Name: determining 3'-termini and sequences of nascent single-stranded viral dna molecules during hiv-1 reverse transcription in infected cells
Uploaded: 2019-01-30T14:00:00
Duration: 13 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells at JoVE.com

Författarna bekräftar stödet från medlemmar av Malim laboratorium, Luis Apolonia, Jernej Ule och Rebecca Oakey. Författarna tackar Matt Arno vid King's College London genomisk centrum och Debbie Hughes vid University College London (UCL), Institutet för neurologi nästa generations sekvensering anläggning, för hjälp med MiSeq sekvensering körs. Arbetet stöddes av den brittiska Medicinska forskningsrådet (G1000196 och MR/M001199/1 till M.M.), Wellcome Trust (106223/Z/14/Z till M.M.), Europeiska kommissionens sjunde ramprogram (FP7/2007-2013) enligt bidragsavtalet ingen. PIIF-GA-2012-329679 (till DP) och till hälsodepartementet via ett nationellt institut för hälsa forskning omfattande Biomedical Research Center award till Guy's and St. Thomas' NHS Foundation Trust i samarbete med King's College London och kungens College Hospital NHS Foundation Trust.

<ol>
	<li>Herschhorn, A., Hizi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+reverse+transcriptases.">Retroviral reverse transcriptases.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (16), 2717-2747 (2010).</li><li>Hu, W. S., Hughes, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+reverse+transcription.">HIV-1 reverse transcription.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (10), (2012).</li><li>Levin, J. G., Mitra, M., Mascarenhas, A., Musier-Forsyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+HIV-1+nucleocapsid+protein+in+HIV-1+reverse+transcription.">Role of HIV-1 nucleocapsid protein in HIV-1 reverse transcription.</a> RNA Biology. 7 (6), 754-774 (2010).</li><li>Menendez-Arias, L., Sebastian-Martin, A., Alvarez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+reverse+transcriptases.">Viral reverse transcriptases.</a> Virus Research. , (2016).</li><li>Telesnitsky, A., Goff, S. P., Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Retroviruses. , (1997).</li><li>Pollpeter, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+sequencing+of+HIV-1+reverse+transcripts+reveals+the+multifaceted+antiviral+functions+of+APOBEC3G.">Deep sequencing of HIV-1 reverse transcripts reveals the multifaceted antiviral functions of APOBEC3G.</a> Nature Microbiology. 3 (2), 220-233 (2018).</li><li>Frohman, M. A., Dush, M. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+production+of+full-length+cDNAs+from+rare+transcripts:+amplification+using+a+single+gene-specific+oligonucleotide+primer.">Rapid production of full-length cDNAs from rare transcripts: amplification using a single gene-specific oligonucleotide primer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (23), 8998-9002 (1988).</li><li>Liu, X., Gorovsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+5'+and+3'+ends+of+Tetrahymena+thermophila+mRNAs+using+RNA+ligase+mediated+amplification+of+cDNA+ends+(RLM-RACE).">Mapping the 5' and 3' ends of Tetrahymena thermophila mRNAs using RNA ligase mediated amplification of cDNA ends (RLM-RACE).</a> Nucleic Acids Research. 21 (21), 4954-4960 (1993).</li><li>Ince, I. A., Ozcan, K., Vlak, J. M., van Oers, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+classification+and+mapping+of+non-polyadenylated+transcripts+of+an+invertebrate+iridovirus.">Temporal classification and mapping of non-polyadenylated transcripts of an invertebrate iridovirus.</a> Journal of General Virology. 94, 187-192 (2013).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-ligase-dependent+biases+in+miRNA+representation+in+deep-sequenced+small+RNA+cDNA+libraries.">RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries.</a> RNA. 17 (9), 1697-1712 (2011).</li><li>Kwok, C. K., Ding, Y., Sherlock, M. E., Assmann, S. M., Bevilacqua, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hybridization-based+approach+for+quantitative+and+low-bias+single-stranded+DNA+ligation.">A hybridization-based approach for quantitative and low-bias single-stranded DNA ligation.</a> Analytical Biochemistry. 435 (2), 181-186 (2013).</li><li>Abram, M. E., Tsiang, M., White, K. L., Callebaut, C., Miller, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+strategy+to+assess+intrinsic+inhibition+efficiencies+of+HIV-1+reverse+transcriptase+inhibitors.">A cell-based strategy to assess intrinsic inhibition efficiencies of HIV-1 reverse transcriptase inhibitors.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (2), 838-848 (2015).</li><li>Bishop, K. N., Verma, M., Kim, E. Y., Wolinsky, S. M., Malim, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APOBEC3G+inhibits+elongation+of+HIV-1+reverse+transcripts.">APOBEC3G inhibits elongation of HIV-1 reverse transcripts.</a> PLoS Pathogens. 4 (12), 1000231 (2008).</li><li>Zack, J. A., Haislip, A. M., Krogstad, P., Chen, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incompletely+reverse-transcribed+human+immunodeficiency+virus+type+1+genomes+in+quiescent+cells+can+function+as+intermediates+in+the+retroviral+life+cycle.">Incompletely reverse-transcribed human immunodeficiency virus type 1 genomes in quiescent cells can function as intermediates in the retroviral life cycle.</a> Journal of Virology. 66 (3), 1717-1725 (1992).</li><li>Adachi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+acquired+immunodeficiency+syndrome-associated+retrovirus+in+human+and+nonhuman+cells+transfected+with+an+infectious+molecular+clone.">Production of acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone.</a> Journal of Virology. 59 (2), 284-291 (1986).</li><li>Shah, V. B., Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+uncoating+of+HIV-1+cores.">In vitro uncoating of HIV-1 cores.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), (2011).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Science+Education+Database:+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology:+Passaging+Cells.">Science Education Database: Basic Methods in Cellular and Molecular Biology: Passaging Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database:+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology:+Using+a+Hemocytometer+to+Count+Cells.">JoVE Science Education Database: Basic Methods in Cellular and Molecular Biology: Using a Hemocytometer to Count Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>Zhou, M. Y., Gomez-Sanchez, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+TA+cloning.">Universal TA cloning.</a> Current Issues in Molecular Biology. 2 (1), 1-7 (2000).</li><li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purifying+plasmid+DNA+from+bacterial+colonies+using+the+QIAGEN+Miniprep+Kit.">Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).</li><li>Mangeat, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+antiretroviral+defence+by+human+APOBEC3G+through+lethal+editing+of+nascent+reverse+transcripts.">Broad antiretroviral defence by human APOBEC3G through lethal editing of nascent reverse transcripts.</a> Nature. 424 (6944), 99-103 (2003).</li><li>Gillick, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+HIV-1+infection+by+APOBEC3+proteins+in+primary+human+CD4(+)+T+cells+is+associated+with+inhibition+of+processive+reverse+transcription+as+well+as+excessive+cytidine+deamination.">Suppression of HIV-1 infection by APOBEC3 proteins in primary human CD4(+) T cells is associated with inhibition of processive reverse transcription as well as excessive cytidine deamination.</a> Journal of Virology. 87 (3), 1508-1517 (2013).</li><li>Harris, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+deamination+mediates+innate+immunity+to+retroviral+infection.">DNA deamination mediates innate immunity to retroviral infection.</a> Cell. 113 (6), 803-809 (2003).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytidine+deaminase+CEM15+induces+hypermutation+in+newly+synthesized+HIV-1+DNA.">The cytidine deaminase CEM15 induces hypermutation in newly synthesized HIV-1 DNA.</a> Nature. 424 (6944), 94-98 (2003).</li><li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iCLIP--transcriptome-wide+mapping+of+protein-RNA+interactions+with+individual+nucleotide+resolution.">iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).</li><li>Troutt, A. B., McHeyzer-Williams, M. G., Pulendran, B., Nossal, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligation-anchored+PCR:+a+simple+amplification+technique+with+single-sided+specificity.">Ligation-anchored PCR: a simple amplification technique with single-sided specificity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (20), 9823-9825 (1992).</li><li>Zhelkovsky, A. M., McReynolds, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+analysis+of+Methanobacterium+thermoautotrophicum+RNA+ligase+-+engineering+a+thermostable+ATP+independent+enzyme.">Structure-function analysis of Methanobacterium thermoautotrophicum RNA ligase - engineering a thermostable ATP independent enzyme.</a> BMC Molecular Biology. 13 (24), (2012).</li><li>Li, T. W., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-independent+and+quantitative+ligation+of+single-stranded+DNA.">Structure-independent and quantitative ligation of single-stranded DNA.</a> Analytical Biochemistry. 349 (2), 242-246 (2006).</li><li>Gansauge, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-stranded+DNA+library+preparation+from+highly+degraded+DNA+using+T4+DNA+ligase.">Single-stranded DNA library preparation from highly degraded DNA using T4 DNA ligase.</a> Nucleic Acids Research. 45 (10), 79 (2017).</li><li>Ding, Y., Kwok, C. K., Tang, Y., Bevilacqua, P. C., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiling+of+in+vivo+RNA+structure+at+single-nucleotide+resolution+using+structure-seq.">Genome-wide profiling of in vivo RNA structure at single-nucleotide resolution using structure-seq.</a> Nature Protocols. 10 (7), 1050-1066 (2015).</li></ol>

