Name: listeria monocytogenes infection of the brain
Uploaded: 2018-10-02T15:00:00
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Ce travail a été soutenu par U.S. Public Health Service Don AI103806 de la National Institutes of Health.

Tous les animaux doivent être entretenus et manipulés avec grand soin afin de minimiser l’inconfort au cours de la procédure. La procédure doit être effectuée dans le respect de toutes les lois fédérales, provinciales et municipales et Comité de l’emploi et l’institutionnel animalier. Notez également que les expériences de laboratoire doivent être effectués conformément aux lignes directrices sur la biosécurité de niveau 2.
1. la croissance de L. monocytogenes pour...

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L. monocytogenes est capable de provoquer une méningo-encéphalite mortelle chez les humains. Des études antérieures ont démontré la capacité des bactéries à traverser la barrière hémato-encéphalique (BHE) et de coloniser le cerveau. Trois voies d’invasion du cerveau ont été proposées au cours de l’infection : direct pénétration du BBB par des bactéries, stealth transport de bactéries contenues à l’intérieur des cellules mononucléaires3et migration axonale par ...

La bactérie Gram-positive de Listeria monocytogenes est un pathogène intracellulaire facultatif et l’un des plupart pathogènes d’origine alimentaire mortelle dans le monde entier. Ingestion d’aliments de L. monocytogenes contaminés peut conduire à la listériose chez l’homme, une grave maladie invasive ciblant les femmes enceintes pour la plupart, les nouveau-nés, les personnes âgées et immunodéprimées1. L. monocytogenes est parmi les principales causes de décès par un pathogène d’origine alimentaire aux États-Unis et les taux de létalité de listériose sont aussi hautes que 20 à 30 %, le plus élevé de tous les pathogènes d’origine alimentaire2. Aucun vaccin n’existe actuellement pour L. monocytogenes et la capacité des bactéries à diffuser efficacement aux organes distales et le cerveau en traversant la barrière sang - encéphalique (BHE) peut conduire à la méningite mortelle et la colonisation du cerveau3 , 4 , 5 , 6. la méningite bactérienne est habituellement sévère ; Bien que la plupart des gens qui reçoivent un traitement rétablissent, infections peuvent entraîner des complications graves, par exemple, des dommages au cerveau, une perte auditive ou des troubles d’apprentissage chez les enfants. L. monocytogenes est prédit pour en tenir compte au moins 10 % de toutes les communauté acquis méningite dans le US7.
Une importante voie de diffusion bactérienne dans le cerveau et les méninges est par le biais de la circulation sanguine. Les bactéries qui circulent dans les vaisseaux sanguins dans le cerveau sont capables de traverser la BHE pour causer une infection du cerveau. Le BBB est un système de barrière fortement vascularisé qui protège le cerveau contre les particules étrangères circulant dans le sang. Les cellules endothéliales constituent une couche qui tapisse la surface interne des vaisseaux sanguins8,9. En plus de L. monocytogenes, plusieurs bactéries pathogènes tels que Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coliet Haemophilus influenzae type b (Hib) sont capables de coloniser le cerveau en traversant la BBB3,4,5,6. Toutefois, lors de l’examen des charges bactériennes dans le cerveau des souris infectées, il est important de déterminer que si les bactéries ont traversé la BHE, autrement la charge bactérienne dans le cerveau peut-être représenter des bactéries qui se trouvent encore dans les vaisseaux sanguins du cerveau. Ainsi, il est nécessaire de perfuse les souris de tout le sang avant de déterminer les unités formant colonie (UFC) d’homogénats de cerveau.
Dans cette étude, nous décrivons les méthodes in vivo pour examiner L. monocytogenes infection du cerveau. Les méthodes décrites ici, nous avons utilisé la souche 10403S de L. monocytogenes . L. monocytogenes 10403S est une des souches plus largement utilisés en laboratoire pour étudier la listériose systémique chez la souris de l’infection par10. Ce protocole est basé sur l’injection intraveineuse standard de L. monocytogenes , suivie d’une perfusion des souris. Une ébauche de plan du protocole infection chez la souris est illustré à la Figure 1. L. monocytogenes-cerveaux infectés et autres organes des souris non perfusés ou perfusés ont été prélevés et la charge bactérienne organe déterminé. Ces méthodes sont utiles pour déterminer non seulement la colonisation bactérienne totale du cerveau chez les animaux infectés, mais sont aussi bénéfiques pour déterminer si les bactéries ont pénétré le BBB en vivo de médiation invasion du cerveau. Il est important de souligner que ce protocole de laboratoire devrait être effectué à l’issue d’une consultation avec l’infogérance Comité et animal de biosécurité institutionnels pertinents.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:665px;" width="665">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Brain Heart Infusion media</td>
			<td style="width:119px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">237200</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptomycin sulfate&#160;</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0382-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:261px;">IKA T18 ULTRA-TURRAX Basic Homogenizer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3352109</td>
			<td>Model: T18BS1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectrophotometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>DU 800 series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BALB/c mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Model #000651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 mL syringes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">26-gauge needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">21-gauge butterfly needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Round-bottom test tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60819-546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel spatula</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel scissors (6.5 in)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel scissors (4.5 in)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel blunt forceps&#160; (4.5 in)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel fine tip forceps&#160; (6 in)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-406</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

