Name: determining 3'-termini and sequences of nascent single-stranded viral dna molecules during hiv-1 reverse transcription in infected cells
Uploaded: 2019-01-30T14:00:00
Duration: 13 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells at JoVE.com

Yazarlar Malim laboratuvar, Luis Apolonia, Jernej Ule ve Rebecca Oakey üyelerinden destek kabul etmiş oluyorsunuz. Yazarlar Matt Arno King's College London genomik merkezi ve Debbie Hughes University College London (UCL), teşekkür ederim, Enstitüsü Nöroloji sonraki nesil sıralama tesisi, MiSeq sıralama ile ilgili yardım için çalışır. İş Hibe Sözleşmesi kapsamında İngiltere'de tıbbi araştırma Konseyi (G1000196 ve Bay/M001199/1 mm), Wellcome Trust (106223/Z/14/Z mm), Avrupa Komisyonu'nun Yedinci Çerçeve Programı (FP7/2007-2013) tarafından desteklenmiştir yok. PIIF-GA-2012-329679 (için D.P.) ve King's College London ve Kral'ın ortaklığında güven Sağlık Bakanlığı ile ulusal kurumları adamın ve St. Thomas'NHS Vakfı Sağlık Araştırma kapsamlı Biyomedikal Araştırma Merkezi Ödülü Üniversite Hastanesi NHS vakıf güven.

<ol>
	<li>Herschhorn, A., Hizi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+reverse+transcriptases.">Retroviral reverse transcriptases.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (16), 2717-2747 (2010).</li><li>Hu, W. S., Hughes, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+reverse+transcription.">HIV-1 reverse transcription.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (10), (2012).</li><li>Levin, J. G., Mitra, M., Mascarenhas, A., Musier-Forsyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+HIV-1+nucleocapsid+protein+in+HIV-1+reverse+transcription.">Role of HIV-1 nucleocapsid protein in HIV-1 reverse transcription.</a> RNA Biology. 7 (6), 754-774 (2010).</li><li>Menendez-Arias, L., Sebastian-Martin, A., Alvarez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+reverse+transcriptases.">Viral reverse transcriptases.</a> Virus Research. , (2016).</li><li>Telesnitsky, A., Goff, S. P., Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Retroviruses. , (1997).</li><li>Pollpeter, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+sequencing+of+HIV-1+reverse+transcripts+reveals+the+multifaceted+antiviral+functions+of+APOBEC3G.">Deep sequencing of HIV-1 reverse transcripts reveals the multifaceted antiviral functions of APOBEC3G.</a> Nature Microbiology. 3 (2), 220-233 (2018).</li><li>Frohman, M. A., Dush, M. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+production+of+full-length+cDNAs+from+rare+transcripts:+amplification+using+a+single+gene-specific+oligonucleotide+primer.">Rapid production of full-length cDNAs from rare transcripts: amplification using a single gene-specific oligonucleotide primer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (23), 8998-9002 (1988).</li><li>Liu, X., Gorovsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+5'+and+3'+ends+of+Tetrahymena+thermophila+mRNAs+using+RNA+ligase+mediated+amplification+of+cDNA+ends+(RLM-RACE).">Mapping the 5' and 3' ends of Tetrahymena thermophila mRNAs using RNA ligase mediated amplification of cDNA ends (RLM-RACE).</a> Nucleic Acids Research. 21 (21), 4954-4960 (1993).</li><li>Ince, I. A., Ozcan, K., Vlak, J. M., van Oers, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+classification+and+mapping+of+non-polyadenylated+transcripts+of+an+invertebrate+iridovirus.">Temporal classification and mapping of non-polyadenylated transcripts of an invertebrate iridovirus.</a> Journal of General Virology. 94, 187-192 (2013).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-ligase-dependent+biases+in+miRNA+representation+in+deep-sequenced+small+RNA+cDNA+libraries.">RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries.</a> RNA. 17 (9), 1697-1712 (2011).</li><li>Kwok, C. K., Ding, Y., Sherlock, M. E., Assmann, S. M., Bevilacqua, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hybridization-based+approach+for+quantitative+and+low-bias+single-stranded+DNA+ligation.">A hybridization-based approach for quantitative and low-bias single-stranded DNA ligation.</a> Analytical Biochemistry. 435 (2), 181-186 (2013).</li><li>Abram, M. E., Tsiang, M., White, K. L., Callebaut, C., Miller, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+strategy+to+assess+intrinsic+inhibition+efficiencies+of+HIV-1+reverse+transcriptase+inhibitors.">A cell-based strategy to assess intrinsic inhibition efficiencies of HIV-1 reverse transcriptase inhibitors.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (2), 838-848 (2015).</li><li>Bishop, K. N., Verma, M., Kim, E. Y., Wolinsky, S. M., Malim, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APOBEC3G+inhibits+elongation+of+HIV-1+reverse+transcripts.">APOBEC3G inhibits elongation of HIV-1 reverse transcripts.</a> PLoS Pathogens. 4 (12), 1000231 (2008).</li><li>Zack, J. A., Haislip, A. M., Krogstad, P., Chen, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incompletely+reverse-transcribed+human+immunodeficiency+virus+type+1+genomes+in+quiescent+cells+can+function+as+intermediates+in+the+retroviral+life+cycle.">Incompletely reverse-transcribed human immunodeficiency virus type 1 genomes in quiescent cells can function as intermediates in the retroviral life cycle.</a> Journal of Virology. 66 (3), 1717-1725 (1992).</li><li>Adachi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+acquired+immunodeficiency+syndrome-associated+retrovirus+in+human+and+nonhuman+cells+transfected+with+an+infectious+molecular+clone.">Production of acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone.</a> Journal of Virology. 59 (2), 284-291 (1986).</li><li>Shah, V. B., Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+uncoating+of+HIV-1+cores.">In vitro uncoating of HIV-1 cores.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), (2011).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Science+Education+Database:+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology:+Passaging+Cells.">Science Education Database: Basic Methods in Cellular and Molecular Biology: Passaging Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database:+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology:+Using+a+Hemocytometer+to+Count+Cells.">JoVE Science Education Database: Basic Methods in Cellular and Molecular Biology: Using a Hemocytometer to Count Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>Zhou, M. Y., Gomez-Sanchez, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+TA+cloning.">Universal TA cloning.</a> Current Issues in Molecular Biology. 2 (1), 1-7 (2000).</li><li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purifying+plasmid+DNA+from+bacterial+colonies+using+the+QIAGEN+Miniprep+Kit.">Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).</li><li>Mangeat, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+antiretroviral+defence+by+human+APOBEC3G+through+lethal+editing+of+nascent+reverse+transcripts.">Broad antiretroviral defence by human APOBEC3G through lethal editing of nascent reverse transcripts.</a> Nature. 424 (6944), 99-103 (2003).</li><li>Gillick, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+HIV-1+infection+by+APOBEC3+proteins+in+primary+human+CD4(+)+T+cells+is+associated+with+inhibition+of+processive+reverse+transcription+as+well+as+excessive+cytidine+deamination.">Suppression of HIV-1 infection by APOBEC3 proteins in primary human CD4(+) T cells is associated with inhibition of processive reverse transcription as well as excessive cytidine deamination.</a> Journal of Virology. 87 (3), 1508-1517 (2013).</li><li>Harris, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+deamination+mediates+innate+immunity+to+retroviral+infection.">DNA deamination mediates innate immunity to retroviral infection.</a> Cell. 113 (6), 803-809 (2003).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytidine+deaminase+CEM15+induces+hypermutation+in+newly+synthesized+HIV-1+DNA.">The cytidine deaminase CEM15 induces hypermutation in newly synthesized HIV-1 DNA.</a> Nature. 424 (6944), 94-98 (2003).</li><li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iCLIP--transcriptome-wide+mapping+of+protein-RNA+interactions+with+individual+nucleotide+resolution.">iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).</li><li>Troutt, A. B., McHeyzer-Williams, M. G., Pulendran, B., Nossal, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligation-anchored+PCR:+a+simple+amplification+technique+with+single-sided+specificity.">Ligation-anchored PCR: a simple amplification technique with single-sided specificity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (20), 9823-9825 (1992).</li><li>Zhelkovsky, A. M., McReynolds, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+analysis+of+Methanobacterium+thermoautotrophicum+RNA+ligase+-+engineering+a+thermostable+ATP+independent+enzyme.">Structure-function analysis of Methanobacterium thermoautotrophicum RNA ligase - engineering a thermostable ATP independent enzyme.</a> BMC Molecular Biology. 13 (24), (2012).</li><li>Li, T. W., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-independent+and+quantitative+ligation+of+single-stranded+DNA.">Structure-independent and quantitative ligation of single-stranded DNA.</a> Analytical Biochemistry. 349 (2), 242-246 (2006).</li><li>Gansauge, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-stranded+DNA+library+preparation+from+highly+degraded+DNA+using+T4+DNA+ligase.">Single-stranded DNA library preparation from highly degraded DNA using T4 DNA ligase.</a> Nucleic Acids Research. 45 (10), 79 (2017).</li><li>Ding, Y., Kwok, C. K., Tang, Y., Bevilacqua, P. C., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiling+of+in+vivo+RNA+structure+at+single-nucleotide+resolution+using+structure-seq.">Genome-wide profiling of in vivo RNA structure at single-nucleotide resolution using structure-seq.</a> Nature Protocols. 10 (7), 1050-1066 (2015).</li></ol>

