer vises prosentandelene av lyder bærer C-til-T/U mutasjoner i respektive posisjon (skala på høyre y--aksen). Figur 3 b publiseres fra en tidligere publikasjon6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58715/58715fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58715/58715fig4.jpg"> Figur 4 : Representant resultatene av kontroll prøver. Vises to profiler for bassenger som inneholder ekvimolare mengder 17 forskjellig lengde syntetiske oligonucleotides. Disse oligonucleotides har sekvenser fra HIV-1NL4.3 og ble valgt til å dekke ulike lengder og presentere alle 4 baser som en 3-nukleotid (se tabell 2). Den øverste grafen viser positive kontroll prøven fra Figur 3et. Det registreres ingen betydelig fordommer mot molekyl lengde eller åpne 3-jernbanestasjonen termini. Bunnen grafen viser et annet bibliotek kjører, som produserte en mindre lengde skjevhet i sekvenser. I dette tilfellet anbefales det å bruke en normalisering faktor, som er avledet fra bakken (vist i rosa) som representerer størrelsen bias. Dette tallet er publiseres fra en tidligere publikasjon6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58715/58715fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Oligo navn</td>
			<td>Lengde i nt</td>
			<td colspan="12">Sekvens</td>
			<td colspan="2">Formål</td>
			<td colspan="2">Produsent (rensing)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">full Kwok + MiSeq</td>
			<td>61</td>
			<td colspan="12">5'-PHO-tgaagagcctagtcgctgttcannnnnnctgcccatagagagatcggaagagcacacgtct-SpC3-3 "</td>
			<td colspan="2">Adapter</td>
			<td colspan="2">IDT DNA teknologier (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">2xBiotin SS agn</td>
			<td>40</td>
			<td colspan="12">5'-biotin-cagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggac-biotin-3 "</td>
			<td colspan="2">Hybrid fange</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Biotin 1-16 ss</td>
			<td>22</td>
			<td colspan="12">5-cagtgtggaaaatctctagcag-BiTEG-3 "</td>
			<td colspan="2">Hybrid fange</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Biotin tRNA + CTG</td>
			<td>16</td>
			<td colspan="12">5-cagtggcgcccgaaca-BITEG-3 "</td>
			<td colspan="2">Hybrid fange</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">MP1.0 + 22HIV</td>
			<td>82</td>
			<td colspan="12">5-aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatctcactgctagagattttccacactg-3 "</td>
			<td colspan="2">PCR forsterkning</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: tabell med oligonucleotides inkludert lengde, sekvenser og endringer som benyttes i beskrevet protokollen. Tabellen er tilpasset fra en tidligere publikasjon6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58715/Table1_Pollpeter.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen som en excel-fil.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Oligo navn</td>
			<td>Lengde i nt</td>
			<td colspan="12">Sekvens</td>
			<td colspan="2">Produsent (rensing)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con lang C</td>
			<td>120</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="6">5-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagctttattgaggcttaagc-3 "</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con lang G</td>
			<td>119</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="6">5-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagctttattgaggcttaag-3 "</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con lang T</td>
			<td>116</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="6">5-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagctttattgaggctt-3 "</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con lang A</td>
			<td>118</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="6">5-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagctttattgaggcttaa-3 "</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con midt C</td>
			<td>76</td>
			<td colspan="12">5-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcac-3 "</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con midt G (a)</td>
			<td>71</td>
			<td colspan="12">5-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacg-3 "</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con midt G (b)</td>
			<td>72</td>
			<td colspan="12">5-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgg-3 "</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con midt A</td>
			<td>69</td>
			<td colspan="12">5-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacaga-3 "</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con midt T</td>
			<td>85</td>
			<td colspan="12">5-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactt-3 "</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con kort A</td>
			<td>40</td>
			<td colspan="12">5-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgaggga-3 "</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con kort T</td>
			<td>33</td>
			<td colspan="12">5-ctgctagagattttccacactgactaaaagggt-3 "</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con kort G</td>
			<td>41</td>
			<td colspan="12">5-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgaggg-3 "</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con kort C</td>
			<td>34</td>
			<td colspan="12">5-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtc-3 "</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP Con 46 (T)</td>
			<td>46</td>
			<td colspan="12">5-ctgctagagattttccacactg actaaaagggtctgagggatctct-3 "</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP Con 83 (C)</td>
			<td>83</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="7">5-ctgctagagattttccacactg actaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactac-3 "</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP Con 103 (C)</td>
			<td>103</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="6">5-ctgctagagattttccacactg actaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagc-3 "</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP Con 107 (A)</td>
			<td>107</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="6">5-ctgctagagattttccacactg actaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagcttta-3 "</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: tabell med 17 syntetiske kontroll oligonucleotides som en positiv kontroll prøven. Top 13 oligonucleotides ble valgt basert på størrelse [lang (116 til 120 nt), mid (69 til 85 nt), kort (33 til 41 nt)] og deres 3-termini. Tabellen er tilpasset fra en tidligere publikasjon6.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58715/Table2_Pollpeter.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen som en excel-fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells at JoVE.com