Författarna förklarar att de har något att avslöja.

Tillgängligheten för snabb, tillförlitlig och kostnadseffektiv djupsekvensering har revolutionerat många aspekter inom biovetenskap, vilket gör att djupet i sekvensering-baserade analyser. En återstående utmaning ligger i den innovativa design och skapande av representant sekvensering bibliotek. Här beskriver vi ett protokoll för att fånga begynnande viral cDNA molekyler, särskilt intermediärer av HIV-1 omvänd Transkription processen.
Det mest kritiska steget i denna strategi är ligering av en adapter till de öppna 3'-termini i ett kvantitativt och objektivt sätt. Effektivitetsvinsterna av nering mellan två ssDNA termini, både inter- och intramolekylära, har undersökt och optimerad för olika tillämpningar11,26,27,28,29. Val av att använda en hårnål adapter med T4 DNA-ligase enligt de villkor som beskrivs i steg 3.3 är resultatet av empiriska optimering där vi utvärderade olika ligases, adaptrar och reagenser för ligering av syntetiska oligonukleotider som representerar HIV-1 sekvenser (tabell 2), (inga data anges). I dessa in vitro- test reaktioner bekräftat vi att den T4 DNA-ligase medierad ligering av hårnål adaptern, som beskrivs av Kwok et al. 11, har en mycket låg bias, och uppnår nära komplett ligering av acceptor molekyler när adaptern används i överskott. Ligatur effektivitet var opåverkad genom tillsats av nukleotidsekvensen att återge adaptern kompatibel för multiplex primer system (se figur 4). I jämförelse fann vi att en termostabila 5' DNA/RNA ligase (”Ligase A”, se Tabell för material för exakta ligases jämfört med här), som är en konstruerad RNA ligase som utvecklades delvis förbättra ligering effektivitet med ssDNA som acceptorn 27, var verkligen effektivare på ligating två ssDNA molekyler än RNA ligase (”Ligase B”) men hade en betydande bias, med starka skillnader i ligatur effektivitet även mellan oligonukleotider med enda bas längd skillnader [tabell 2 ; HTP con mid G (a) och (b)]. Vidare, Vi hittade endast en minimal bias i reaktioner med ”Ligase C” kombinerat med en adapter som transporterar en randomiserad 5'-termini (en strategi användas för att avräkna kända nukleotid bias av ”Ligase C”; se till exempel Ding et al. 30). dock ”Ligase C”-medierad intermolekylära nering var ofullständiga, rendering systemets T4 DNA-ligase överlägsna valet.
Flera kvalitetskontroll steg över loppet av protokollet och införlivandet av positiva och negativa kontroller möjliggör upptäckt av potentiella problem innan assay fortsättning och ge vägledning för felsökning ansträngningar. De qPCR kvantifieringar i steg 2.2.2 och 2.3.12 säkerställa att kvantiteten av det ingående materialet är tillräcklig. Typiska cDNA kopia nummer i intervallet 200 µL eluering (från steg 2.1) från omkring 10.000 till 300.000 per µL. Steget hybrid capture kan resultera i vissa förlust av övergripande HIV-1 cDNA kvantitet men bör resultera i en stark berikning av specifika HIV-1 cDNA över cellulär DNA, vilket kan avgöras genom att använda lämpliga grundfärger för att kvantifiera genomiskt DNA före och efter anrikning av qPCR eller genom mätning av totala DNA-koncentration. Återvunna HIV-1 cDNA efter hybrid capture steg bör vara minst 10% av indata. Låg som utgångsmaterial kan annars förklara en framgångsrik oligonukleotiden positiv kontroll (se punkt 3.3.2) men endast begränsat läsningar som uppnåtts i proven. Låg Läs siffror övergripande kan också förklaras av överskattning av bibliotek koncentrationen på grund av förekomsten av irrelevanta DNA arter utan MiSeq adaptrar. Detta skulle resultera i kluster med låg densitet och kan förbättras genom att bestämma koncentrationen av HIV-1 sekvenser i biblioteket av qPCR utöver det totala beloppet som DNA av fluorometric analyser. Mycket känsliga pågrund av metoden, bör särskild försiktighet iakttas för att ens lågaktivt kontaminering, både från andra prover (särskilt från hög koncentration kontroll oligonukleotiden bestånden) as well as från laboratorieutrustning. Arbetar i en UV-sterilisering PCR-arbetsstation är fördelaktigt i detta avseende. Den automatiserade gelelektrofores av slutliga biblioteket (steg 6.1.2) är en ytterligare åtgärd för kvalitetskontroll. Nukleinsyra storleksintervallet vanligtvis observeras är mellan 150 till 500 nt. Primers som kan upptäckas i kontrollen efter PCR och innan rening (se anmärkning i steg 5.2) ska nu vara frånvarande. I representativa resultat, prov intensitet kurvan har en topp runt 160-170 nt och en andra skarpare topp omkring 320 till 350 nt. Detta avspeglar sannolikt ofta sett högre överflödet i både relativt kort (1 till 20 nt infoga längd) omvänd avskrifter och fullängds stark-stop (180 – 182 nt infoga längd) (figur 3b).
Medan presenteras protokoll och valda grundfärger är specifika för tidig HIV-1 omvänd Transkription konstruktioner, är metoden allmänt tillämpliga på någon studie som syftar till att fastställa öppna 3'-termini av DNA. De viktigaste ändringarna som krävs i andra sammanhang blir metoden för hybrid capture och primer designstrategi. Till exempel om målet är anpassas till sena HIV-1 avskrifter, ett större antal olika erövrare biotinylerade oligonukleotider glödgning över längden av cDNA vore tillrådligt och kommer sannolikt att minska förlusten i hybrid capture steg. Som nämnts i inledningen, är det viktigt att överväga begränsningar när du utformar spänna över vilka 3'-termini är att upptäcka för att undvika olika källor av partiskhet. Först, det kan finnas en bias i PCR-reaktioner om mallarna med adaptern är av kraftigt varierande längd. Andra, sekvensering plattformen används här (t.ex. MiSeq) har en rekommenderad infoga längdintervall för optimal klustring och betydligt kortare och längre produkter inte kan sekvenseras med samma effektivitet. Delvis, detta kan åtgärdas computationally, vilket gjordes genom att beräkna en korrektionsfaktor för linjär längd bias (se figur 4, nedre diagrammet). Emellertid, om regionen där 3'-termini mappning önskas är lång (> 1000 nt), är det mer lämpligt att dela reaktioner med ligated avskrifter och använda flera uppströms grundfärger för att bedöma 3'-termini i sektioner.
Analys programmet skrevs internt för det specifika syftet att analysera de båda sista nukleotid av HIV-1 sekvens intill sekvensen fast adaptern samt bas variationen i alla baser för att identifiera alla mutationer. De enskilda stegen omfatta följande: först sekvenserna som adaptern trimmas med fastx-0.0.13 toolkit; sedan tas några sekvenser som är duplicerade (dvs identiska sekvenser inklusive streckkoden) bort. Alla återstående unika läsningar justeras sedan sekvensen HIV-1 med Bowtie (http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml) med en maximal felmatchning vid tre baser. Sekvensen mallen består av de första 635 nt av HIV-1 cDNA (NL4.3-stam), som innehåller sekvensen - sss och den första strand transfer produkten upp till polypurine spåret (U5-R-U3-PPT, se figur 1). Därmed, är den medföljande programvaran och mallar endast direkt lämplig om metoden som används för samma program (identifiering av tidiga omvänd avskrifter av de HIV-1NL4.3). Justeringar får göras för andra mål sekvenser. Positionerna för 3'-termini för varje Läs bestämdes av positionen i anpassningen. Bas samtal för varje position registreras och mutation priser beräknas från den totala täckningen för varje base, som varierar, som läser är av olika längder och långa skär inte helt täckas av 125-base sekvensering i Read2.
Avslutningsvis anser vi att den beskrivna metoden vara ett värdefullt verktyg för många typer av studier. Uppenbara applikationer inkluderar undersökningar av mekanismerna bakom omvänd Transkription hämning genom antiretrovirala läkemedel eller cellulära begränsning faktorer. Endast relativt små justeringar bör dock nödvändigt att anpassa systemet till 3'-termini kartläggning inom andra enkelsträngat DNA viral intermediärer, som är närvarande, till exempel i parvovirus replikering. Dessutom kan principen om metoden, särskilt dess optimerade ligering steg, ge en central del av biblioteket förberedelse design för karakterisering av alla 3'-DNA tillägg, inklusive elongationer katalyseras av cellulära dubbelsträngat DNA polymeraser.