Yazarlar onlar ifşa birşey yok bildirin.

Hızlı, güvenilir ve düşük maliyetli derin sıralama durumu birçok yönleri, yaşam bilimleri, büyük bir derinlik-dayandırılmış analizleri izin alanında devrim yarattı. Kalan bir meydan okuma yenilikçi tasarım ve oluşturma temsilcisi sıralama kitaplıkları yatıyor. Burada biz yeni doğmakta olan viral cDNA molekülleri, özellikle ara ürün HIV-1 Ters transkripsiyon sürecinin yakalamak için bir protokol tanımlamak.
Bu strateji en kritik adımda bir adaptör açık 3'-termini için ligasyonu nicel ve tarafsız bir şekilde var. D iki ssDNA termini arasında verimliliği, her ikisi de Inter- ve intramolecular, incelenmiş ve çeşitli uygulamalar11,26,27,28,29için en iyi duruma getirilmiş. 3.3. adımda açıklanan koşullar altında T4 DNA ligaz ile bir saç tokası adaptörü kullanarak seçim ampirik optimizasyon içinde farklı Ligazlar, adaptörler ve sentetik oligonucleotides temsil eden ligasyonu kimyasalları değerlendirildi sonucudur HIV-1 dizileri (Tablo 2) (veri gösterilmez). Bu vitro test tepkiler T4 DNA ligaz ligasyonu saç tokası bağdaştırıcısının aracılı Kwok ve arktarafından açıklandığı gibi doğruladık. 11, çok düşük bir önyargı vardır ve adaptör aşırı kullanıldığında alıcısı molekülleri tam ligasyonu erişir. Tüp ligasyonu verimliliği adaptör multiplex astar sistemi için uyumlu işlemek için nükleotid dizisi eklenmesiyle etkilenmedi (bkz. Şekil 4). Buna karşılık, alıcısı olarak ssDNA ile tüp ligasyonu verimliliği artırmak için kısmen geliştirilmiş bir mühendislik RNA ligaz olan bir transfer 5' DNA/RNA ligaz ("A ligaz" için bkz: Tablo malzemeleri tam Ligazlar burada karşılaştırıldığında) bulduk 27, RNA ligaz ("ligaz B"), ama güçlü ligasyonu verimliliği bile oligonucleotides tek temel uzunluk farkları [Tablo 2 arasındaki farkları ile önemli bir önyargı vardı daha iki ssDNA birleştirilmesi (ligasyon) gerçekten de daha etkili ; HTP con orta G (a) ve (b)]. Ayrıca, yalnızca en az bir önyargı tepkileri "Ligaz bir randomize 5'-termini taşıyan bir adaptör ile kombine c" bulduk (bir strateji bilinen nükleotit önyargı "Ligaz c" dengelemek için kullanılan; örneğin Ding ve arkbkz. 30). ancak, "Ligaz C"-aracılı cins d eksik, üstün seçim T4 DNA ligaz sistemi oluşturma.
Protokol seyri ve pozitif ve negatif denetimleri dahil çeşitli kalite kontrol adımları tahlil devamı önce potansiyel sorunların tespiti için izin ve çabaları sorun giderme ile ilgili yönergeler sağlar. Adım 2.2.2 ve 2.3.12 qPCR quantifications giriş malzeme miktarını yeterli olduğundan emin olun. Tipik cDNA kopya sayıları yaklaşık 10.000 için 300.000 µL başına 200 µL elüsyon (Kimden adım 2.1) aralığında. Hibrid yakalama adım genel HIV-1 bazı kaybına neden olabilir cDNA miktar ancak belirli HIV-1 cDNA güçlü bir zenginleştirme öncesi ve sonrası zenginleştirme tarafından genomik DNA ölçmek için uygun astar kullanarak belirlenebilir hücresel DNA üzerinde neden qPCR veya toplam DNA toplama ölçme tarafından. Melez yakaladıktan sonra adımları kurtarılan HIV-1 cDNA giriş en az yüzde 10'u olmalıdır. Malzeme başlayan düşük Aksi takdirde başarılı oligonükleotid olumlu denetim açıklamak (bkz. Adım 3.3.2) ama sadece sınırlı örneklerinde elde defa okundu. Düşük sayılar genel tahmindi MiSeq adaptör olmadan alakasız DNA türlerin varlığı nedeniyle Kütüphane konsantrasyon tarafından açıklanabilir okuyun. Bu düşük küme dansitesi neden olur ve HIV-1 dizileri kütüphanede konsantrasyonu qPCR yanı sıra toplam DNA tutar tarafından Fluorometrik deneyleri tarafından belirlenerek geliştirilebilir. Yöntem son derece hassas doğası gereği, hem de diğer örnekleri (özellikle, yüksek konsantrasyon kontrolü oligonükleotid hisse senetleri) Labaratuar donanımları gibi gelen yanı sıra bile alt düzey kirlenmesini önlemek için özel bakım alınmalıdır. PCR iş istasyonu sterilize bir UV çalışma bu konuda faydalıdır. Otomatik jel elektroforez son Kütüphane (adım 6.1.2) daha fazla kalite kontrol ölçüsüdür. Genellikle gözlenen nükleik asit boyutu algılanabilen isteğe bağlı denetiminde PCR sonra ve arıtma (bkz: Not Adım 5.2) şimdi yok olmalıdır önce 150-500 nt. astar aralıktır. Temsil edici bir sonuç, örnek yoğunluğu eğrisi bir tepe vardır yaklaşık 160-170 nt ve ikinci bir daha keskin zirve yaklaşık 320-350 nt. Bu büyük olasılıkla kısa (1-20 nt Ekle uzunluğu) ters transkript ve tam uzunlukta güçlü-stop (180-182 nt Ekle uzunluğu) sık görülen yüksek bereket yansıtır (Şekil 3b).
Sunulan Protokolü ve seçilen astar erken HIV-1 Ters transkripsiyon yapıları için belirli olmakla birlikte, genellikle açık 3'-termini DNA'ın belirlemeye yönelik herhangi bir çalışma için uygun bir yöntemdir. Diğer bağlamlarda gerekli ana değişiklikler hibrid yakalama ve astar tasarım stratejisi için yöntem olacaktır. Örneğin, hedef için geç HIV-1 transkript adapte için ise cDNA uzunluğu boyunca tavlama farklı yakalama biotinylated oligonucleotides daha çok sayıda tavsiye edilmektedir ve büyük olasılıkla hibrid yakalama adım kaybına azalacak. Giriş bölümünde de belirtildiği gibi kısıtlamalar 3'-termini vardır farklı kaynaklardan önyargı önlemek için tespit aralığı tasarlarken göz önünde bulundurun önemlidir. İlk olarak, bir önyargı PCR reaksiyonları büyük ölçüde değişik uzunluğu şablonlarıdır adaptörle durumunda olabilir. İkincisi, burada kullanılan sıralama platformu (Örneğin, MiSeq) en uygun kümeleme için bir tercih edilen Ekle uzunluk alanı vardır ve önemli ölçüde daha kısa ve daha uzun ürünleri aynı verimlilik ile sıralı değil. Kısmen, bu hesaplama açısından, doğrusal uzunluğu önyargı için düzeltme faktörü hesaplayarak yapıldığı gibi ele alınabilir (bkz. Şekil 4, alt grafik). Ancak, nerede 3'-termini eşleme istenilen bölge uzun ise (> 1000 nt), tepkiler ve birleştirilmiş tutanaklar ile bölünmüş ve 3'-termini bölümlerde değerlendirmek için birden fazla ters yönde astar kullanmak için daha fazla tavsiye.
Analiz programı şirket içinde her iki son nükleotit sabit adaptör dizisine bitişik HIV-1 dizisinin yanı sıra herhangi bir mutasyon tanımlamak için tüm üsleri temel varyasyonu analiz belirli amaç için yazılmıştır. Bireysel adımlar aşağıdakileri kapsamaktadır: adaptör dizileri fastx-0.0.13 araç takımı; kullanarak ilk olarak, kesildikten o zaman, (barkod da dahil olmak üzere aynı sıraları anlamına gelir) çoğaltılır herhangi bir dizileri kaldırılır. Tüm kalan benzersiz okur sonra üç üssü ayarlayın maksimum uyumsuzluğu ile Papyon (http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml) kullanarak HIV-1 sıra hizalanır. Şablon sıra ilk 635 oluşur - sss sıra ve ilk strand transfer ürün kadar polypurine parça (U5-R-U3-PPT; bkz: Şekil 1) içeren HIV-1 cDNA (NL4.3 zorlanma), nt. Böylece, sağlanan yazılım ve şablonları yalnızca aynı uygulamayı (HIV-1NL4.3erken ters tutanaklar tespiti) yöntemi kullanılırsa doğrudan uygundur. Ayarlamalar için diğer hedef sıraları yapılması gerekir. Her okuma için 3'-termini konumlarını tarafından hizalama bulunduğu belirlendi. Her bir pozisyon için temel aramalar kaydedilir ve mutasyon oranları değişir, okuma farklı uzunluklarını ve uzun ekler tamamen Read2 125-base sıralama tarafından kaplı değil gibi her Bankası toplam kapsama üzerinden hesaplanır.
Sonuç olarak, çeşitli çalışmalar için değerli bir araç olmak açıklanan yöntemi inanıyorum. Açık uygulamalar araştırmalar Ters transkripsiyon inhibisyon antiretroviral ilaçlar veya hücresel kısıtlama faktörler aracılığıyla temel mekanizmaları içerir. Ancak, nispeten küçük ayarlamalar 3'-termini mevcut Örneğin, parvovirus çoğaltmasında, diğer tek iplikçikli DNA viral intermediates içinde eşleme sisteme uyum için gerekli olmalıdır. Ayrıca, yöntem, özellikle onun en iyi duruma getirilmiş ligasyonu adım, prensibi hücresel çift iplikçikli DNA tarafından katalize elongations de dahil olmak üzere herhangi bir 3'-DNA uzantıları karakterizasyonu için Kütüphane hazırlık tasarım temel bir parçası sağlayabilir polimerazlar.

