Name: novel process for 3d printing decellularized matrices
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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Questo progetto è stato parzialmente finanziato da una sovvenzione da società ortopedica pediatrica del Nord America (POSNA) e il National Institutes of Health concedere NIBIB R21EB025378-01 (assegno di ricerca di Bioingegneria esplorativo).

1. ottenere e microsfere di pre-elaborazione
<ol><li>Microsfere di produrre con la matrice desiderata incapsulato (PLA-DM)2. Nota: È fondamentale che le microsfere sono di dimensione uniforme. Per questo motivo, la setacciatura di microsfere prima dell'uso è indispensabile. Anche se l'incapsulamento e decellularizzazione di matrice sono stati dettagliati in precedenti pubblicazioni2, segue un breve riassunto del processo.<ol>
<li>In primo luogo, raccogliere tappi di ...

<ol>
	<li>Hutchmaker, D., Teoh, S., Zein, I., Ng, K. W., Schantz, J. -. T., Leahy, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+Fabrication+of+a+3D+Scaffold+for+Tissue+Engineering+Bone.">Design and Fabrication of a 3D Scaffold for Tissue Engineering Bone.</a> Synthetic Bioabsorbable Polymers and Implants. 15 (2), 845-847 (1988).</li><li>Ghosh, P., Gruber, S. M. S., Lin, C. -. Y., Whitlock, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microspheres+containing+decellularized+cartilage+induce+chondrogenesis+and+remain+functional+after+incorporation+within+a+poly(caprolactone)+filament+useful+for+fabricating+a+3D+scaffold.">Microspheres containing decellularized cartilage induce chondrogenesis and remain functional after incorporation within a poly(caprolactone) filament useful for fabricating a 3D scaffold.</a> Biofabrication. , (2018).</li><li>Partington, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+changes+caused+by+decellularization+may+compromise+mechanical+integrity+of+tracheal+scaffolds.">Biochemical changes caused by decellularization may compromise mechanical integrity of tracheal scaffolds.</a> Acta Biomaterialia. 9 (2), 5251-5261 (2013).</li><li>Hutmacher, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffolds+in+tissue+engineering+bone+and+cartilage.">Scaffolds in tissue engineering bone and cartilage.</a> Biomaterials. 21 (24), 2529-2543 (2000).</li><li>Kang, H., Hollister, S. J., La Marca, F., Park, P., Lin, C. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+biodegradable+lumbar+interbody+fusion+cage+design+and+fabrication+using+integrated+global-local+topology+optimization+with+laser+sintering.">Porous biodegradable lumbar interbody fusion cage design and fabrication using integrated global-local topology optimization with laser sintering.</a> Journal of biomechanical engineering. 135 (10), 101013-101018 (2013).</li><li>Kang, H., Lin, C. Y., Hollister, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topology+optimization+of+three+dimensional+tissue+engineering+scaffold+architectures+for+prescribed+bulk+modulus+and+diffusivity.">Topology optimization of three dimensional tissue engineering scaffold architectures for prescribed bulk modulus and diffusivity.</a> Structural and Multidisciplinary Optimization. 42 (4), 633-644 (2010).</li><li>Lin, C. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+bone+engineering+using+ex+vivo.+gene+therapy+and+topology-optimized,+biodegradable+polymer+composite+scaffolds.">Functional bone engineering using ex vivo. gene therapy and topology-optimized, biodegradable polymer composite scaffolds.</a> Tissue Engineering. 11 (9-10), 1589-1598 (2005).</li><li>Lin, C. -. Y., Hsiao, C. -. C., Chen, P. -. Q., Hollister, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interbody+Fusion+Cage+Design+Using+Integrated+Global+Layout+and+Local+Microstructure+Topology+Optimization.">Interbody Fusion Cage Design Using Integrated Global Layout and Local Microstructure Topology Optimization.</a> Spine. 29 (16), 1747-1754 (2004).</li><li>Zopf, D., Hollister, S., Nelson, M., Ohye, R., Green, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioresorbable+Airway+Splint+Created+with+a+Three-Dimensional+Printer.">Bioresorbable Airway Splint Created with a Three-Dimensional Printer.</a> New England Journal of Medicine. 368 (21), 2043-2045 (2013).</li><li>Pati, F., Song, T. H., Rijal, G., Jang, J., Kim, S. W., Cho, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ornamenting+3D+printed+scaffolds+with+cell-laid+extracellular+matrix+for+bone+tissue+regeneration.">Ornamenting 3D printed scaffolds with cell-laid extracellular matrix for bone tissue regeneration.