För att analysera och förstå virusreplikation helt, allt mer raffinerade metoder som fångar replikering krävs intermediärer. Särskilt den exakta definitionen av viral nukleinsyra arter inom ramen av infekterade celler kan ge nya insikter, eftersom många virusreplikation mekanismer har hittills varit undersökt i isolerade in vitro- reaktioner. Ett paradexempel är processen för omvänd Transkription i retrovirus, såsom humant immunbristvirus 1 (HIV-1). De olika stegen i HIV-1 omvänd Transkription, under vilken den virala enzymet omvänt transkriptas (RT) kopierar enkelsträngat RNA genomet till dubbelsträngat DNA, har varit studerade framförallt primer filändelsen analyser med renade proteiner och nucleic syror1,2,3,4,5. Medan grundläggande principer fastställdes, sådana analyser införliva inte alla viral och cellulära komponenter och kanske inte återspeglar biologiskt relevanta stoichiometries inblandade faktorer. Därför utformade vi en kraftfull teknik för att bestämma spektra av omvänd Transkription intermediärer med sin precisa cDNA 3'-termini (dvs. att bestämma deras exakta längder) och nukleotidsekvenser i samband med infektioner i levande celler6. Insamling av data från tid kursen experiment kan utnyttjas för att jämföra profilen för utskrifter på olika villkor, till exempel förekomsten av antivirala molekyler eller proteiner, som kan påverka effektiviteten och processivity av DNA-syntes och ackumulation. Detta tillåter en mer detaljerad förståelse av naturliga patogen livscykel, som ofta ligger till grund för riktade läkemedelsdesign och framgångsrika terapeutisk intervention.
HIV-1 omvänd Transkription består av en serie på varandra följande händelser som initierats av glödgning av en tRNA primer till genomisk RNA mallen som förlängs sedan med RT att producera en kort enkelsträngat cDNA avskrift kallas minus-strand stark-stopp (-sss) (se (Se figur 1). Därefter, den - sss cDNA överförs från 5'-lång terminalen upprepa (LTR) till den 3'-LTR av genomisk RNA, där det anneals och serverar som primer för fortsatt RT medierad töjning av minus strand DNA (se recensioner på omvänd Transkription1 , 2 , 3 , 4). denna första strand-överföring är en av de hastighetsbegränsande stegen i omvänd Transkription; Därför kallas den - sss cDNA ansamlas. Den grundläggande arbetsflöde och bibliotek designen att fånga omvänd Transkription produkter i infekterade celler beskrivs i figur 2a. Den specifika primers och analys inställningar som används i protokollet och som anges i tabell 1 rikta alla tidigt omvänd Transkription cDNA intermediärer inom intervallet längd på 23 till ~ 650 nt, som inkluderar de 180-182 nt - sss DNA. Lämpliga mindre anpassningar till strategin kommer dock tillåta program att inte bara sena omvänd Transkription produkter, men även andra virus och system, där målet är att upptäcka 3'-OH innehållande DNA-ändarna. Viktiga begränsningar att tänka inkludera längd spänna av den slutliga PCR-produkten i biblioteket. i synnerhet kommer mallar där avståndet mellan adaptern på den öppna 3'-terminus och webbplatsen uppströms primer överstiga ~ 1000 nt sannolikt mindre effektivt sekvenseras, potentiellt införa vilseledande tekniska fördomar under bibliotek förberedelse ( Se diskussion för mer detaljer och anpassning förslag).
Tidigare har rapporterade metoder för systematisk bestämning av 3'-termini nukleinsyra kardeler fokuserat på RNA, inte DNA, molekyler. Ett exempel är 3' RACE (snabb förstärkning av cDNA slutar)7, som bygger på polyadenylation mRNA. Dessutom utvecklades adapter ligation-baserade strategier anställa RNA ligases, som har inkluderat RLM-RACE (RNA ligase-medierad RACE)8 eller spetsar (ligation-baserade förstärkning av cDNA slutar)9. Det är viktigt att betona att ligation-baserade kompletteringar är känsliga för någon bias som införts av ligering reaktionen själv. Till exempel kan ligering vara mer eller mindre effektiv beroende på en viss nukleotid i position 3', sekvens, totala molekyl längd eller lokala struktur. Sådan ligase inställningar leda till ofullständig fånga av molekyler och förvrängning i utläsningen, som vi och andra har observerat9,10. För att minimera ligering bias under adapter tillägg stegen i det protokoll som beskrivs häri, vi testat ett antal ligering strategier och hittade användningen av T4 DNA-ligase med en hårnål enkelsträngat DNA adapter (som beskrivs av Kwok et al. 11) vara det enda förfarandet med nära kvantitativa ligering som inte ledde till betydande skillnader i ligatur effektivitet när bedömas med en särskilt vald uppsättning kontroll oligonukleotider6. Valet av denna ligatur strategi är därför en viktig del i framgången för detta protokoll.
Hittills har övervakningen av HIV-1 RT progression i infekterade celler har främst åstadkommits genom att mäta omvänd Transkription produkter av olika längd med kvantitativ PCR (qPCR) använda primer-probe uppsättningar som unikt mäter kortare eller längre (tidiga och sent, respektive) cDNA produkter12,13,14. Medan detta qPCR tillvägagångssätt är lämpligt att fastställa inneboende effektivitetsvinster av omvänd Transkription processen i cellulära system, är utdata av relativt låg upplösning, utan sekvens information kommer. Vår nya strategi, baserad på optimerad adapter ligatur, PCR-medierad bibliotek generation och djupsekvensering adresser teknikklyftan och erbjuder en möjlighet att övervaka omvänd Transkription under HIV-1 infektion kvantitativt och på enda nukleotid upplösning.
Vi har illustrerat nyttan av denna metod i en studie som skiljer mellan två föreslagna modeller med kapacitet av HIV-1 begränsning faktorn APOBEC3G (apolipoprotein B mRNA redigering enzym katalytisk polypeptid-liknande 3G) att ingripa med den produktion av viral omvänd avskrifter6.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:743px;" width="743">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">293T cells</td>
			<td style="width:160px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-3216</td>
			<td style="width:209px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15150-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">HeraCell Vios 250i CO2 Incubator</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td>51030966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Laminar flow hood - CAS BioMAT2</td>
			<td style="width:160px;">Wolflabs</td>
			<td style="width:119px;">CAS001-C2R-1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">10mm TC-treated culture dish</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">TrypLE&#8482; Express (1x), Stable Trypsin Replacement Enzyme</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">OptiMEM&#174; (Minimal Essential Medium)</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31985-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3)</td>
			<td style="width:160px;">NIH Aids reagent program</td>
			<td style="width:119px;">114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Polyethylenimine (PEI) - MW:25000</td>
			<td style="width:160px;">PolySciences Inc</td>
			<td>23966-2</td>
			<td>dissolved at 1mg/ml and adjusted to pH7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">RQ1- Rnase free Dnase</td>
			<td style="width:160px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">M6101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Filter 0.22 &#956;m</td>
			<td style="width:160px;">Triple Red Limited</td>
			<td>FPE404025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">15 mL polypropylene tubes</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td>CLS430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Sucrose</td>
			<td style="width:160px;">Calbiochem</td>
			<td>573113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:160px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">344060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:160px;">Sorval</td>
			<td style="width:119px;">WX Ultra Series</td>
			<td>Th-641 Rotor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Alliance HIV-1 p24 antigen ELISA kit</td>
			<td style="width:160px;">Perkin Elmer</td>
			<td>NEK050001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">CEM-SS cells</td>
			<td style="width:160px;">NIH Aids reagent program</td>
			<td>776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Roswell Park Memorial Institute Medium</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31870-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">CoStar&#174; TC treated multiple well plates</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">CLS3513-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Benchtop centrifuge: Heraus&#8482; Multifuge&#8482; X3 FR</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td>75004536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">TX-1000 Swinging Bucket Rotor</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td>75003017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Microcentrifuge: 5424R</td>
			<td style="width:160px;">Eppendorf</td>
			<td>5404000060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Total DNA extraction kit (DNeasy Blood and Tissue kit)</td>