İncelemek ve viral çoğaltma tam olarak, giderek daha rafine çoğaltma yakalama teknikleri anlamak için ara ürün gereklidir. Bugüne kadar pek çok viral çoğaltma mekanizması var bu yana özellikle, yeni anlayışlar, bağlamı içinde viral nükleik asit tür enfekte hücreleri hassas tanımını sağlayabilir edilmiştir izole vitro tepkiler incelenir. Bir ilk örnek retrovirüsler, insan immün yetmezlik virüsü (HIV-1) 1 gibi ters transkripsiyon sürecidir. HIV-1 ters Transkripsiyon sırasında çift iplikçikli DNA'ya tek iplikçikli RNA genomu viral enzim ters transkriptaz (RT) kopyalar, çeşitli adımlar astar uzantısı deneyleri saf protein ile başta okudu ve nükleik olmuştur asitler1,2,3,4,5. Temel ilkeleri kuruldu, bu tür deneyleri tüm viral ve hücresel bileşenleri dahil değil ve ilgili faktörler biyolojik ilgili stoichiometries yansıtmıyor olabilir. Bu nedenle, biz güçlü bir teknik hassas cDNA 3'-termini (tam onların uzunlukları belirlemeyani ) ve enfeksiyonlar yaşam bağlamında nükleotit dizileri ile ters transkripsiyon intermediates spectra belirlemek için tasarlanmış hücreleri6. Saat ders deneyler transkript antiviral molekülleri veya proteinler, verimlilik ve DNA sentezi processivity etkileyebilecek varlığı gibi çeşitli koşullarda profil karşılaştırmak için kullanılan veri toplama ve birikimi. Bu kez hedeflenen uyuşturucu tasarım ve başarılı terapötik müdahale temelidir doğal patojen yaşam döngüsü daha ayrıntılı bir anlayış sağlar.
HIV-1 Ters transkripsiyon birbirini izleyen olaylar tRNA astar sonra bir eksi-strand güçlü-stop adı verilen bir kısa tek iplikçikli cDNA transkript üretmek için RT tarafından genişletilmiş genomik RNA şablona TAV tarafından başlatılan bir dizi oluşur (-sss) (bkz: Şekil 1). Daha sonra 3'-LTR için nerede o anneals ve hizmet devam RT için astar eksi uzama aracılı gibi DNA strand genomik RNA'ın 5' uzunluğundaki terminal tekrar (LTR) - sss cDNA aktarılır (Ters transkripsiyon1 üzerinde incelemelere bak , 2 , 3 , 4). bu ilk strand transfer Ters transkripsiyon; hızı sınırlaması adımlardan biri Bu nedenle, - sss cDNA birikir bilinmektedir. Enfekte hücreleri Ters transkripsiyon ürünlerinde yakalamak için temel iş akışı ve Kütüphane Tasarım Şekil 2asıraladı. Ters transkripsiyon cDNA ara ürün uzunluğu Aralık 23 ~ ile 650 $ içinde belirli astar ve iletişim kuralında kullanılan ve bir Tablo 1 ' de listelenen tüm erken hedef analiz nt, 180-182 nt - sss DNA içerir. Ancak, stratejisine uygun küçük uyarlamalar amaç 3'-OH içeren DNA uçları algılamaya olduğu sadece geç ters transkripsiyon ürünleri ama aynı zamanda diğer virüsler ve sistemleri, uygulanmasını sağlayacaktır. Önemli göz önüne alınacak sınırlamalar nihai PCR ürün uzunluğu dizi kitaplığa ekleme; Özellikle, açık 3'-terminus bağdaştırıcısında ve ters yönde astar site arasındaki mesafe ~ 1000 nt aşan şablonları büyük olasılıkla daha az verimli, potansiyel olarak teknik önyargıları Kütüphane hazırlık () sırasında yanıltıcı tanıtan sıralı daha fazla bilgi ve adaptasyon öneriler için konuya bakın).
Daha önce bildirilen teknikleri 3'-termini nükleik asit iplikçiklerinin sistematik belirlenmesi için RNA DNA, moleküller üzerinde odaklanmıştır. MRNA Poliadenilasyon üzerinde dayanıyor 3' yarış (hızlı amplifikasyon cDNA biter)7, bir örnektir. Buna ek olarak, hangi RLM-yarış (RNA ligaz aracılı RACE)8 veya Dantel (cDNA biter amplifikasyon ligasyonu tabanlı)9dahil ettik RNA Ligazlar istihdam adaptör ligasyonu tabanlı stratejileri geliştirilmiştir. Tüp ligasyonu tabanlı arttırımlar ligasyonu tepki kendisi tarafından sunulan herhangi bir önyargı duyarlı olduğunu vurgulamak önemlidir. Örneğin, tüp ligasyonu pozisyon 3', sıra, toplam molekül uzunluğu veya yerel yapısı belirli bir nükleotit bağlı olarak daha fazla veya daha az verimli olabilir. Böyle ligaz tercihleri molekülleri ve yanlış beyan biz ve diğerleri9,10gözlemledim okuma eksik yakalanması neden. Tüp ligasyonu önyargı burada açıklanan protokol adaptör ek adımları sırasında en aza indirmek için biz ve ligasyonu stratejileri bir dizi test T4 DNA ligaz bir saç tokası tek iplikçikli DNA adaptörle bulunan (Kwok ve arktarafından açıklandığı gibi. 11) ile tek işlem kontrol oligonucleotides6özel olarak seçilen bir dizi ile değerlendirirken ligasyonu verimliliği önemli farklılıkların sonuçlanmamıştır nicel ligasyonu yakın olmak için. Bu tüp ligasyonu strateji seçimi, bu nedenle, bu protokol başarısında önemli bir özelliği var.
Bugüne kadar enfekte hücreleri ilerlemesinde HIV-1 RT izlenmesi öncelikle benzersiz olarak daha kısa veya daha uzun ölçmek astar-sonda kümesi'ni kullanma Ters transkripsiyon ürünleri çeşitli uzunlukta kantitatif PCR (qPCR) ile ölçerek tamamlandıktan (erken ve geç, sırasıyla) cDNA ürünleri12,13,14. Bu qPCR yaklaşım Ters transkripsiyon süreci içsel verimliliği hücresel sistemleri belirlemek uygun olsa da, bu çıktı nispeten düşük çözünürlüğe sıra bilgi elde edilen yok değildir. Bizim yeni bir yaklaşım, en iyi duruma getirilmiş adaptör ligasyonu, PCR-aracılı Kütüphane üretimi ve derin sıralama adresleri teknoloji farkı dayalı ve nicelik ve tek nükleotit, HIV-1 enfeksiyonu sırasında ters transkripsiyon izlemek için bir fırsat sunuyor çözünürlük.
Biz ile belgili tanımlık yarar girişimine iki önerilen modeller arasında HIV-1 kısıtlama faktörü APOBEC3G kapasite (apolipoprotein B mRNA düzenleme enzimin katalitik polipeptid benzeri 3 G) seçkin bir çalışmada bu yöntemin resimli üretim viral ters transkript6.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:743px;" width="743">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">293T cells</td>
			<td style="width:160px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-3216</td>
			<td style="width:209px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15150-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">HeraCell Vios 250i CO2 Incubator</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td>51030966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Laminar flow hood - CAS BioMAT2</td>
			<td style="width:160px;">Wolflabs</td>
			<td style="width:119px;">CAS001-C2R-1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">10mm TC-treated culture dish</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">TrypLE&#8482; Express (1x), Stable Trypsin Replacement Enzyme</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">OptiMEM&#174; (Minimal Essential Medium)</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31985-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3)</td>
			<td style="width:160px;">NIH Aids reagent program</td>
			<td style="width:119px;">114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Polyethylenimine (PEI) - MW:25000</td>
			<td style="width:160px;">PolySciences Inc</td>
			<td>23966-2</td>
			<td>dissolved at 1mg/ml and adjusted to pH7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">RQ1- Rnase free Dnase</td>
			<td style="width:160px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">M6101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Filter 0.22 &#956;m</td>
			<td style="width:160px;">Triple Red Limited</td>
			<td>FPE404025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">15 mL polypropylene tubes</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td>CLS430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Sucrose</td>
			<td style="width:160px;">Calbiochem</td>
			<td>573113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:160px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">344060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:160px;">Sorval</td>
			<td style="width:119px;">WX Ultra Series</td>
			<td>Th-641 Rotor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Alliance HIV-1 p24 antigen ELISA kit</td>
			<td style="width:160px;">Perkin Elmer</td>
			<td>NEK050001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">CEM-SS cells</td>
			<td style="width:160px;">NIH Aids reagent program</td>
			<td>776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Roswell Park Memorial Institute Medium</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31870-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">CoStar&#174; TC treated multiple well plates</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">CLS3513-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Benchtop centrifuge: Heraus&#8482; Multifuge&#8482; X3 FR</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td>75004536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">TX-1000 Swinging Bucket Rotor</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td>75003017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Microcentrifuge: 5424R</td>
			<td style="width:160px;">Eppendorf</td>
			<td>5404000060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Total DNA extraction kit (DNeasy Blood and Tissue kit)</td>
			<td style="width:160px;">Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Nuclease free H2O</td>