listeria monocytogenes infection of the brain

Listeria monocytogenes est un bactérie pathogène intracellulaire qui est fréquemment associé à une infection d’origine alimentaire. La capacité de L. monocytogenes de franchir la barrière sang - encéphalique (BHE) est relative car elle peut conduire à la méningite et l’encéphalite mortelle. Le BBB protège le microenvironnement de cerveau de divers métabolites toxiques et agents pathogènes microbiens dans le sang suite à une infection et souscrit donc l’homéostasie du cerveau. Les mécanismes par lesquels L. monocytogenes présents dans le sang traverser la BHE provoque le cerveau les infections ne sont pas totalement comprises, et il y a aussi un manque d’un système robuste de modèle pour étudier les infections cérébrales par L. monocytogenes. Nous présentons ici un modèle d’infection de souris simple pour déterminer si les bactéries ont traversé la BHE et quantifier le fardeau des bactéries qui ont colonisé le cerveau in vivo. Dans cette méthode, les animaux étaient infectés par voie intraveineuse par L. monocytogenes et ont été euthanasiés humainement par l’exposition au CO2 suivi par dislocation cervicale. La perfusion cardiaque des animaux a été réalisée avant la récolte d’organes infectés. Sang a été prélevé avant la perfusion et le nombre de bactéries par organe ou mL de sang a été déterminée par l’ensemencement de dilutions des homogénats sur plaques de gélose sang ou d’organe et compter le nombre de colonies formées. Cette méthode peut être utilisée pour étudier les interactions ligand-récepteur roman qui améliorent une infection du cerveau par L. monocytogenes et peuvent être facilement adapté pour l’étude de plusieurs bactéries pathogènes.

Le cerveau est fortement vascularisé et L. monocytogenes est connu pour infecter les types de cellules présents dans le sang3,13. Le protocole décrit est utilisé pour démontrer la capacité de L. monocytogenes de franchir la barrière sang - encéphalique (BHE) conduisant à l’infection du cerveau chez la souris. Pour déterminer si les bactéries ont traversé le BBB en vivo, perfusion de sang ch...

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Listeria monocytogenes Infection of the Brain

Listeria monocytogenes Infection du cerveau

Au cours de l’infection, Listeria monocytogenes est capable de traverser la barrière hémato - encéphalique pour coloniser le cerveau. Dans ce protocole, nous démontrons comment évaluer la colonisation bactérienne des organes suite à une infection de la souris. Une procédure pour effectuer la perfusion des organes entiers pour la détermination précise du nombre de bactéries dans le parenchyme du cerveau est prévue.