</a> Biomaterials. 37, 230-241 (2015).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+interface+microstructure+on+interfacial+shear+strength+for+osteochondral+scaffolds+based+on+biomimetic+design+and+3D+printing.">The effect of interface microstructure on interfacial shear strength for osteochondral scaffolds based on biomimetic design and 3D printing.</a> Materials Science and Engineering C. 46, 10-15 (2015).</li><li>Williams, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tissue+engineering+using+polycaprolactone+scaffolds+fabricated+via.+selective+laser+sintering.">tissue engineering using polycaprolactone scaffolds fabricated via. selective laser sintering.</a> Biomaterials. 26 (23), 4817-4827 (2005).</li><li>Monibi, F. A., Cook, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-Derived+Extracellular+Matrix+Bioscaffolds:+Emerging+Applications+in+Cartilage+and+Meniscus+Repair.">Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioscaffolds: Emerging Applications in Cartilage and Meniscus Repair.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. , (2017).</li><li>Wiles, K., Fishman, J., Coppi, P., Birchall, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Host+Immune+Response+to+Tissue-Engineered+Organs:+Current+Problems+and+Future+Directions.">The Host Immune Response to Tissue-Engineered Organs: Current Problems and Future Directions.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 22 (3), (2016).</li><li>Sutherland, A. J., Detamore, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+Microsphere-Based+Scaffolds+Containing+Decellularized+Cartilage.">Bioactive Microsphere-Based Scaffolds Containing Decellularized Cartilage.</a> Macromolecular Bioscience. , (2015).</li><li>Whitlock, P. W., Smith, T. L., Poehling, G. G., Shilt, J. S., Van Dyke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+naturally+derived,+cytocompatible,+and+architecturally+optimized+scaffold+for+tendon+and+ligament+regeneration.">A naturally derived, cytocompatible, and architecturally optimized scaffold for tendon and ligament regeneration.</a> Biomaterials. , (2007).</li><li>Whitlock, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cyclic+strain+on+tensile+properties+of+a+naturally+derived,+decellularized+tendon+scaffold+seeded+with+allogeneic+tenocytes+and+associated+messenger+RNA+expression.">Effect of cyclic strain on tensile properties of a naturally derived, decellularized tendon scaffold seeded with allogeneic tenocytes and associated messenger RNA expression.</a> Journal of surgical orthopaedic advances. 22 (3), 224-232 (2013).</li><li>Whitlock, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+process+for+optimizing+musculoskeletal+allograft+tissue+to+improve+safety,+ultrastructural+properties,+and+cell+infiltration.">A novel process for optimizing musculoskeletal allograft tissue to improve safety, ultrastructural properties, and cell infiltration.</a> Journal of Bone and Joint Surgery - Series A. 94 (16), 1458-1467 (2012).</li><li>Schultz, G. S., Davidson, J. M., Kirsner, R. S., Herman, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Reciprocity+in+the+Wound+Microenvironment.">Dynamic Reciprocity in the Wound Microenvironment.</a> Wound Repair Regeneration. 19 (2), 134-148 (2012).</li><li>Benders, K. E. M., van Weeren, P. R., Badylak, S. F., Saris, D. B. F., Dhert, W. J. A., Malda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+scaffolds+for+cartilage+and+bone+regeneration.">Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration.</a> Trends in Biotechnology. 31 (3), 169-176 (2013).</li><li>Crapo, P., Gilbert, T., Badylak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Guan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+kidneys+as+a+source+of+ECM+scaffold+for+kidney+regeneration.">Porcine kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration.</a> Materials Science and Engineering C. 56, 451-456 (2015).</li><li>Dean, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+studies+with+alkaline+phosphatase+in+the+presence+and+absence+of+inhibitors+and+divalent+cations.">Kinetic studies with alkaline phosphatase in the presence and absence of inhibitors and divalent cations.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 30 (6), 401-407 (2002).</li></ol>