			<td style="width:160px;">Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Cutsmart buffer</td>
			<td style="width:160px;">New England Biolabs (part of DpnI enzyme)</td>
			<td style="width:119px;">R0176S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">DpnI restriction enzyme</td>
			<td style="width:160px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R0176S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Oligonucleotides for qPCR</td>
			<td style="width:160px;">MWG Eurofins</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>HPSF purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">TaqMan PCR Universal Mastermix</td>
			<td style="width:160px;">Thermo</td>
			<td>4304437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">LoBind Eppendorf&#174; tubes</td>
			<td style="width:160px;">Eppendorf</td>
			<td>30108078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Axygen&#8482; aerosol filter pipette tips, 1000 &#956;L</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td>TF-000-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Axygen&#8482; aerosol filter pipette tips, 200 &#956;L</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td>TF-200-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Axygen&#8482; aerosol filter pipette tips, 20 &#956;L</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td>TF-20-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Axygen&#8482; aerosol filter pipette tips, 10 &#956;L</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">TF-10-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">PCR clean hood</td>
			<td style="width:160px;">LabCaire</td>
			<td style="width:119px;">Model PCR-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">DynaMag&#8482;2-magnet</td>
			<td style="width:160px;">Thermo</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Streptavidin MagneSphere&#174; paramagnetic particles</td>
			<td style="width:160px;">Promega</td>
			<td>Z5481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Casein</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">37582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">End over end rotator, Revolver&#8482; 360&#176;</td>
			<td style="width:160px;">Labnet</td>
			<td style="width:119px;">H5600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tris-Base</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td>H1758-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">EDTA disodium salt dihydrate</td>
			<td style="width:160px;">Electran (VWR)</td>
			<td style="width:119px;">443885J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Dri-Block&#174; Analog Block Heater</td>
			<td style="width:160px;">Techne</td>
			<td>UY-36620-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">PCR tubes and domed caps</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td>AB0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">PCR machine</td>
			<td style="width:160px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">Mastercycler&#174; series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:160px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0202M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">40% Polyethylene glycol solution (PEG) in H2O, MW: 8000</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td>P1458-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Betaine solution, 5M</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td>B0300-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Gel loading buffer II (formamide buffer)</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td>AM8546G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Precast 6% TBE urea gels</td>
			<td style="width:160px;">Invitrogen</td>
			<td>EC6865BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Mini cell electrophoresis system</td>
			<td style="width:160px;">Invitrogen, Novex</td>
			<td>XCell SureLock&#8482;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tris/Borate/EDTA solution (10x)</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td>10031223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Needle 21 G x1 1/2</td>
			<td style="width:160px;">VWR</td>
			<td>613-2022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">SYBR Gold nucleic acid stain (10000x)</td>
			<td style="width:160px;">Life Technologies</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Dark Reader DR46B transilluminator</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td>NC9800797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ammonium acetate</td>
			<td style="width:160px;">Merck</td>
			<td>101116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">SDS solution 20% (w/v)</td>
			<td style="width:160px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">161-0418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Centrifuge tube filter</td>
			<td style="width:160px;">Appleton Woods</td>
			<td style="width:119px;">BC591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Filter Glass Fibre Gf/D 10mm</td>
			<td style="width:160px;">Whatman (VWR)</td>
			<td>512-0427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">polyadenylic acid (polyA) RNA</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td>10108626001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Glycogen, molecular biology grade</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td>R0561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Isopropanol (2-propanol)</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td>15809665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ethanol, molecular biology grade</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td>10041814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Accuprime&#8482; Supermix I (DNA polymerase premix)</td>
			<td style="width:160px;">Life Technologies</td>
			<td>12342-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">NEBNext&#174; Multiplex Oligo for Illumina (Index Primer Set 1 and 2)</td>
			<td style="width:160px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">E7335S; E7500S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Tapestation D1000 Screentape High sensitivity</td>
			<td style="width:160px;">Agilent Technologies</td>
			<td>5067- 5584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tapestation D1000 Reagents</td>
			<td style="width:160px;">Agilent Technologies</td>
			<td>5067- 5585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">2200 Tapestation - automated gel electrophoresis system</td>
			<td style="width:160px;">Agilent Technologies</td>
			<td>G2965AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Agencourt&#174; AMPure&#174; beads XP</td>
			<td style="width:160px;">Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Qubit&#8482; dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td style="width:160px;">Invitrogen</td>
			<td>Q32851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Qubit&#8482; 2.0 Fluorometer</td>
			<td style="width:160px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Topo&#8482; TA cloning Kit</td>
			<td style="width:160px;">Invitrogen</td>
			<td>450071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Sequencing platform: MiSeq System</td>
			<td style="width:160px;">Illumina</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:255px;">Experiment Manager (Sample sheet software)</td>
			<td style="width:160px;">Illumina</td>
			<td style="width:119px;">Note: Use TruSeq LT as a template</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Miseq&#8482; Reagent kit V3 (150 cycle)</td>
			<td style="width:160px;">Illumina</td>
			<td>MS-102-3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Sequencing hub: Basespace</td>
			<td style="width:160px;">Illumina</td>
			<td style="width:119px;">https://basespace.illumina.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ligase A: Thermostable 5&#8217; App DNA/RNA ligase</td>
			<td style="width:160px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0319S</td>
			<td style="width:209px;">Not used in this protocol, but tested in optimization process with results described in the discussion.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ligase B: T4 RNA ligase 1</td>
			<td style="width:160px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0204</td>
			<td style="width:209px;">Not used in this protocol, but tested in optimization process with results described in the discussion.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ligase C: CircLigase</td>
			<td style="width:160px;">Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">CL4111K</td>
			<td style="width:209px;">Not used in this protocol, but tested in optimization process with results described in the discussion.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining 3'-termini and sequences of nascent single-stranded viral dna molecules during hiv-1 reverse transcription in infected cells