Listeria monocytogenes is an intracellular bacterial pathogen that is frequently associated with food-borne infection. The ability of&#160;L. ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la pathogénie bactérienne sur la question de savoir si les bactéries d’origine sanguine peuvent traverser la barrière céphalo-cérébrale pour infecter le système nerveux central et le cerveau. Avec cette technique, les nombres bactériens dans le sang et le tissu cérébral des animaux infectés peuvent être déterminés tout en excluant le nombre de bactéries résidant dans les vaisseaux sanguins du cerveau. Pallab Ghosh, un associé de recherche de mon laboratoire, démontrera la procédure.À 72 heures après l’infection, réglez un système de perfusion automatisé à un débit de quatre millilitres de PBS complété par 10 millimolaire d’EDTA par minute. Et placez l’animal euthanasié dans la position supine dans une casserole de dissection. Confirmer l’euthanasie par un manque de réponse au pincement des pattes.Et mouiller l’abdomen avec 75% d’éthanol. Utilisez des ciseaux pour faire une incision de la paroi abdominale juste en dessous de la cage thoracique pour exposer le diaphragme et les organes viscéraux. Et couper le diaphragme pour ouvrir la cavité thoracique.Couper la cage à frottement bilatéralement pour exposer le ventricule gauche et utiliser des forceps pour saisir doucement le cœur. Insérez une aiguille papillon de calibre 21 reliée au système de perfusion dans le ventricule gauche et coupez soigneusement l’oreillette droite pour recueillir environ 200 microlitres de sang dans un tube de deux millilitres contenant 10 millimolaires EDTA pour empêcher la coagulation. Puis infuser l’animal pendant quatre minutes avec 15 à 20 millilitres de PBS plus EDTA.Après perfusion complète, le cerveau et le foie apparaîtront blanchis en s’assurant que les bactéries restantes proviennent des organes récoltés et non du sang circulant. Après perfusion, transférez soigneusement les organes d’intérêt dans des tubes coniques stériles de 15 millilitres contenant cinq millilitres de PBS stérile de quatre degrés Celsius par tube. Pour récolter le cerveau après la décapitation, utilisez des ciseaux pour couper la peau du cuir chevelu vers le bas de la ligne médiane entre les yeux, en gardant les pointes pressées contre le crâne pour couper tout excès de tissu si nécessaire.Insérez doucement une pointe des ciseaux dans le magnum foramen et coupez latéralement dans le crâne des deux côtés. Couper soigneusement le crâne entre les yeux vers le bas de la ligne médiane dans le crâne, en prenant soin d’appliquer une pression latérale et d’éviter la perturbation du cerveau. À l’aide de forceps, ouvrez le crâne pour exposer le cerveau et placez une spatule entre la face inférieure du cerveau et la base du crâne pour transférer soigneusement le cerveau dans un tube de 15 millilitres contenant cinq millilitres de quatre degrés Celsius PBS.Dans un coffret de biosécurité, insérez la pointe et exécutez un homogénéisateur de tissu pendant 10 secondes dans l’eau de Javel séquentielle de 5%, l’eau stérile, 75% d’éthanol, et les solutions stériles d’eau dans les tubes coniques séparés de 15 millilitres. Lorsque la pointe a été complètement stérilisée, homogénéiser le cerveau infecté dans son tube. Lorsqu’il ne reste pas de fragments de tissus visibles, restérilisez la pointe pour empêcher le report bactérien à l’échantillon d’organe suivant et homogénéisez l’organe suivant.Lorsque tous les organes ont été homogénéisés, préparer 10 fois les dilutions périodiques de chaque organe homogénéisé dans PBS stérile et plaquer les dilutions sur les plaques d’agar infusion cerveau-coeur. Puis incuber les cultures homogénées de dilution à 37 degrés Celsius pendant la nuit et compter le nombre de colonies sur chaque plaque pour déterminer le nombre total de bactéries par organe ou millilitre de sang. Le calcul des charges bactériennes dans les organes de souris infectés par L.monocytogenes comme il vient de le démontrer suggère que la perfusion post-infection ne modifie pas significativement la charge bactérienne dans le sang ou les organes des souris infectées qui ont été examinés dans cette étude représentative.À la suite de cette procédure, les organes infectés par Listeria monocytogenes peuvent être traités pour une analyse supplémentaire, comme le traitement histopathologique, afin de répondre à d’autres questions sur l’infiltration de cellules inflammatoires dans les organes de souris infectés par rapport aux animaux de contrôle non infectés. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler d’éviter la perturbation du cerveau et de maintenir un contact minimal entre les ciseaux et le tissu cérébral.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Listeria monocytogenes Infection of the Brain

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

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