Entrambi decellularized matrici e 3D stampato scaffold PCL sono stati indicati in modo indipendente per permettere l'adesione e la proliferazione delle cellule, convalidando il loro uso per osteocondrali riparazione10,11,12. L'uso della matrice decellularizzati in ingegneria approcci alla riparazione tissutale è stato oggetto di molto interesse e successo nel recente passato2,<sup class="xref"...

Attuali tecniche di ingegneria tessutale per applicazioni cliniche come la ricostruzione dell'osso, della cartilagine, tendineo e legamentoso utilizzano auto - e allotrapianti per riparare il tessuto danneggiato. Ognuna di queste tecniche viene eseguita ordinariamente come "gold standard" nella pratica clinica di prima raccolta del tessuto donatore dal paziente o una corrispondenza cadaverica e poi mettendo il tessuto del donatore nel difetto sito2. Tuttavia, queste strategie sono limitate dalla morbilità del sito donatore, scarsità di sito donatore per grandi difetti, rischio di infezione e di difficoltà a trovare gli innesti che corrispondono la geometria desiderata. Inoltre, gli studi hanno indicato che allotrapianti utilizzati per la ricostruzione hanno ridotto proprietà meccaniche e biologiche quando confrontate con tessuto nativo3. Con queste considerazioni in mente, gli ingegneri del tessuto recentemente sono rivolti a tre dimensionale multimateriali (3D) per produrre geometrie personalizzate, complessi che sono biologicamente attivi e progettato per ospitare difetto dimensione e forma, fornendo sufficiente Proprietà meccaniche fino al completamento rimodellamento biologico.
Idealmente, un'impalcatura 3D-stampato consisterebbe in una catena polimerica che può mantenere la necessaria stabilità meccanica del tessuto nativo mentre il biologics incorporato offrono segnali biochimici circostanti cellule, conducente alla loro migrazione, proliferazione, differenziazione e tessuto produzione2,5. Purtroppo, maggior parte dei costrutti contenenti componenti biologici sono fatti con gel o polimeri che sono troppo deboli per resistere alle forze in vivo sperimentati dai tessuti mirati per la ricostruzione di auto/del documento non autografo. Altri polimeri quali acido polilattico (PLA) sono bioriassorbibili, 3D stampabili e strutturalmente suono, ma vengono stampati a temperature pari o superiore a 210 ° C - rendendo impossibile per biologics di essere co-stampato durante la fabbricazione. Policaprolattone (PCL) è un altro polimero bioresorbable autorizzato dal FDA, che può essere stampato ad una temperatura più bassa (65 ° C), che è diventato sempre più popolare nel fabbricare paziente-specifici impianti con morfologie complesse5,6 3D ,7,8,9. Tuttavia, la maggior parte bioprinters utilizzando la tecnologia pneumatica rendono impossibile per la stampa PCL a temperature più basse dove attività biologiche può rimanere illeso. Ad oggi, l'integrazione di questi polimeri con auto/allotrapianti in un romanzo biomateriale stampabile deve ancora essere realizzato. In assenza di tale materiale, è improbabile un approccio vero tessutale per la ricostruzione dei tessuti. Pertanto, abbiamo cercato di combinare PLA, PCL e decellularized matrici dell'allotrapianto (DM) di utilizzare i vantaggi di ogni materiale per produrre un costrutto vitale capace di ricostruire tessuti complessi. Questo processo avrebbe fornito l'iniziale resistenza meccanica necessaria per resistere a forze in vivo e la stabilità termica per ospitare la produzione di additivi in un costrutto che induce la formazione del tessuto desiderato.
In un recente tentativo di affrontare gli ostacoli di cui sopra, abbiamo dimostrato che è fattibile per incapsulare matrice extracellulare della cartilagine decellularizzati all'interno di una barriera PLA termicamente protettiva che può essere estruso all'interno di filamenti PCL, mantenendo la capacità di DM di influenzare circostante host celle2. Questo ci ha ispirato a cercare approcci clinicamente efficaci per la ricostruzione dei tessuti. Nello studio corrente, utilizziamo la tecnologia di piattaforma per costruire impalcature di all-in-one che includono PLA, DM e PCL (PLA-DM/PCL).
Il nostro obiettivo è di migliorare l'efficacia e l'utilità dei documenti non autografo utilizzando la tecnica proposta biofabrication romanzo di ricapitolare più accuratamente tessuto nativo, per poterli utilizzare in definitiva in varie applicazioni.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:877px;" width="877">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Sieve machine</td>
			<td style="width:396px;">Haver &#38; Boecker Tyler</td>
			<td style="width:132px;">Ro-Tap RX 29-E Pure</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sieve 90 um</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>170328156</td>
			<td>No. 170</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sieve 53 um</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>162513588</td>
			<td>No. 270</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sieve 106 um</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>162018121</td>
			<td>No. 140</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sputter coater</td>
			<td>Leica</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scanning Electron Microscope</td>
			<td>Hitachi, USA</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filabot EX2</td>
			<td>Filabot.com</td>
			<td>FB00061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filabot Spooler</td>
			<td>Filabot.com</td>
			<td>FB00073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CAPA 6506</td>
			<td>Perstorp</td>
			<td>24980-41-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline, PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6&#34; Fan</td>
			<td>Comfort Zone, Amazon</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultrasonic Water Bath</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>SK-08895-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dreamer</td>
			<td>FlashForge</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Drum Mixer</td>
			<td>Custom made</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Similar piece of equipment: https://www.coleparmer.com/i/argos-technologies-flexiroll-digital-tube-roller-shaker-120-vac/0439744?PubID=UX&#38;persist=true&#38;ip= 
			no&#38;gclid=CjwKCAjw- 
			dXaBRAEEiwAbwCi5khGDMz0 
			dTjsraEsBGfhMEH7ytx 
			LQWGUPNgUJYQ1p3vj_yxkYoI_ 
			ixoC9GwQAvD_BwE</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micro Balance</td>
			<td>Mettler Toledo, Fisher Scientific</td>
			<td>01-913-851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Simplify3D</td>
			<td>Simplify3D</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SolidWorks</td>
			<td>SolidWorks</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microspheres</td>
			<td>Produced in-house, see concurrently submitted JoVE submission</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">p-nitrophenyl phosphate, disodium salt, hexahydrate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>4876-5GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphatase, alkaline</td>
			<td>Roche Diagnostics GmbH</td>
			<td>10 713 023 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Absorbance Reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Sunrise</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris-HCl Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6455-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heated shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Excella E24</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