Nükleik asit Ortalayıcılar virüs çoğaltma sırasında izleme viral DNA sentezi etkileri ve antiviral bileşikler ve konak hücre proteinleri eylem mekanizmaları sağlar. Burada biz virüs enfeksiyonu fizyolojik bağlamında retroviral Ters transkripsiyon ara ürün tanımlama kapasitesine sahip bir hücre-esaslı, yüksek-kapsam ve yüksek çözünürlüklü tahlil eksikliği adresi. Açıklanan yöntemi HIV-1 enfekte hücreleri tek nükleotid çözünürlükte içinde doğmakta olan tamamlayıcı DNA (cDNA) moleküllerinin 3'-termini yakalar. Protokol bütün hücre DNA'sı, viral DNA via hibrid yakalama, adaptör ligasyonu, boyut ayırma jel arıtma, PCR güçlendirme, derin sıralama ve veri analizi tarafından hedeflenen zenginleştirme hasat içerir. 3'-DNA termini açmak için adaptör moleküllerin etkili ve tarafsız ligasyonu önemli bir adımdır. Açıklanan yöntemi uygulanması ters transkript her belirli uzunlukta verilen örnek bir bolluk belirler. Herhangi bir potansiyel mutasyonlar (iç) sıra varyasyon ters transkript ve böylece ilgili bilgi de sağlar. Şablon sırası bilinir olması koşuluyla genel olarak tahlil için DNA ' 3'-uzantısı, ilgili herhangi bir sorunuz için uygundur.