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

Bestemme 3-Termini og sekvenser av begynnende Single-strandet virus-DNA molekyler i HIV-1 reversere transkripsjon i infiserte celler

Her presenterer vi en dyp sekvensering tilnærming som gir en objektiv bestemmelse av begynnende 3-termini samt mutational profiler av enkelt-strandet DNA molekyler. Hovedprogrammet er karakterisering av begynnende retroviral komplementære DNAs (cDNAs), intermediates generert under prosessen med retroviral omvendt transkripsjon.

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

Denne nye metoden for å analysere omvendt transkripsjon kan fortelle oss nye ting om feltet retro virologi. Vi kan for eksempel lære om detaljene om hvordan cellulære restriksjoner fungerer eller hvordan antiretrovirale legemidler hemmer HIV1 DNA-syntese. Den største fordelen med denne teknikken er at ikke bare gir informasjon om sekvensen av Nascent Reverse Tran scrips, men det tillater kartlegging av deres presise 3-prime DNA termini ved enkelt kjernefysisk stram oppløsning.Berikelsen av HIV1 gratis DNAer fra engros DNA av HIV1 infiserte celler, er gjort av hybrid fangst og bør utføres i en PCR arbeidsstasjon. Forbered en masterblanding av magnetiske streptavidinperler ved å gå på en røret som leder hundre mikroliter per perler per prøve i et enkelt mikrosentridugrør, plasser røret på en magnet som passer for mikrosentrigerør. Etter at perlene har slått seg ned mot magnetsiden av røret, fjern lagringsbufferen, fjern røret fra magneten og re suspendere perlene i fem hundre mikroliter bindevæske vask eller BW buffer.Plasser røret tilbake på magneten, vent til perlene migrerer til magneten, og fjern det overnaturlige. Fjern røret fra magneten, tilsett fem hundre mikroliter med caseinløsning, re suspender perlene og inkuber ved romtemperatur i ti minutter. Etter ti minutter, vask perlene med BW buffer.Plasser røret tilbake på magneten, fjern supernatant og re suspendere perlene i fem hundre mikroliter av BW buffer. Tilsett femti picomoles av hver fanget biotinylert oligonukleotid per prøve. Inkuber ved romtemperatur mens du gynger i en ende over ende mikser i tretti minutter.Deretter returnerer du røret til magneten, fjerner det overnaturlige, fjerner røret fra magneten, legger til fem hundre mikroliter med 1x ti buffer, og re suspendere perlene. Etter den andre vasken re suspendere perlene med immobiliserte oligonucleotides i ti mikroliter på 1x ti buffer per prøve. For hver prøve, merk ett mikrocetrofuge rør og legg til ti mikroliter perlefjæring, ett hundre og sytti mikroliter DNA og nitti mikroliter på 3x ti buffer.Inkuber i en tørr varmeblokk ved nitti to grader celsius i to minutter for å av natur DNA. Flytt rørene til en annen tørr varmeblokk, som er satt til femti to grader Celsius, og inkuber i en time. Hvert tiende minutt under denne inkubasjonen, inverter rørene for å blande.Når en times inkubasjon er ferdig, vask perlene en gang med fem hundre mikroliter på 1x ti buffer, og re suspendere i trettifem mikroliter kjerner med kjernefritt vann. Sørg for at perlene legger seg godt ved å la rørene på magneten i omtrent tre minutter før du fjerner væske. For å elute, inkuber rørene på nitti to grader Celsius i en tørr varmeblokk i to minutter.Deretter flytter du raskt rørene på magneten, ett rør om gangen. Når perlene er bundet til siden av røret, overfører du supernatanten som inneholder HIV1 DNA til et friskt rør. For å starte denne prosedyren, re suspendere lyofilisert adapter på hundre mikromær i kjernefritt vann og vortex røret.Per prøve, pluss en kontrollprøve, kombinere nullpunkt fire fem mikroliter av 10x T4 DNA ligase buffer, fire mikroliter adapter, og punkt null fem mikroliter kjerner av kjernefritt vann. Varm til nitti to grader Celsius i to minutter, og la den avkjøles sakte til seksten grader Celsius i en PCR-maskin. Dette vil tillate adapteren å danne en hårnålstruktur.Hovedtrinnet i denne prosedyren er effektiv og objektiv ligation av