novel process for 3d printing decellularized matrices

3D multimateriali mira a creare personalizzate impalcature che sono biologicamente attivi e ospitare la dimensione desiderata e la geometria. Un backbone termoplastico in grado di fornire stabilità meccanica simile a tessuto nativo mentre agenti biologici offrono spunti compositivi di cellule progenitrici, che conduce alla loro migrazione, proliferazione e differenziazione di ricostituire i tessuti originali / organi1,2. Purtroppo, molti compatibile di stampa 3D, polimeri bioriassorbibili (come l'acido polilattico, PLA) sono stampati a temperature di 210 ° C o superiore - temperature che sono dannose per farmaci biologici. D'altra parte, policaprolattone (PCL), un diverso tipo di poliestere, è un bioriassorbibili, 3D materiale stampabile che ha una temperatura di stampa più delicata di 65 ° C. Di conseguenza, è stato supposto quello tabella extracellulare decellularizzato (DM) contenuto all'interno di una barriera PLA termicamente protettiva potrebbe essere stampato all'interno del filamento PCL e rimangono nella sua conformazione funzionale. In questo lavoro, osteocondrali riparazione era l'applicazione per cui l'ipotesi è stata provata. Come tale, cartilagine suina era decellularized e incapsulata in acido polilattico (PLA) le microsfere che poi sono state estruse con policaprolattone (PCL) nel filamento per produrre costrutti 3D tramite fusa modellazione a deposizione. I costrutti con o senza le microsfere (PLA-DM/PCL e PCL(-), rispettivamente) sono stati valutati per le differenze nelle caratteristiche della superficie.