			<td style="width:160px;">Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Nuclease free H2O</td>
			<td style="width:160px;">Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Cutsmart buffer</td>
			<td style="width:160px;">New England Biolabs (part of DpnI enzyme)</td>
			<td style="width:119px;">R0176S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">DpnI restriction enzyme</td>
			<td style="width:160px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R0176S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Oligonucleotides for qPCR</td>
			<td style="width:160px;">MWG Eurofins</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>HPSF purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">TaqMan PCR Universal Mastermix</td>
			<td style="width:160px;">Thermo</td>
			<td>4304437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">LoBind Eppendorf&#174; tubes</td>
			<td style="width:160px;">Eppendorf</td>
			<td>30108078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Axygen&#8482; aerosol filter pipette tips, 1000 &#956;L</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td>TF-000-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Axygen&#8482; aerosol filter pipette tips, 200 &#956;L</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td>TF-200-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Axygen&#8482; aerosol filter pipette tips, 20 &#956;L</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td>TF-20-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Axygen&#8482; aerosol filter pipette tips, 10 &#956;L</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">TF-10-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">PCR clean hood</td>
			<td style="width:160px;">LabCaire</td>
			<td style="width:119px;">Model PCR-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">DynaMag&#8482;2-magnet</td>
			<td style="width:160px;">Thermo</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Streptavidin MagneSphere&#174; paramagnetic particles</td>
			<td style="width:160px;">Promega</td>
			<td>Z5481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Casein</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">37582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">End over end rotator, Revolver&#8482; 360&#176;</td>
			<td style="width:160px;">Labnet</td>
			<td style="width:119px;">H5600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tris-Base</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td>H1758-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">EDTA disodium salt dihydrate</td>
			<td style="width:160px;">Electran (VWR)</td>
			<td style="width:119px;">443885J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Dri-Block&#174; Analog Block Heater</td>
			<td style="width:160px;">Techne</td>
			<td>UY-36620-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">PCR tubes and domed caps</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td>AB0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">PCR machine</td>
			<td style="width:160px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">Mastercycler&#174; series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:160px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0202M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">40% Polyethylene glycol solution (PEG) in H2O, MW: 8000</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td>P1458-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Betaine solution, 5M</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td>B0300-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Gel loading buffer II (formamide buffer)</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td>AM8546G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Precast 6% TBE urea gels</td>
			<td style="width:160px;">Invitrogen</td>
			<td>EC6865BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Mini cell electrophoresis system</td>
			<td style="width:160px;">Invitrogen, Novex</td>
			<td>XCell SureLock&#8482;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tris/Borate/EDTA solution (10x)</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td>10031223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Needle 21 G x1 1/2</td>
			<td style="width:160px;">VWR</td>
			<td>613-2022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">SYBR Gold nucleic acid stain (10000x)</td>
			<td style="width:160px;">Life Technologies</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Dark Reader DR46B transilluminator</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td>NC9800797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ammonium acetate</td>
			<td style="width:160px;">Merck</td>
			<td>101116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">SDS solution 20% (w/v)</td>
			<td style="width:160px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">161-0418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Centrifuge tube filter</td>
			<td style="width:160px;">Appleton Woods</td>
			<td style="width:119px;">BC591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Filter Glass Fibre Gf/D 10mm</td>
			<td style="width:160px;">Whatman (VWR)</td>
			<td>512-0427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">polyadenylic acid (polyA) RNA</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td>10108626001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Glycogen, molecular biology grade</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td>R0561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Isopropanol (2-propanol)</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td>15809665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ethanol, molecular biology grade</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td>10041814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Accuprime&#8482; Supermix I (DNA polymerase premix)</td>
			<td style="width:160px;">Life Technologies</td>
			<td>12342-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">NEBNext&#174; Multiplex Oligo for Illumina (Index Primer Set 1 and 2)</td>
			<td style="width:160px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">E7335S; E7500S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Tapestation D1000 Screentape High sensitivity</td>
			<td style="width:160px;">Agilent Technologies</td>
			<td>5067- 5584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tapestation D1000 Reagents</td>
			<td style="width:160px;">Agilent Technologies</td>
			<td>5067- 5585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">2200 Tapestation - automated gel electrophoresis system</td>
			<td style="width:160px;">Agilent Technologies</td>
			<td>G2965AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Agencourt&#174; AMPure&#174; beads XP</td>
			<td style="width:160px;">Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Qubit&#8482; dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td style="width:160px;">Invitrogen</td>
			<td>Q32851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Qubit&#8482; 2.0 Fluorometer</td>
			<td style="width:160px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Topo&#8482; TA cloning Kit</td>
			<td style="width:160px;">Invitrogen</td>
			<td>450071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Sequencing platform: MiSeq System</td>
			<td style="width:160px;">Illumina</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:255px;">Experiment Manager (Sample sheet software)</td>
			<td style="width:160px;">Illumina</td>
			<td style="width:119px;">Note: Use TruSeq LT as a template</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Miseq&#8482; Reagent kit V3 (150 cycle)</td>
			<td style="width:160px;">Illumina</td>
			<td>MS-102-3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Sequencing hub: Basespace</td>
			<td style="width:160px;">Illumina</td>
			<td style="width:119px;">https://basespace.illumina.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ligase A: Thermostable 5&#8217; App DNA/RNA ligase</td>
			<td style="width:160px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0319S</td>
			<td style="width:209px;">Not used in this protocol, but tested in optimization process with results described in the discussion.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ligase B: T4 RNA ligase 1</td>
			<td style="width:160px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0204</td>
			<td style="width:209px;">Not used in this protocol, but tested in optimization process with results described in the discussion.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ligase C: CircLigase</td>
			<td style="width:160px;">Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">CL4111K</td>
			<td style="width:209px;">Not used in this protocol, but tested in optimization process with results described in the discussion.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining 3'-termini and sequences of nascent single-stranded viral dna molecules during hiv-1 reverse transcription in infected cells