Bu makalede açıklanan tekniği HIV-1 Ters transkripsiyon (A3G) tarafından antiretroviral insan proteini APOBEC3G inhibisyonu yatan mekanizmaları adrese daha geniş bir çalışma için uygulanan6. Şekil 3 CEM-SS T-hücreleri vifile enfekte örnekleri protokolünde istihdam sonra elde temsilcisi sonuçları gösterir-eksik HIV-1'de yokluğu veya A3G varlığı. Benzersiz okuma toplam sayısını elde edilen her örnek aynı 6 var herhangi bir PCR çoğaltmaları filtreleme sonra nt barkod ve (sağlanan analiz yazılımı tarafından yapılır) aynı uzunlukta çizilen Şekil 3biriçinde. A3G artan düzeylerde A3G inhibitör etkisi daha önce açıklanan ve qPCR6,13,21,22tarafından ölçülen aracılı RT cDNA sentez yansıtan toplam okuma sayısını azaltın. Şekil 3bmolekülleri ilk 182 içinde olası her boyu kısmını nt gösterilir. HIV-1 A3G için yokluğunda, en bol türler ana 180 enfeksiyondur nt güçlü-stop molekül kendisi, bazı birikmesi ile okur daha kısa aralıkta (23-40 nt) (en iyi grafik, mavi çubuk grafikler). Bu keskin bir artış, daha kısa, kesilmiş gibi birkaç çok özel, tekrarlanabilir pozisyonlarda cDNA molekülleri açıktır A3G değişiklikleri eklenmesi (orta ve alt grafikler) algıladı. A3G (C T tanımlanır) olan sitozin Üridin sitidin birdeaminaz olduğundan A3G bulaşmasını virions21,23,24' te mevcut cDNA mutasyonların meydana gelir. Elde edilen sıralama bilgileri kullanarak, C T mutasyonlar yüzdesi aynı grafikte (kırmızı noktalı çizgi) çizildi. Mutational profil tüm benzersiz Okunma kombine türetilir ve her nükleotit kapsama değişir unutulmamalıdır. Ancak, Eğer her molekül için ilgili ve bir belirli 3'-terminus ile ilişkili sırası bilgi gerekli. Sağlanan veri Pollpeter ve ark. alınmıştır 6 ve mutational arasındaki ilişki ve cDNA uzunluğu profilleri gösterdi DNA onarım makineleri algılama ve hücresel tarafından deaminated cDNA bölünme nedeniyle olmak.
3'-eşlemeyi approach için olumlu bir denetim bilinen sıra, uzunluk ve konsantrasyon sentetik oligonucleotides bir havuz işleyerek kolayca üretilmektedir. Bu denetim adaptör ligasyonu adım 3.3.2 ekledi ve tüm çoğaltılmış kitaplıklarda dahil edilecek tavsiye. Bir denetim örnekten alınan verileri tüm oligonucleotides çok küçük arka plan okuma ile beklenen giriş oranları, olmalıdır. Şekil 4 17 kimyasal olarak sentezlenmiş oligonucleotides olumlu denetim kümesi sonuçlarını gösterir (dizileri için bkz: Tablo 2), hangi ekimolar oranlarıyla karışık. Beklendiği gibi tüm molekülleri yalnızca küçük varyasyonlar (en iyi grafik) ile eşit bereket yakın görünür. Bir oligonükleotid tarafından temsil değildi çoğu pozisyonlar - sss DNA dizisi içinde sıfır okuma sayar verirken, biz 1 veya 2 nt gerçek denetim oligonucleotides kısa olan küçük türler gözlenen. Biz daha fazla bu küçük türler soruşturma değil ama onlar bozulmuş ya da eksik ürünleri satın aldığınızda verilen oligonükleotid hisse potansiyel olarak mevcut temsil varsayıyorum (oligonucleotides HPLC, kendisi için saf gibi sipariş Üretici > %80 saflıkta gösterir). Alt grafik denetimi örneğini çalıştırmak, nerede varyasyon arasında 17 oligonucleotides biraz daha yüksek ve daha uzun kontrol molekülleri daha verimli bir şekilde algılanır o toplam uzunluğu ile karşılıklı olarak ilişkilendirir sonra daha kısa olanlar farklı kütüphaneden gösterir. Bu küçük bir önyargı PCR reaksiyonları veya INSERT boyutu en uygun olan MiSeq sıralama sırasında kümeleme nedeni olabilir ve özellikle geniş Ekle aralıkları taşıyan kütüphaneleri ile oluşabilir. Bu önyargı sorunu çözmek için bir temel uyguladığımız molekül uzunluğu (Pembe hat) birleştiriliyor önyargı gösterir yamaç dayalı bir normalleştirme faktör uygulamadır. Gerekli hesaplamaları analiz programın içerdiği (bkz. Adım 8.3 iletişim kuralı).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58715/58715fig1.jpg"> Resim 1: HIV-1'in ilk adımları ters transkripsiyon gösteren diyagram. Süreç astar bağlama siteye (PBS) tRNA(Lys,3) (turuncu) tavlama ile başlatma ve viral cDNA (mavi, adım 2) uzama sağlar genomik viral RNA (adım 1), başlar. Kullanılazlar, şablon genomik RNA RT (adım 3) RNaseH etkinliği tarafından bozulmuş. İlk tam orta Ters transkripsiyon sürecinde eksi-strand güçlü-(-) sss cDNA, katalize RT polimerizasyon bölgesinin gRNA tekrar (R) (adım 3) 5'-terminus ulaştığında hangi tamamlandıktan durağıdır. (-) Sss orta 3'-terminus için genomik RNA şablonunun tamamlayıcı 3' uzunluğundaki terminal tekrar (LTR) R bölgeye TAV tarafından aktarılır. Buradan, polimerizasyon (adım 4) devam ediyor. Açıklanan yöntemde Ters transkripsiyon ilerleme doğmakta olan viral cDNA (mavi) tam olarak uzunluğunu eşleme tarafından belirlenir. PPT, polypurine yolu; U5, benzersiz 5'-sıra; U3, benzersiz 3'-sıra. Bu rakam bir önceki yayın6yayınlanacaktır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58715/58715fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58715/58715fig2v3.jpg"> Resim 2 : İş akışı anahat ve şemaları bağdaştırıcısı ligasyonu ve PCR güçlendirme stratejisi. (a) açıklanan tekniği ana adımları özetleyen 3'-termini HIV-1'in belirlemek için iş akışı transkript enfekte hücreleri içinde ters. Bir önceki yayın6adapte bir rakamdır. (b) şeması adaptör ligasyonu ve PCR güçlendirme stratejisi. Önceki adımlarda saf doğmakta olan cDNA farklı uzunluk moleküllerinin T4 DNA ligaz kullanarak tek iplikçikli DNA adaptör tane. Saç tokası adaptörü (adlandırılmış "Kwok + MiSeq bkz. Tablo 1tam,") tasarım Kwok ve arktarafından ilham kaynağı oldu. 11. bağdaştırıcı bir rasgele taşır Bankası-tüp ligasyonu kolaylaştırmak için eşleştirme için sağlar ve aynı anda tanımlayıcı olarak için benzersiz okuma 6 nt barkod sıra. Bağdaştırıcısının 3'-termini ayırıcı (SpC3) öz ligasyonu önlemek için taşır. Ve birleştirilmiş ürünler aşırı adaptör polyacrylamide jel elektroforez (sayfa) denaturing tarafından ayrılır. Nükleik asitler jel içinde lekeli ve adaptörü de yukarıdaki alanda üç ayrı, eşit büyüklükteki jel parçalar halinde25içinde bitmiş gibi kesti. Elüsyon, yağış ve resuspension sonra adaptör bilinen serisine tavlama astar ile güçlendirilmiş PCR ürünlerdir (ilk 1, multiplex oligonükleotid kiti, bkz Malzemeler tablo) ve ilk 22 taşıyan bir astar nt HIV-1 TRNA (astar 2, MP1.0 + 22HIV) hemen ardından 5'-soldan sağa sıralı. Seçilen astar, 5'-termini adaptörler için seçtiğiniz sıralama platformu (P5 ve P7) yanı sıra bireysel örneği aynı kitaplığa çalıştırmak ayırt etmek için bir dizin sıra taşırlar. Nasıl yapılacağını başlangıç noktaları astar gösterilir okuyun. Mavi kutu bölgenin özgün 3'-termini yakalanan molekülünün belirlemek ilgi gösterir. Bu rakam bir önceki yayın6adapte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58715/58715fig2v3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58715/58715fig3.jpg"> Şekil 3 : Temsilcisi sonuçları. (a) Toplam okuma sayısı temsilcisi örnekleri açıklanan protokolü ile işlenmiş. Bu HIV-1 molekülleri benzersiz okuma onların 3'-termini ilk 635 içinde ile tespit edilmiştir tüm dizileri içerir eksi nt strand cDNA (PPT kadar Şekil 1bakınız). Oysa A3G cDNA sentezini engeller ve böylece okuma sayısı toplam azaltır enfeksiyon HIV-1 A3G taşımıyor okuma, en yüksek sayısı verir. Sentetik oligonucleotides bir dizi olumlu denetim sağlarken virüs bulaşmamış hücreleri bir negatif kontrol görev yaptı. b) cDNAs nt pozisyonlar 23 ve 182 arasında her uzunluk için göreli bereket (tam uzunlukta - sss cDNA olduğunu 180-182 nt) HIV-1NL4.3 sırasını (x ekseni) mavi çubuk grafikler (soldaki y ekseninde ölçekte) gösterilir. CDNA göreli bolluk dizileri tüm okuma 182nt ölçme toplamına bölünmesiyle - sss cDNA dizisi içinde belirli bir nükleotit, Sonlandırıcı veya daha az mutlak sayı hesaplanır. Kesik çizgili kırmızı satırlarda gösterildiği C-için-T/U mutasyonlar (doğru y-eksende ölçek) ilgili konumda taşıyan okuma yüzdelerdir. Şekil 3 b bir önceki yayın6yayınlanacaktır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58715/58715fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58715/58715fig4.jpg"> Şekil 4 : Temsilcisi kontrol örnekleri sonuçlarını. 