Dopo setacciatura, microsfere dovrebbero apparire uniforme e liberi da aggregati. In SEM, le microsfere setacciate possono avere piccoli pori sulla loro superficie, ma in caso contrario sarà sferica e liscia, come mostrato nella Figura 1. Tutti i filamenti estrusi devono essere di diametro uniforme e di sezione circolare. Un filamento contenente microsfere (PLA-DM/PCL) avrà un leggermente più opaco a finire, mentre un solo PCL (PCL(-)) filamento apparirebb...

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Novel Process for 3D Printing Decellularized Matrices

Questo protocollo descrive la produzione di filamenti di policaprolattone (PCL) con microsfere di acido (PLA) incorporato polilattico che contengono matrici decellularizzate (DM) per la stampa 3D del tessuto strutturale ingegneria costrutti.

Processo innovativo per la stampa 3D Decellularized matrici

3D bioprinting aims to create custom scaffolds that are biologically active and accommodate the desired size and geometry. A thermoplastic backbone can ...

Questo metodo consente la co-stampa sia di sintetici strutturali che di componenti biologici per impalcature ingegnerizzate in tessuto. Queste impalcature possono replicare l'ambiente tissutale nativo in modo più accurato, il che può essere utile per le cellule coltivate. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può stampare strutture meccanicamente sonore senza danneggiare il materiale biologico incapsulato all'interno delle impalcature in una tecnica all-in-one per l'ingegneria tissutale.Produrre microsfere con la matrice desiderata incapsulata. Queste microsfere sono state realizzate con cartilagine decellularizzata da arti posteriori suini. Variano in dimensioni.Lavorare con una macchina a setaccio per ottenere microsfere di dimensioni uniformi. Assicurarsi che i tre vassoi del setaccio siano stati accuratamente puliti e asciugati prima dell'uso. Assemblare lo shaker del setaccio con il vassoio in rete più grande sulla parte superiore e il vassoio di rete più piccolo al centro.Metti la padella del setaccio sul fondo. Posizionare le microsfere secche nel vassoio più alto. Quindi posizionare il coperchio sul vassoio.Setaccio grossolano per otto o dieci minuti. Quindi setaccio fine per otto o dieci minuti. Durante l'attesa, disporre la carta di pesata per le sfere setacciate.Quando il setaccio è completo, rimuovere con cura un vassoio del setaccio. Posizionare il vassoio a testa in giù sulla carta di pesata. Toccare delicatamente i lati per assicurarsi che la maggior parte delle sfere cada.Con tutte le piastre del setaccio svuotate sulla carta di pesata, scartare le sfere sovrasize e sottotaglio. Le sfere rimanenti hanno la dimensione corretta per l'uso nei passaggi successivi. Posizionare queste sfere in un tubo di centrifuga etichettato.Conservare il tubo in un congelatore Celsius di 20 gradi fino a quando necessario. Pesare il materiale necessario per realizzare il materiale del filamento. Fai un rapporto peso-uno-quattro tra microsfere e polvere di policaprolattone con almeno 25 grammi di microsfere.Trasferire la miscela di polvere in un miscelatore di rotolamento in miniatura. Mescolare la polvere a 20 rotazioni al minuto per cinque minuti. Dopo cinque minuti, interrompere la rotazione e capovolgere il contenitore.Quindi mescolare a 20 giri/min per altri cinque minuti. Per continuare, portare la miscela in un'impostazione di estrusore e spooler. Impostare l'estrusore in modo che la sua presa sia a circa 60 centimetri dall'ingresso di uno spooler.Quindi, all'elemento riscaldante dell'estrusore, assicurati che non ci sia una giacca isolante. Posizionare una ventola del desktop a metà strada tra l'estrusore e lo spooler per raffreddare l'estruso. Metti un altro ventilatore vicino alla giacca riscaldante per raffreddarlo con aria ambiente.Assicurarsi quindi che l'ugello corretto sia collegato all'estrusore