Övervakning av nukleinsyra intermediärer under virusreplikation ger insikter om de effekter och verkningsmekanismer av antivirala substanser och värd cellproteiner på virala DNA-syntes. Här åtgärda vi bristen på en cell-baserat, hög-täckning och högupplösta analysen som kan definiera retrovirala omvänd Transkription intermediärer inom fysiologiska samband med virusinfektion. Den beskrivna metoden fångar 3'-termini begynnande kompletterande DNA (cDNA)-molekyler inom HIV-1 infekterade celler enda nukleotid upplösning. Protokollet innebär skörd hela cellens DNA, riktade anrikning av virala DNA via hybrid capture, adapter ligatur, storlek fraktionering av gel rening, PCR-amplifiering, djupsekvensering och dataanalys. Ett viktigt steg är den effektiv och opartisk ligering av adapter molekyler att öppna 3'-DNA termini. Tillämpningen av den beskrivna metoden avgör överflödet av omvänd avskrifter av varje särskild längd i ett givet prov. Det ger också information om (intern) sekvens variationen i omvänd avskrifter och därmed eventuella potentiella mutationer. I allmänhet är analysen lämplig för alla frågor som avser DNA 3'-extension, förutsatt att sekvensen mall är kända.

Tekniken som beskrivs i denna artikel har tillämpats på en bredare studie för att ta itu med de mekanismerna bakom hämning av HIV-1 omvänd Transkription av antiretroviral mänskliga proteinet APOBEC3G (A3G)6. Figur 3 visar representativa resultat erhålls efter sysselsätter protokollet i prover från CEM-SS T-celler som smittats med vif-bristfälliga HIV-1 i frånvaron eller närvaron av A3G. Det totala antalet unika läsningar erhålls från varje prov efter filtrera bort eventuella PCR dubbletter som har den samma 6 nt streckkod och samma längd (framförd av analys programvara tillhandahåller) ritas i figur 3en. Ökande nivåer av A3G minska totala Läs återspeglar den hämmande effekten av A3G på RT medierad cDNA syntes tidigare beskrivs och mätt med qPCR6,13,21,22. I figur 3bvisas fraktionen molekyler vid varje möjligt längd inom de första 182 nt. För HIV-1 infektion i avsaknad av A3G, de vanligast förekommande arterna är den huvudsakliga 180 nt stark-stop molekylen själv, med vissa ackumulering av läser i intervallet kortare (23 till 40 nt) (övre grafen, blå histogram). Tillägg av A3G förändringar denna profil som en kraftig ökning av kortare, trunkerade cDNA molekyler på några mycket specifika, reproducerbara positioner är upptäckt (mellersta och nedre grafer). Eftersom A3G är en cytidindeaminas, cytosin-till-uridin (identifieras som C-till-T) uppstå mutationer i cDNA när A3G är närvarande i den infekterande virioner21,23,24. Använder den erhållna sekvensinformation, var procentandelen av C-till-T mutationer ritad på i samma graf (röd streckad linje). Det bör noteras att mutationsanalys profilen härleds från alla unika läsningar kombinerat och täckning av varje nukleotid varierar. Dock om det behövs information om aktivitetssekvens kan vara relaterade till varje molekyl och korrelerade med en specifik 3'-terminus. Uppgifterna togs från Pollpeter et al. 6 och korrelationen mellan mutationsanalys och cDNA längd profiler påvisades för att bero på upptäckt och klyvning av deaminated cDNA av cellulära DNA reparerar maskiner.
En positiv kontroll för metoden 3'-mappning kan enkelt produceras genom att bearbeta en pool av syntetiska oligonukleotider av känd sekvens, längd och koncentration. Denna kontroll läggs på den adapter ligation i steg 3.3.2 och rekommenderas att ingå i alla multiplexade bibliotek. Data som erhållits från ett kontrollprov bör ha alla oligonukleotider de beräknade ingående nyckeltal, med endast mycket mindre bakgrunden läser. Figur 4 visar resultaten av en positiv kontroll uppsättning 17 kemiskt syntetiserade oligonukleotider (för sekvenser, se tabell 2), som blandades vid equimolar förhållanden. Som förväntat, visas alla molekyler i nära lika överflöd med endast små variationer (övre diagrammet). Medan de flesta befattningar inom - sss DNA-sekvensen som inte var företrädda av en oligonukleotid returnerar noll Läs räknas, observerat vi mindre arter som är 1 eller 2 nt som är kortare än de faktiska kontroll oligonukleotider. Vi har inte ytterligare undersökt dessa mindre arter men antar att de representerar försämrade eller ofullständig produkter som potentiellt finns i medföljande oligonukleotiden lagren vid köpet (oligonukleotider beställdes som HPLC renas, för vilka den tillverkaren anger > 80% renhet). Nedre diagrammet visar stickprov från ett annat bibliotek köra, där variationen är något högre mellan de 17 oligonukleotider och korrelerar med Totallängd däri längre kontroll molekyler upptäcks mer effektivt då kortare sådana. Detta kan bero på en mindre bias i PCR-reaktioner eller i kluster under MiSeq sekvensering, som har en Infoga storlek optimal och uppstå med bibliotek bär särskilt bred infoga spänner. Ett grundläggande sätt att åtgärda denna snedvridning är tillämpningen av en normalisering faktor utifrån lutningen som anger bias korrelera till molekyl längd (rosa linje). Beräkningarna som krävs ingår i programmet analys (se steg 8,3 i protokollet).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58715/58715fig1.jpg"> Figur 1: Diagram som visar de första stegen av HIV-1 omvänd Transkription. Processen börjar med glödgning av tRNA(Lys,3) (orange) till primer bindningsstället (PBS) i den genomiska viral RNA (steg 1), som tillåter initiering och töjning av viral cDNA (blå, steg 2). Samtidigt bryts mall genomisk RNA av RNaseH aktivitet av RT (steg 3). Den första fullständiga mellanliggande i processen omvänd Transkription är minus-strand stark-hållplatsen (-) sss cDNA, som är komplett när RT katalyseras polymerisation når 5'-slutstationen för gärna upprepa (R) regionen (steg 3). Den (-) sss mellanliggande överförs till 3'-slutstationen för mallen genomisk RNA av glödgning till kompletterande 3'-long terminal upprepa (LTR) R regionen. Här fortsätter polymerisation (steg 4). I den beskrivna metoden bestäms omvänd Transkription progression genom att mappa den exakta längden på den begynnande viral cDNA (blå). PPT, polypurine tarmkanalen; U5, unika 5'-sekvens; U3, unik 3'-sekvensen. Denna siffra publiceras från en tidigare publikation6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58715/58715fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58715/58715fig2v3.jpg"> Figur 2 : Arbetsflöde disposition och scheman över den adaptern ligering och PCR-amplifiering strategi. (a) arbetsflöde beskriver huvudsteg av beskrivs tekniken att avgöra 3'-termini av HIV-1 omvänt avskrifter i infekterade celler. Siffran är anpassade från en tidigare publikation6. (b) Schematisk av adapter ligering och PCR-amplifiering strategi. Begynnande cDNA molekyler av varierande längd som har renats i föregående steg är sammanskrivna till ett enkelsträngat DNA adapter använder T4 DNA-ligase. Hårnål adaptern (namngiven ”full Kwok + MiSeq”, se tabell 1) design inspirerad av Kwok et al. 11. adaptern bär ett slumpmässigt 6 nt streckkod sekvens, som möjliggör base-ihopkoppling för att underlätta ligering och samtidigt fungerar som en identifierare för unik läsningar. 3'-termini adapterns bär en spacer (SpC3) för att förhindra själv ligering. Sammanskrivna produkter är separerade från överflödigt adapter med denatureringen polyakrylamid gelelektrofores (sidan). Nukleinsyror i gel är målat och skär i tre separata, lika-storlek gel bitar i området från ovan adaptern till brunnen som gjort i25. Efter eluering, nederbörd och resuspension, produkterna är PCR amplifieras med grundfärg glödgning till den känd sekvensen av adaptern (primer 1, multiplex oligonukleotiden kit, se Tabell av material) och en primer som transporterar de första 22 nt av HIV-1 5'-LTR sekvens omedelbart efter tRNAen (primer 2, MP1.0 + 22HIV). 