tilpassede molekyler for å åpne 3-prime DNA termini. Rensede gryende cDNA molekyler av varierende lengde er ligated til en hårnål enkelt strandet DNA adapter ved hjelp av T4 DNA ligase. Adapteren bærer en tilfeldig seks nukleotid strekkode sekvens, som gjør det mulig for paring å lette ligation, og samtidig fungerer som en identifikator for unike leser.Den 3-prime termini adapter bærer en spacer for å hindre selv ligation. For å sette opp seksti mikroliter siste volum ligation reaksjoner, legg til følgende til hver PCR tube: seks mikroliter av 10x T4 DNA ligase buffer, tjuefire mikroliter av førti prosent PEG, seks mikroliter av fem molar Betaine, fire punkt fem mikroliter av adapter, ett punkt to mikroliter av T4 DNA ligase, og atten punkt deg mikroliter av DNA. Etter å ha blandet reaksjonene godt, inkubere i en PCR-maskin ved seksten grader Celsius over natten.Dagen etter adapteren ligation, på tretti mikroliter av formamid som inneholder DNA gel lasting buffer til hver ligation reaksjon og bland godt ved røroverskrift. Varm i en PCR-maskin ved nittifire grader Celsius i to minutter og legg deretter umiddelbart på is. Det neste trinnet er å forberede seg på denaturing gel elektroforese.Plasser en forhåndsstøpt seks prosent TBE denaturing urea polyakrylamid gel i en passende geltank og tilsett 1x TBE kjører buffer. Forløp gelen i tjue minutter. Deretter bruker du en sprøyte og en tjueen gauge nål for å vaske ut gellommene med løpebuffer.Deretter laster du tretti mikroliter per brønn av samme prøve i tre brønner. Det anbefales å bare kjøre en prøve per gel for å unngå krysskontaminering. Løp i tjue minutter.Mens gelen er i gang, forberede tre nullpunkt fem milliliter mikrocentrifuge rør per prøve ved hjelp av en tjueen gauge sprøyte nål for å stikke hull i bunnen. Sett hver av de tilberedte rørene inn i et to milliliter mikro sentrifugerør og merk dem med prøvenavnet pluss lavt, middels eller høyt. Når den mørkeblå fargestofffronten er omtrent halvveis gjennom gelen, stopp elektroforesen og fjern gelkassetten.Lirk åpne kassetten og kutt gelen vertikalt med et barberblad. For sjenerøst avgiftsdirektoratet stripen med tre brønner av lastede prøver. Tilsett gelstripen i en beholder med 1x TBE og fem mikroliter cyaninekjernesyreflekk og inkuber i tre til fem minutter.Sørg for at farging er tilstrekkelig for å enkelt identifisere toppen av den frie adapteren som skal fjernes senere. Rengjør deretter overflaten av en blå lystransilluminator grundig med destillert de ionisert vann. Ta deretter gelstykket ut av fargebeholderen og legg det på lysboksen.Slå på lysboksen og inspiser de beisede nukleinsyrene gjennom det oransje filteret. En representativ ligated DNA-prøve på en farget gel, er vist her. Adapteren vises vanligvis overbelastet og kjører som en stor blob med ligated HIV1 DNA kjører over som en strek.De røde linjene indikerer stedene gelen skal kuttes for å fjerne fri adapter, og dele prøven i tre like stykker. Bruk et nytt razorblade, kutt bort sidene av gelen hvis det er områder uten prøve lastet fortsatt til stede. Deretter kutter du like over adapteren for å fjerne adapteren og de nedre geldelene.Til slutt, kutt bort toppen av gelen, inkludert omtrent en millimeter av gellommene som ofte har et skarpt intenst signal om høyere molekylvekt-DNA. Del det gjenværende gelstykket som inneholder prøven horisontalt i tre like stykker. Lave, middels og høye molekylære vektområder.Deretter kutter du hvert av de tre gelfragmentene i to med to millimeter stykker og overfører dem til de tilberedte nullpunkt fem milliliter mikrocentrifuge rørene. Spinn i toppfart med åpne lokk i ett minutt. For å presse gelbitene gjennom hullet inn i det to milliliter røret for å lage en gels slaps.Hvis noen gelpartikler forblir i bunnen av nullpunktet fem milliliter rør, overføre dem til de to milliliter røret manuelt ved hjelp av en nål. Begynn DNA ekstraksjon prosedyren ved å legge til en milliliter urea gel ekstraksjon buffer til gel slush i hver