17 farklı uzunlukta sentetik oligonucleotides ekimolar miktarda içeren havuzlar için iki profili gösterilmiştir. Bu oligonucleotides serileri HIV-1NL4.3 dan sahiptir ve çeşitli uzunluklarda kapak ve tüm 4 üsleri bir 3'-nükleotid sunmak üzere seçildi (bkz. Tablo 2). En iyi grafik Şekil 3birgelen olumlu denetimi örneğini gösterir. Önemli hiçbir önyargı molekül uzunluğu ya da açık 3'-termini doğru algılanır. Alt grafiğin kaç, hangi sıralama bir küçük uzunluk önyargı üretilen farklı bir kitaplık gösterir. Bu durumda, boyutu sapma gösteren (pembe renkte gösterilir) yamaç türetilmiş bir normalleştirme faktör uygulamanız önerilir. Bu rakam bir önceki yayın6yayınlanacaktır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58715/58715fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Oligo adı</td>
			<td>Nt uzunluğu</td>
			<td colspan="12">Sıra</td>
			<td colspan="2">Amaç</td>
			<td colspan="2">Üretici (arıtma)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">tam Kwok + MiSeq</td>
			<td>61</td>
			<td colspan="12">5'-PHO-tgaagagcctagtcgctgttcannnnnnctgcccatagagagatcggaagagcacacgtct-SpC3-3'</td>
			<td colspan="2">Adaptör</td>
			<td colspan="2">IDT DNA Teknolojileri (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">2xBiotin SS yem</td>
			<td>40</td>
			<td colspan="12">5'-biotin-cagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggac-biotin-3'</td>
			<td colspan="2">Hibrid yakalama</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Biotin 1-16 ss</td>
			<td>22</td>
			<td colspan="12">5'-cagtgtggaaaatctctagcag-BiTEG-3'</td>
			<td colspan="2">Hibrid yakalama</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Biotin tRNA + CTG</td>
			<td>16</td>
			<td colspan="12">5'-cagtggcgcccgaaca-BITEG-3'</td>
			<td colspan="2">Hibrid yakalama</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">MP1.0 + 22HIV</td>
			<td>82</td>
			<td colspan="12">5'-aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatctcactgctagagattttccacactg-3'</td>
			<td colspan="2">PCR güçlendirme</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: uzunluk, dizileri ve kullanılmaktadır değişiklikler açıklanan protokol de dahil olmak üzere oligonucleotides tablo. Bir önceki yayın6adapte tablodur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58715/Table1_Pollpeter.xlsx" target="_blank">Bu tablo bir excel dosyası olarak indirmek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Oligo adı</td>
			<td>Nt uzunluğu</td>
			<td colspan="12">Sıra</td>
			<td colspan="2">Üretici (arıtma)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con uzun C</td>
			<td>120</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="6">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagctttattgaggcttaagc-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con uzun G</td>
			<td>119</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="6">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagctttattgaggcttaag-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con uzun T</td>
			<td>116</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="6">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagctttattgaggctt-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con uzun A</td>
			<td>118</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="6">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagctttattgaggcttaa-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con C orta</td>
			<td>76</td>
			<td colspan="12">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcac-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con G (a) orta</td>
			<td>71</td>
			<td colspan="12">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacg-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con G (b) orta</td>
			<td>72</td>
			<td colspan="12">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgg-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con A orta</td>
			<td>69</td>
			<td colspan="12">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacaga-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con T orta</td>
			<td>85</td>
			<td colspan="12">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactt-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con kısa A</td>
			<td>40</td>
			<td colspan="12">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgaggga-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con kısa T</td>
			<td>33</td>
			<td colspan="12">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggt-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con kısa G</td>
			<td>41</td>
			<td colspan="12">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgaggg-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con kısa C</td>
			<td>34</td>
			<td colspan="12">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtc-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP Con 46 (T)</td>
			<td>46</td>
			<td colspan="12">5'-ctgctagagattttccacactg actaaaagggtctgagggatctct-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP Con 83 (C)</td>
			<td>83</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="7">5'-ctgctagagattttccacactg actaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactac-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP Con 103 (C)</td>
			<td>103</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="6">5'-ctgctagagattttccacactg actaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagc-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP Con 107 (A)</td>
			<td>107</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="6">5'-ctgctagagattttccacactg actaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagcttta-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: 17 sentetik kontrol oligonucleotides bir olumlu denetim örnek kullanılan tablo. 13 top oligonucleotides dayalı boyutu seçilmiştir [uzun (116-120 nt), Orta (69-85 nt), kısa (33-41 nt)] onların 3'-termini yanı sıra. Bir önceki yayın6adapte tablodur.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58715/Table2_Pollpeter.xlsx" target="_blank">Bu tablo bir excel dosyası olarak indirmek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells at JoVE.com