5'-termini av valda primers bär adaptrar för den valda sekvensering plattformen (P5 och P7) samt en index-sekvens för att särskilja enskilda prover som kör i samma bibliotek. Utgångspunkterna för sekvensering Läs primers indikeras. Den blå rutan anger regionen av intresse att bestämma de ursprungliga 3'-termini av infångade molekylen. Denna siffra är anpassade från en tidigare publikation6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58715/58715fig2v3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58715/58715fig3.jpg"> Figur 3 : Representativa resultat. (a) den totala Läs räkningen av representativa prover bearbetas med protokollet beskrivs. Detta inkluderar alla sekvenser som identifierades som unika läsningar av HIV-1 molekyler med sina 3'-termini inom de första 635 nt av minus strand cDNA (upp till PPT, se figur 1). Infektion med HIV-1 inte bära A3G ger det högsta antalet läsningar, medan A3G hämmar cDNA syntes och därmed minskar den totala antal läsningar. Oinfekterade celler tjänade som en negativ kontroll, medan ett antal syntetiska oligonukleotider ger en positiv kontroll. (b) det relativa överflödet av cDNAs för varje längd mellan nt positioner 23 och 182 (fullängds - sss cDNA är 180 – 182 nt) av de HIV-1NL4.3 sekvens (x-axeln) visas i blå histogram (skala på vänster y-axeln). Det relativa överflödet av cDNA beräknades från det absoluta antalet sekvenser terminerande på en given nukleotid inom - sss cDNA sekvensen dividerat med summan av alla läser mäta 182nt eller mindre. Visas i streckade röda linjer är procentsatserna av läser transporterar C-till-T/U mutationer på respektive position (skala på höger y–axlarna). Figur 3 b är publiceras från en tidigare publikation6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58715/58715fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58715/58715fig4.jpg"> Figur 4 : Representativa resultat av kontrollprover. Visas två profiler för pooler som innehåller equimolar mängder av 17 olika längd syntetiska oligonukleotider. Dessa oligonukleotider har sekvenser från HIV-1NL4.3 och valdes ut för att täcka olika längder och presentera alla 4 baser som en 3'-nukleotid (se tabell 2). Översta grafen visar positiv kontrollprovet från figur 3en. Inga betydande bias mot molekylen längd eller öppen 3'-termini upptäcks. Den nedre grafen visar ett annat bibliotek kör, som producerade en mindre längd bias i sekvensering. I detta fall är det lämpligt att tillämpa en normalisering faktor, som härrör från backen (visas i rosa) som representerar storlek bias. Denna siffra publiceras från en tidigare publikation6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58715/58715fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Oligo namn</td>
			<td>Längd i nt</td>
			<td colspan="12">Sekvens</td>
			<td colspan="2">Syfte</td>
			<td colspan="2">Tillverkaren (rening)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">full Kwok + MiSeq</td>
			<td>61</td>
			<td colspan="12">5'-PHO-tgaagagcctagtcgctgttcannnnnnctgcccatagagagatcggaagagcacacgtct-SpC3-3'</td>
			<td colspan="2">Adapter</td>
			<td colspan="2">IDT DNA teknik (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">2xBiotin SS bete</td>
			<td>40</td>
			<td colspan="12">5'-biotin-cagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggac-biotin-3'</td>
			<td colspan="2">Hybrid Capture</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Biotin 1-16 ss</td>
			<td>22</td>
			<td colspan="12">5'-cagtgtggaaaatctctagcag-BiTEG-3'</td>
			<td colspan="2">Hybrid Capture</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Biotin tRNA + CTG</td>
			<td>16</td>
			<td colspan="12">5'-cagtggcgcccgaaca-BITEG-3'</td>
			<td colspan="2">Hybrid Capture</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">MP1.0 + 22HIV</td>
			<td>82</td>
			<td colspan="12">5'-aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatctcactgctagagattttccacactg-3'</td>
			<td colspan="2">PCR-amplifiering</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: tabell över oligonukleotider inklusive längd, sekvenser och modifieringar som utnyttjas i protokollet beskrivs. Tabellen är anpassade från en tidigare publikation6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58715/Table1_Pollpeter.xlsx" target="_blank">Vänligen klicka här för att ladda ner tabellen som en excel-fil.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Oligo namn</td>
			<td>Längd i nt</td>
			<td colspan="12">Sekvens</td>
			<td colspan="2">Tillverkaren (rening)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con lång C</td>
			<td>120</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="6">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagctttattgaggcttaagc-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con lång G</td>
			<td>119</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="6">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagctttattgaggcttaag-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con lång T</td>
			<td>116</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="6">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagctttattgaggctt-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con long A</td>
			<td>118</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="6">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagctttattgaggcttaa-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con mitten av C</td>
			<td>76</td>
			<td colspan="12">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcac-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con mitten av G (a)</td>
			<td>71</td>
			<td colspan="12">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacg-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con mitten av G (b)</td>
			<td>72</td>
			<td colspan="12">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgg-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con mitten A</td>
			<td>69</td>
			<td colspan="12">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacaga-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con mid T</td>
			<td>85</td>
			<td colspan="12">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactt-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con kort A</td>
			<td>40</td>
			<td colspan="12">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgaggga-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con kort T</td>
			<td>33</td>
			<td colspan="12">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggt-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con kort G</td>
			<td>41</td>
			<td colspan="12">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgaggg-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con kort C</td>
			<td>34</td>
			<td colspan="12">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtc-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP Con 46 (T)</td>
			<td>46</td>
			<td colspan="12">5'-ctgctagagattttccacactg actaaaagggtctgagggatctct-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP Con 83 (C)</td>
			<td>83</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="7">5'-ctgctagagattttccacactg actaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactac-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP Con 103 (C)</td>
			<td>103</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="6">5'-ctgctagagattttccacactg actaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagc-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP Con 107 (A)</td>
			<td>107</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="6">5'-ctgctagagattttccacactg actaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagcttta-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: tabell över 17 syntetiska kontroll oligonukleotider används som positivt kontrollprov. De topp 13 oligonukleotider valdes utifrån storlek [lång (116-120 nt), mid (69-85 nt), kort (33 – 41 nt)] samt deras 3'-termini. Tabellen är anpassade från en tidigare publikation6.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58715/Table2_Pollpeter.xlsx" target="_blank">Vänligen klicka här för att ladda ner tabellen som en excel-fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells at JoVE.com