e impostare la temperatura dell'elemento riscaldante. Avviare le ventole di raffreddamento e consentire allo strumento di raggiungere uno stato stazionario. Dopo 20-30 minuti, ottenere la miscela PCL della microsfera e riempire la tramoggia dell'estrusore.Accendete lo spooler e la coclea dell'estrusore per avviare l'estrusione del filamento. Utilizzare le forcep e tirare manualmente il filamento estruso iniziale. Alimentare il filamento allo spooler del filamento.Mentre è estruso, osserva il filamento per identificarne la composizione. Dopo un po 'di tempo, la composizione del filamento apparirà uniforme che si desidera. Avvolgere il nastro attorno al filamento per contrassegnare l'inizio della regione uniforme.Oltre i rulli dello spooler, monitorare il diametro del filamento. Utilizzare le pinze per verificare se il diametro è vicino agli 1,75 mm desiderati. Regolare lo spooler e le velocità e le temperature dell'estrusore in base alle esigenze.Per regolare il diametro del filamento, modificare innanzitutto le velocità dello spooler e dell'estrusore. È inoltre possibile modificare la temperatura dell'estrusore, anche se questo di solito non è necessario. Continuare a riempire la tramoggia ed estrudere fino a quando non viene utilizzata tutta la polvere.Quando la tramoggia è quasi vuota, aggiungere polvere PCL alla tramoggia per sciacquare la miscela di microsfera. Monitorare l'estruso durante l'aggiunta della polvere PCL. All'inizio, le microsfere saranno ancora visibili nell'estruso.Alla fine, quando non sono visibili più microsfere, smetti di aggiungere il PCL. Separare ed etichettare il filamento con microsfere nella concentrazione desiderata. Quando c'è polvere minima nella tramoggia, smetti di estrudere e spegni l'attrezzatura.Il filamento può essere utilizzato in una stampante standard di modellazione della deposizione fusa. Caricare il filamento nella stampante dotata di ugelli del diametro desiderato. Con il modello caricato, impostare la temperatura e la velocità lineare per la stampa e iniziare a depositare il filamento.Il filamento personalizzato viene depositato strato per strato. Prestare particolare attenzione al primo livello e regolare le impostazioni in base alle esigenze. Queste due impalcature stampate in 3D sono difficili da distinguere in questa scala.Uno ha filamento contenente policapralattone, solo PCL. L'altro ha filamenti PCL con microsfere incorporate di acido polilattico e matrici decelluarizzate. Vista usando la microscopia elettronica a scansione, l'impalcatura solo PCL appare per lo più liscia.Al contrario, per l'altro filamento, le microsfere incorporate nel PCL sono visibili in tutto il campione. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che le microsfere sovra o sottotaglio possono influire sulla dinamica del flusso del materiale nell'estrusore. Per questo motivo, assicurarsi di preparare correttamente le microsfere prima dell'uso.Al fine di ridurre al minimo gli sprechi, è consigliabile creare un grande lotto di filamento necessario per tutti gli esperimenti piuttosto che creare lotti più piccoli più frequentemente. L'esperienza nella produzione di filamenti arriverà nel tempo. Le impalcature prodotte a seguito di questa procedura possono essere ulteriormente valutate in vitro e in vivo per rispondere a ulteriori domande su una maggiore induzione e resistenza meccanica rispetto ad altre impalcature biostampati.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo dell'ingegneria tissutale per esplorare l'induzione controgenica della matrice suina decelluarizzata all'interno delle impalcature 3D. Non dimenticare che lavorare con piccole particelle può presentare rischi respiratori. Si incoraggia l'uso di una piccola maschera di particolato durante questa procedura.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Bioingegneria

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