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

Ters transkripsiyon enfekte hücreleri içinde belirleyici 3'-Termini ve HIV-1 sırasında doğmakta olan tek iplikçikli Viral DNA moleküllerinin dizileri

Burada yeni doğmakta olan 3'-termini tarafsız bir belirlenmesi yanı sıra tek iplikçikli DNA moleküllerinin mutational profilleri sağlar bir derin sıralama yaklaşım mevcut. Ana uygulama doğmakta olan retroviral tamamlayıcı DNA'lar (cDNAs), retroviral Ters transkripsiyon işlemi sırasında oluşturulan ara ürün karakterizasyonudur.

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

Ters transkripsiyon analiz etmek için bu yeni yöntem bize retro viroloji alanı hakkında yeni şeyler söyleyebilir. Örneğin, hücresel kısıtlama faktörlerinin nasıl çalıştığı veya antiretroviral ilaçların HIV1 DNA sentezini nasıl engellenebildiği hakkında bilgi edinebiliriz. Bu tekniğin en büyük avantajı, sadece Nascent Reverse Tran scrips dizisi hakkında bilgi sağlamaz, aynı zamanda tek bir nükleer sıkı çözünürlükte onların hassas 3-prime DNA termini haritalama sağlar.HIV1 enfekte hücrelerin toptan DNA HIV1 ücretsiz DNA zenginleştirme, hibrid yakalama tarafından yapılır ve bir PCR iş istasyonunda yapılmalıdır. Tek bir mikro santrifüj tüp içine örnek başına boncuk yüz mikrolitre başlığı boru ile manyetik streptavidin boncuk ana karışımı hazırlayın mikro santrifüj tüpler için uygun bir mıknatıs üzerine tüp yerleştirin. Boncuklar tüpün mıknatıs tarafına doğru yerleştikten sonra, depolama tamponu çıkarın, mıknatıstan tüp kaldırmak ve binktent yıkama veya BW tampon beş yüz mikrolitre boncuk askıya.Tüpü mıknatısın üzerine geri yerleştirin, boncukların mıknatısa geçmesini bekleyin ve süpernatantı çıkarın. Mıknatıstan tüp çıkarın, kazein çözeltisi beş yüz mikrolitre ekleyin, boncuk lar askıya tekrar, ve on dakika oda sıcaklığında kuluçka. On dakika sonra, BW tampon ile boncuk yıkayın.Tüpü mıknatısın üzerine geri yerleştirin, süpernatant'ı çıkarın ve boncukları 500 mikrolitre BW tamponunda yeniden askıya alın. Her yakalanan biyotinylated oligonükleotid örnek başına elli picomoles ekleyin. Otuz dakika boyunca uç mikser üzerinde bir ucunda sallanan ise oda sıcaklığında kuluçka.Sonra, mıknatıs için tüp dönmek, supernatant kaldırmak, mıknatıs tüp kaldırmak, 1x on tampon beş yüz mikrolitre ekleyin ve boncuk askıya. İkinci yıkama dan sonra tekrar örnek başına 1x on tampon on mikrolitre immobilize oligonükleotidler ile boncuk askıya. Her örnek için, bir mikrosetrofuge tüp etiket ve boncuk süspansiyon on mikrolitre ekleyin, DNA yüz yetmiş mikrolitre, ve 3x on tampon doksan mikrolitre.DNA'yı doğadan arındırmak için 92 derece lik kuru bir ısı bloğunda iki dakika kuluçkaya yatın. Tüpleri elli iki santigrat dereceye ayarlanmış farklı bir kuru ısı bloğuna taşıyın ve bir saat kuluçkaya yatırın. Bu kuluçka sırasında her on dakikada bir, tüpleri karıştırmak için ters çevirin.Bir saatlik kuluçka süresi bittiğinde, boncukları bir kez 1x ten tamponunun beş yüz mikrolitresi ile yıkayın ve otuz beş mikrolitre nükleaz içermeyen su yla tekrar askıya alın. Herhangi bir sıvı çıkarmadan önce yaklaşık üç dakika boyunca mıknatıs tüpler bırakarak boncuk iyi yerleşmek emin olun. Eforlamak için, tüpleri 92 santigrat derecede kuru bir ısı bloğunda iki dakika kuluçkaya yatırın.Sonra, hızlı bir şekilde mıknatıs üzerine tüpleri hareket ettirin, bir seferde bir tüp. Boncuklar tüpün kenarına bağlandıktan sonra, HIV1 DNA'sını içeren süpernatantı yeni bir tüpe aktarın. Bu prosedüre başlamak için, nükleaz içermeyen su ve girdap tüp yüz mikromolar de lyophilized adaptör askıya yeniden.Örnek başına, artı bir kontrol örneği, 10x T4 DNA ligaz tampon sıfır noktası dört beş mikrolitre, adaptör dört mikrolitre ve nükleaz içermeyen su noktası sıfır beş mikrolitre birleştirir. Isı doksan iki derece santigrat iki dakika için, ve sonra yavaş yavaş bir PCR makinede on altı derece santigrat kadar soğumasını bekleyin. Bu adaptör bir saç iğnesi yapısı oluşturmak için izin verecektir.Bu işlemin en önemli adımı, 3-prime DNA termini açmak için uyarlanmış moleküllerin verimli ve tarafsız ligasyonudur. Farklı uzunlukta saflaştırılmış yeni doğan cDNA molekülleri T4 DNA ligaz kullanılarak bir saç tokası tek telli DNA adaptörü ne bağlı. Adaptör, eşitlemayı kolaylaştıran rastgele altı nükleotit barkod dizisi taşır ve aynı anda benzersiz okumalar için tanımlayıcı görevi görehizmet eder.3-prime termini adaptörü kendi kendine ligasyon önlemek için bir spacer taşır. Altmış mikrolitre son hacim ligasyon reaksiyonları kurmak için, her PCR tüpüne aşağıdakileri ekleyin: 10x T4 DNA ligaz tamponunun altı mikrolitresi, yüzde kırk PEG'in yirmi dört mikrolitresi, beş molar Betainin altı mikrolitresi, dört nokta beş mikrolitre adaptör, T4 DNA ligazının bir nokta iki mikrolitresi ve DNA'nın on sekiz noktalı mikrolitresi. Reaksiyonları iyice karıştırdıktan sonra, bir PCR makinesinde bir gecede on altı santigrat derecede kuluçkaya yat.Adaptör ligasyonundan sonraki gün, her ligasyon reaksiyonuna DNA jeli yükleme tamponu içeren otuz mikrolitre formamid ve boru başlığı ile iyice karıştırın. Bir PCR makinede Iki dakika boyunca doksan dört derece santigrat ısı sonra hemen buz koymak. Bir sonraki adım jel elektroforez denatüre hazırlanmaktır.Uygun bir jel tankında üre poliakrilamid jel denaturing bir ön döküm yüzde altı TBE yerleştirin ve 1x TBE çalışan tampon ekleyin. Önceden yirmi dakika boyunca jel çalıştırın. Sonra, çalışan tampon ile jel cepleri yıkamak için bir şırınga ve yirmi bir gauge iğne kullanın.Daha sonra aynı numunenin kuyu başına otuz mikrolitresini üç kuyuya yükleyin. Çapraz kontaminasyonu önlemek için jel başına sadece bir numune çalıştırılması tavsiye edilir. Yirmi dakika koş.Jel çalışırken, alt delik poke için yirmi bir gauge şırınga iğne kullanarak örnek başına üç sıfır noktası beş mililitre mikrosantrifüj tüpler ilerler. Hazırlanan tüplerin her birini iki mililitrelik mikro santrifüj tüpüne takın ve örnek adı artı düşük, orta veya yüksek olarak etiketleyin. Koyu mavi boya ön jel ile yaklaşık yarım olduğunda, elektroforez durdurmak ve jel kaset çıkarın.Kaseti açın ve jeli jiletle dikey olarak kesin. Cömertçe yüklü örnekleri üç kuyu ile şerit çıkarmak için. 1x TBE ve siyanür nükleik asit leke beş mikrolitre ve üç ila beş dakika kuluçka ile bir kap jel şerit ekleyin.Daha sonra çıkarılacak olan serbest adaptörün üst kısmını kolayca belirlemek için boyamanın yeterli olduğundan emin olun. Daha sonra, mavi ışık transilluminator yüzeyini tamamen distile de iyonize su ile temizleyin. Sonra boyama kabından jel parçası almak ve ışık kutusuna yerleştirin.Işık kutusunu açın ve turuncu filtre ile lekeli nükleik asitleri inceleyin. Lekeli jel üzerinde temsili bir ligated DNA örneği, burada gösterilir. Adaptör genellikle aşırı yüklü görünür ve bir çizgi olarak yukarıda çalışan ligated HIV1 DNA ile büyük bir blob olarak çalışır.Kırmızı çizgiler jel serbest adaptör kaldırmak için kesilecek siteleri gösterir ve üç eşit parçaya örnek bölmek. Yeni bir jilet kullanarak, jelin kenarlarını kesin. Daha sonra, adaptör ve alt jel parçaları kaldırmak için adaptörün hemen üzerinde kesin.Son olarak, genellikle yüksek molekül ağırlıklı DNA keskin bir yoğun sinyal var jel cepleri yaklaşık bir milimetre de dahil olmak üzere jel çok üst kesip. Kalan jel parçasını yatay olarak içeren üç eşit parçaya bölün. Düşük, orta ve yüksek molekül ağırlıklı alanlar.Daha sonra, iki milimetre parçalar halinde iki üç jel parçalarıher kesilmiş ve hazırlanan sıfır noktası beş mililitre mikrosantrifüj tüpler içine aktarın. Bir dakika boyunca açık kapaklarla en yüksek hızda döndürün. Bir jel slush oluşturmak için iki mililitrelik tüp içine delik jel parçaları sıkmak için.Herhangi bir jel parçacıkları sıfır noktası beş mililitrelik tüp altında kalırsa, elle bir iğne kullanarak iki mililitretüp aktarın. Her mikrosantrifüj tüp jel slush bir mililitre üre jel ekstraksiyon tampon ekleyerek DNA çıkarma prosedürü başlayın. Tüpleri son mikser üzerinde, oda sıcaklığında en az üç saat döndürün.Filtre sütunlarını hazırlayın. Membran tıkanmasını önleyen selüloz asetat membran filtreli her santrifüj sütununa küçük yuvarlak cam elyaf filtresi eklemek için temiz bir cımbız seti kullanın. Filtreyi ters boru kafası ucuyla yerleştirin.Kısaca jel slush ve ekstraksiyon tampon ile iki mililitre tüpler imal mikrocentrifuge, ve hazırlanan filtre sütunları için supernatant yedi yüz mikrolitre aktarın. Filtre sütunlarını bir dakika boyunca en yüksek hızda mikrosantrifüj de santrifüj edin. Sonra yeni bir iki mililitre mikrosantrifüj tüp yoluyla akış aktarın.Kalan supernatant ile sütunları yeniden yükleyin. Ekstraksiyon çamur mümkün olduğunca çok sıvı elde etmeye çalışın ve jel parçaları dahil olup olmadığını endişelenmeyin. Tekrar dön.Aynı çıkarma örneklerinin akışını birleştirin ve metin protokolünde açıklandığı gibi ilerleyin. Bu protokol, antiretroviral insan proteini A3G'nin yokluğunda veya varlığında Vif eksikliği OLAN HIV-1 ile enfekte olan CEMS-ST hücrelerinden alınan örneklerde kullanılmıştır. Her örnekten elde edilen toplam benzersiz okuma sayısının bir çizimi, artan A3G düzeylerinin toplam okuma sayısını azalttığını gösterir.A3G'nin ters transkriptaz aracılı cdna sentezi üzerindeki inhibitör etkisini yansıtan. Sonraki üç çizimde, moleküllerin ilk yüz seksen iki nükleotit içindeki her olası uzunluktaki fraksiyonu mavi histogramlarla gösterilir. A3G eklenmesi birkaç çok özel tekrarlanabilir pozisyonlarda kısa kesilmiş cdna moleküllerinin keskin bir artış maliyeti.Kesikli kırmızı çizgiler, ilgili konumda C'den T mutasyonlarına c taşıyan okuma yüzdelerini gösterir. Pozitif kontrol, sentetik oligonükleotidlerin dizi, uzunluk ve konsantrasyon havuzunun işlenmesiyle üretilebilir. Tüm moleküller sadece küçük varyasyonları ile eşit bolluk yakın görünmelidir.Bir kitaplık çalışması, sıralamada küçük bir uzunluk önyargısı oluşturuyorsa, boyut yanlılığını temsil eden eğimden türetilen bir normalleştirme faktörü uygulanması tavsiye edilir. Bu prosedür, DNA moleküllerinin üç asal ucunun belirlenmesinin nükleik asit metabolizması ares içine anahtar anlayışlar katacak diğer sistemlere kolayca adapte edilebilir. HIV ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bazı enfeksiyonların sadece belirlenmiş güvenlik laboratuvarlarında yapılması gerektiğini unutmayın.

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

İn Vitro Transkripsiyon Tahliller ve İlaç Keşfi Onların Uygulama

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

Çift iplikçikli RNA'ların tek iplikçikli RNA'ların tarafından üzerinde fingerprinting ve seçici tanınması, kimyasal olarak peptit nükleik asitler modifiye

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

DNA değişiklikler için Immunostaining: Confocal görüntülerin sayısal analiz

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Gerçek zamanlı analiz bağlama, transkripsiyon, çeviri ve ciro hücresel etkinleştirme sırasında küresel olayları görüntülemek üzere transkripsiyon faktörü

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Integrase-eksik Lentiviral vektörler üretimi için CRISPR/Cas9-aracılı Gene hücre bölünmesi içinde nakavt için bir iletişim kuralı

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Ökaryotlarda transkripsiyon hataları genom çapında gözetim

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Amplifikasyon tam uzunlukta HIV-1 Proviruses yakınındaki yeni nesil sıralama için

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

İzotermal amplifikasyon (RT-lamba) transkripsiyon-Loop-aracılı tahlil Zika virüs ve Housekeeping genler idrar, Serum ve sivrisinek örnekleri için ters

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

İnsan DNA dizileri için bağlama transkripsiyon faktörü belirlemek için gelişmiş Maya bir melez ekranlar

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

Sitogenetik teknikle Bemisia tabaci yumurta döllenme oranı belirleme

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...