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

Avgörande 3'-Termini och sekvenser av begynnande enkelsträngat virala DNA-molekyler under HIV-1 omvänd Transkription i infekterade celler

Här presenterar vi en djupsekvensering strategi som ger en objektiv bestämning av begynnande 3'-termini samt mutationsanalys profiler enkelsträngat DNA-molekyler. Huvudprogrammet är karakterisering av begynnande retrovirala kompletterande DNAs (cDNAs), de intermediärer som genereras under processen för retrovirala omvänd Transkription.

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

Denna nya metod för att analysera omvänd transkription kan berätta nya saker om området retro virologi. Till exempel kan vi lära oss om detaljerna i hur cellulära begränsningar faktorer fungerar eller hur antiretrovirala läkemedel hämmar HIV1 DNA-syntes. Den största fördelen med denna teknik är att inte bara ger information om sekvensen av Nascent Reverse Tran scrips, men det tillåter kartläggning av deras exakta 3-prime DNA termini vid enda nukleära snäva upplösning.Anrikning av HIV1 gratis DNAs från grossist-DNA av HIV1 infekterade celler, görs genom hybrid fånga och bör utföras i en PCR arbetsstation. Förbered en masterblandning av magnetiska streptavidinpärlor med rörrubrik hundra mikroliter av pärlor per prov i ett enda mikrocentrifugrör placera röret på en magnet som är lämplig för mikrocentrifugrör. Efter pärlorna har bosatt sig mot magnet sidan av röret, ta bort lagringsbuffert, ta bort röret från magneten, och åter upphäva pärlorna i fem hundra mikroliter av bindent tvätta eller BW buffert.Placera röret tillbaka på magneten, vänta på pärlorna att migrera till magneten, och ta bort supernatanten. Ta bort röret från magneten, tillsätt fem hundra mikroliter av caseinlösning, åter upphäva pärlorna, och inkubera i rumstemperatur i tio minuter. Efter tio minuter, tvätta pärlorna med BW buffert.Placera tillbaka röret på magneten, ta bort supernatanten och häng upp pärlorna på tillbaka femhundra mikroliter BW-buffert. Lägg till femtio picomoles av varje fångad biotinylerad oligonukleotid per prov. Inkubera i rumstemperatur medan gunga i en ände över slutblandare i trettio minuter.Därefter tillbaka röret till magneten, ta bort supernatanten, ta bort röret från magneten, tillsätt femhundra mikroliter av 1x tio buffert, och åter upphäva pärlorna. Efter den andra tvätten re suspend pärlorna med den immobiliserade oligonukleotider i tio mikroliter av 1x tio buffert per prov. För varje prov, etikett en mikrocetrofugering rör och tillsätt tio mikroliter av pärla suspension, ett hundra sjuttio mikroliter av DNA, och nittio mikroliter av 3x tio buffert.Inkubera i ett torrt värmeblock vid nittiotvå grader celsius i två minuter för att de natur DNA. Flytta rören till en annan torr värmeblock, som är inställd på femtio två grader Celsius, och inkubera i en timme. Var tionde minut under denna inkubation, invertera rören att blanda.När en timme inkubation är klar, tvätta pärlorna en gång med fem hundra mikroliter av 1x tio buffert, och åter avbryta i trettio fem mikroliter av nukleas fritt vatten. Se till att pärlorna lägger sig väl genom att lämna rören på magneten i cirka tre minuter innan du tar bort någon vätska. För att elera, inkubera rören vid nittiotvå grader Celsius i ett torrt värmeblock i två minuter.Sedan, snabbt flytta rören på magneten, ett rör i taget. När pärlorna är bundna till sidan av röret, överföra supernatant som innehåller HIV1 DNA till ett nytt rör. För att börja detta förfarande, åter upphäva lyophilized adaptern vid hundra mikromolar i nukleas fritt vatten och virvel röret.Per prov, plus ett kontrollprov, kombinera nollpunkt fyra fem mikroliter av 10x T4 DNA ligase buffert, fyra mikroliter adapter, och punkt noll fem mikroliter av nukleas fritt vatten. Värm till nittiotvå grader Celsius i två minuter, och låt den sedan svalna långsamt till sexton grader Celsius i en PCR-maskin. Detta gör det möjligt för adaptern att bilda en struktur hårnål.Det viktigaste steget i detta förfarande är effektiv och opartisk ligering av anpassade molekyler för att öppna 3-prime DNA termini. Renade begynnande cDNA molekyler av varierande längd är ligerade till en hårnål enda strandsatta DNA-adapter med hjälp av T4 DNA ligase. Adaptern bär en slumpmässig sex nukleotid streckkod sekvens, som möjliggör paring för att underlätta ligering, och samtidigt fungerar som en identifierare för unika läsningar.Den 3-prime termini adaptor bär en distanser för att förhindra själv ligatur. För att ställa in sextio microliter slutlig volym ligering reaktioner, lägga till följande till varje PCR-röret:sex mikroliter av 10x T4 DNA ligase buffert, tjugofyra mikroliter av fyrtio procent PEG, sex mikroliter av fem molar Betaine, fyra punkt fem mikroliter av adapter, en punkt två mikroliter av T4 DNA ligase, och arton peka den mikroliter av DNA. Efter blandning av reaktionerna väl, inkubera i en PCR-maskin vid sexton grader Celsius över natten.På dagen efter adaptor ligering, vid trettio mikroliter av formamid som innehåller DNA-gel lastning buffert till varje ligering reaktion och blanda väl genom pipe kurs. Värm i en PCR-maskin vid nittiofyra grader Celsius i två minuter sedan omedelbart lägga på is. Nästa steg är att förbereda sig för denaturering gelelektrofores.Placera en pre cast sex procent TBE denaturering urea polyakrylamid gel i en lämplig gel tank och tillsätt 1x TBE kör buffert. Pre kör gelen i tjugo minuter. Därefter använder en spruta och en tjugo en gauge nål för att tvätta ut gelfickorna med löpande buffert.Ladda sedan trettio mikroliter per brunn av samma prov i tre brunnar. Det är lämpligt att endast köra ett prov per gel för att undvika korskontaminering. Spring i tjugo minuter.Medan gelen är igång, förbereda tre nollpunkt fem milliliter mikrocentrifugrör per prov med hjälp av en tjugo en mätare spruta nål för att peta hål i botten. För in vart och ett av de beredda rören i ett två milliliter mikrocentrifugrör och märk dem med provnamnet plus lågt, mitten eller högt. När den mörkblå färgämnesfronten