mikrocentrifuge rør. Roter rørene med en ende over ende mikser ved romtemperatur i minst tre timer.Klargjør filterkolonnene. Bruk et rent sett med pinsett til å legge til ett lite rundt glassfiberfilter til hver sentrifugesøylen med celluloseacetatmembranfiltre, som forhindrer membranstopping. Sett filteret på plass med en omvendt rørhodespiss.Kort spinne de to milliliter rørene med gel slaps og ekstraksjon buffer i en mikrocentrifuge, og overføre syv hundre mikroliter av supernatant til forberedt filter kolonner. Sentrifuger filterkolonnene i en mikrocentrifuge i toppfart i ett minutt. Deretter overfører strømmen gjennom til et nytt to milliliter mikrocentrifugerør.Last kolonnene på nytt med de gjenværende supernatante. Prøv å få så mye væske som mulig fra ekstraksjon slush og ikke vær bekymret hvis gel stykker er inkludert. Spinn igjen.Kombiner flyten gjennom de samme ekstraksjonseksemplene og fortsett som beskrevet i tekstprotokollen. Denne protokollen ble brukt i prøver fra CEMS-ST-celler infisert med Vif-mangelfull HIV-1 i fravær eller tilstedeværelse av det antiretrovirale humane proteinet A3G. En tomt med totalt antall unike les som er hentet fra hvert utvalg, indikerer at økende nivåer av A3G reduserer det totale lesenummeret.Reflekterer den hemmende effekten av A3G på omvendt transkripsjonmediert cdna syntese. I disse neste tre plottene vises fraksjonen av molekyler på hver mulige lengde i de første hundre åtti to nukleotider, i blå histogrammer. Tilsetningen av A3G kostet en kraftig økning av kortere avkortede cdnamolekyler ved noen svært spesifikke reproduserbare posisjoner.De stiplede røde linjene viser prosentandelene av lesinger som bærer C til T mutasjoner i den respektive posisjonen. En positiv kontroll kan produseres ved å behandle et utvalg av syntetiske oligonukleotider av know-sekvens, lengde og konsentrasjon. Alle molekyler skal vises i nær lik overflod med bare små variasjoner.Hvis en bibliotekkjøring gir en mindre lengdebias, anbefales det å bruke en normaliseringsfaktor som er avledet fra skråningen som representerer størrelsesbias. Denne prosedyren kan lett tilpasses andre systemer der bestemme de tre viktigste endene av DNA molekyler ville legge viktig innsikt i er av nukleinsyre metabolisme. Ikke glem at arbeid med HIV kan være ekstremt farlig, og noen infeksjoner bør bare utføres i utpekte sikkerhetslaboratorier.

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In vitro transkripsjon Analyser og deres program i Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

Sekvens-spesifikke og selektiv anerkjennelse av Double-strandet RNAs over Single-strandet RNAs av kjemisk endret peptid nukleinsyrer

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Immunostaining for DNA modifikasjoner: beregningsorientert analyse av AC Confocal bilder

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Analyse i sanntid av transkripsjon faktor bindende, transkripsjon, oversettelse og omsetning vise globale hendelser under aktivering

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

En protokoll for produksjon av Integrase dårlig Lentiviral vektorer for CRISPR/Cas9-mediert Gene Knockout i dele celler

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Genomet hele overvåking av transkripsjon feil i eukaryote organismer

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Forsterkning av nær full lengde HIV-1-Proviruses for neste generasjons sekvensering

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Omvendt transkripsjon-Loop-mediert isotermiske forsterkning (RT-lampe) analysen for Zika Virus og Housekeeping gener i urin, Serum og mygg prøver

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Forbedret gjær ett-hybrid-skjermer å identifisere transkripsjon faktor Binding til menneskelig DNA-sekvenser

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

Bestemme Egg befruktning Rate av Bemisia tabaci med en Cytogenetic teknikk

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...