är ungefär halvvägs genom gelen, stoppa elektroforesen och ta bort gelkassetten.Bänd upp kassetten och skär gelen vertikalt med en rakblad. Att generöst punktskatt remsan med tre brunnar av laddade prover. Tillsätt gelremsan i en behållare med 1x TBE och fem mikroliter av cyaninnukleinsyrafläck och inkubera i tre till fem minuter.Se till att färgningen är tillräcklig för att lätt kunna identifiera toppen av den fria adaptern som ska avlägsnas senare. Därefter rengör ytan av en blå ljus transilluminator noggrant med destillerat de joniserat vatten. Ta sedan gelbiten ur färgningsbehållaren och placera den på ljuslådan.Tänd ljuslådan och inspektera de färgade nukleinsyrorna genom det orangea filtret. Ett representativt ligerat DNA-prov på en betsad gel, visas här. Adaptern verkar vanligtvis överbelastad och körs som en stor klump med ligerade HIV1 DNA som körs ovan som en strimma.De röda linjerna anger de platser gelen ska skäras för att avlägsna fri adapter, och dela provet i tre jämna bitar. Med hjälp av en ny razorblade, skär bort sidorna av gelen om det områden utan prov laddas fortfarande närvarande. Därefter skär strax ovanför adaptern för att ta bort adaptern och nedre geldelar.Slutligen, skär bort toppen av gelen inklusive ungefär en millimeter av gelfickorna som ofta har en skarp intensiv signal av högre molekylvikt DNA. Dela upp det återstående gelstycket som innehåller provet horisontellt i tre jämna bitar. Låg, medel och hög molekylvikt områden.Skär sedan var och en av de tre gelfragmenten i två och två millimeters bitar och överför dem till de beredda nollpunkten fem milliliter mikrocentrifugrör. Snurra i toppfart med öppna lock i en minut. Att pressa gelbitarna genom hålet i två milliliterröret för att skapa en gelslask.Om några gelpartiklar finns kvar i botten av nollpunkten fem milliliterrör, överför dem till två milliliterröret manuellt med hjälp av en nål. Påbörja DNA-extraktionsförfarandet genom att tillsätta en milliliter urea gel extraktionsbuffert till gelen slask i varje mikrocentrifugrör. Rotera rören med en ände över ändblandare i rumstemperatur i minst tre timmar.Förbered filterkolumnerna. Använd en ren uppsättning pincett för att lägga till ett litet runt glasfiberfilter till varje centrifugkolumn med cellulosaacetatmembranfilter, vilket förhindrar membran igensättning. Sätt filtret på plats med en inverterad rörhuvudspets.Kort snurra de två milliliter rören med gel slask och extraktion buffert i en mikrocentrifug, och överföra sju hundra mikroliter av supernatanten till de förberedda filterkolumnerna. Centrifugera filterkolumnerna i en mikrocentrifug i toppfart i en minut. Överför sedan flödet genom att en ny två milliliter mikrocentrifug röret.Ladda om kolumnerna med den återstående supernatanten. Försök att få så mycket vätska som möjligt från extraktionen slask och inte vara berörda om gel bitar ingår. Snurra igen.Kombinera flödet genom samma extraktionsprover och fortsätt som beskrivs i textprotokollet. Detta protokoll var anställd i prover från CEMS-ST celler infekterade med Vif-saknas HIV-1 i avsaknad eller närvaro av det antiretrovirala humana proteinet A3G. En tomt på det totala antalet unika läsningar som erhållits från varje prov indikerar att ökande nivåer av A3G minskar det totala läsantalet.Reflekterande den hämmande effekten av A3G på omvänd transkriptas medierad cdna syntes. I dessa nästa tre tomter, är fraktionen av molekyler vid varje möjlig längd inom de första hundra åttiotvå nukleotider, visas i blå histogram. Tillägget av A3G kostar en kraftig ökning av kortare stympad cdna molekyler vid några mycket specifika reproducerbara positioner.De streckade röda linjer, visa procentsatserna för läsningar redovisade C till T mutationer vid respektive position. En positiv kontroll kan produceras genom att bearbeta en pool av syntetiska oligonukleotider av vetsekvens, längd och koncentration. Alla molekyler bör visas i nära lika överflöd med endast små variationer.Om ett bibliotek kör producerar en mindre längd bias, i sekvensering, är det lämpligt att tillämpa en normalisering faktor som härrör från lutningen som representerar storleken bias. Detta förfarande kan lätt anpassas till andra system där bestämma de tre främsta ändarna av DNA-molekyler skulle lägga viktiga insikter i ares av nukleinsyra metabolism. Glöm inte att det kan vara extremt farligt att arbeta med hiv och vissa infektioner bör endast utföras i utsedda säkerhetslaboratorier.

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

Transkription in vitro analyser och deras tillämpning i Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

Sekvens-specifika och selektiv erkännande av dubbelsträngat RNA över enkelsträngat RNA av kemiskt modifierade peptid nukleinsyror

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Immunfärgning för DNA ändringar: tillämpad analys av Confocal bilder

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Realtidsanalys av transkriptionsfaktor som bindande, transkription, översättning och omsättning under cellulär aktivering med visning av globala händelser

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Ett protokoll för produktionen av integras-brist Lentiviral vektorer för CRISPR/Cas9-medierad gen Knockout i delande celler

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Genome-wide övervakning av transkription fel i eukaryota organismer

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Förstärkning av nära fullängds HIV-1 Proviruses för nästa generations sekvensering

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Omvänd Transkription-Loop-medierad isotermiska amplifiering (RT-lampa) analys för Zika Virus och städning gener i urin, Serum och Mosquito Samples

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Förbättrad jäst en-hybrid skärmar att identifiera transkriptionsfaktor som binder till humant DNA sekvenser

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

Att fastställa ägg befruktning Bemisia tabaci med en Cytogenetisk teknik

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...