Name: listeria monocytogenes infection of the brain
Uploaded: 2018-10-02T15:00:00
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Diese Arbeit wurde unterstützt durch US Public Health Service gewähren AI103806 von den National Institutes of Health.

Alle Tiere sind gepflegt und behandelt mit größter Sorgfalt um Beschwerden im Verlauf des Verfahrens zu minimieren. Das Verfahren ist in Übereinstimmung mit den institutionellen Animal Care und Use Committee und alle staatlichen und lokalen Gesetze durchgeführt werden. Auch beachten Sie, dass die Labor-Experimente nach Biosafety Level 2 Richtlinien durchgeführt werden.
1. Wachstum von L. Monocytogenes für Studien an Mäusen Infektion
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Autoklaven 500 mL Brain He...

<ol>
	<li>Radoshevich, L., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes:+towards+a+complete+picture+of+its+physiology+and+pathogenesis.">Listeria monocytogenes: towards a complete picture of its physiology and pathogenesis.</a> Nature Reviews Microbiology. 16 (1), 32-46 (2018).</li><li>de Noordhout, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+burden+of+listeriosis:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">The global burden of listeriosis: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Infectious Diseases. 14 (11), 1073-1082 (2014).</li><li>Drevets, D. A., Leenen, P. J., Greenfield, R. 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A review of 493 episodes.</a> The New England Journal of Medicine. 328 (1), 21-28 (1993).</li><li>Disson, O., Lecuit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+the+central+nervous+system+by+Listeria+monocytogenes.">Targeting of the central nervous system by Listeria monocytogenes.</a> Virulence. 3 (2), 213-221 (2012).</li><li>Daneman, R., Prat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier.">The blood-brain barrier.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412 (2015).</li><li>Becavin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+widely+used+Listeria+monocytogenes+strains+EGD,+10403S,+and+EGD-e+highlights+genomic+variations+underlying+differences+in+pathogenicity.">Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity.</a> MBio. 5 (2), e00969-e00914 (2014).</li><li>Kirchner, M., Higgins, D. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+Listeria+monocytogenes+hypervirulence+by+harnessing+its+biodiversity.">Uncovering Listeria monocytogenes hypervirulence by harnessing its biodiversity.</a> Nature Genetics. 48 (3), 308-313 (2016).</li></ol>

L. Monocytogenes kann lebensbedrohliche Meningoenzephalitis beim Menschen verursachen. Vorherige Studien belegen die Fähigkeit von Bakterien, die Blut-Hirn-Schranke (BBB) zu überqueren und um das Gehirn zu kolonisieren. Drei Strecken der Gehirn-Invasion wurden vorgeschlagen, während der Infektion: direkte Penetration des BBB durch Bakterien, Stealth-Transport durch Bakterien in mononukleären Zellen3und axonalen Migration von L. Monocytogenes Stämme, die dazu führen, dass Rh...

Das grampositive Bakterium Listeria Monocytogenes ist ein fakultativ intrazellulärer Erreger und von der meisten tödlichen lebensmittelbedingten Krankheitserregern weltweit. Einnahme von L. Monocytogenes kontaminierte Lebensmittel führen zu Listeriose beim Menschen eine schwere invasive Erkrankung gezielt vor allem Schwangere, Neugeborene, die älteren und immungeschwächten Menschen1. L. Monocytogenes gehört zu den führenden Todesursachen durch ein Lebensmittel übertragbaren Erreger in den USA und Fall Sterberaten von Listeriose sind so hoch wie 20-30 %, die höchste für alle lebensmittelbedingten Krankheitserregern2. Derzeit existiert kein Impfstoff für L. Monocytogenes und die Fähigkeit der Bakterien, für distale Organe und das Gehirn effektiv zu verbreiten, durch die Kreuzung der Blut - Hirn-Schranke (BBB) führen zu lebensbedrohlichen Hirnhautentzündung und Kolonisierung des Gehirns3 , 4 , 5 , 6. bakterielle Meningitis ist in der Regel schwere; während die meisten Menschen, die Behandlung erholen, können Infektionen schwerwiegende Komplikationen, z.B., Hirnschäden, Hörverlust oder Lernbehinderungen bei Kindern verursachen. L. Monocytogenes wird vorausgesagt, um mindestens 10 % der ganzen Gemeinschaft berücksichtigen Meningitis in der US-7erworben.
Eine wichtige Route für bakterielle Verbreitung des Gehirns und der Hirnhäute wird durch den Blutstrom. Bakterien im Umlauf in den Blutgefäßen im Gehirn sind in der Lage die BBB zum Gehirn zu Infektionen führen zu überqueren. Die BBB ist ein stark vaskularisierte Barriere, die das Gehirn vor Fremdkörper im Blut zirkulierenden schützt. Endothelzellen bilden eine Schicht, die die innere Oberfläche der Blutgefäße8,9Linien. Neben L. Monocytogeneskönnen mehrere bakterielle Krankheitserreger wie Neisseria Meningitidis, Streptococcus Pneumoniae, Escherichia coliund Haemophilus Influenzae Typ B (Hib) besiedeln das Gehirn durch die Kreuzung der BBB3,4,5,6. Bakterielle Belastungen im Gehirn von infizierten Mäusen untersucht, ist es jedoch wichtig zu bestimmen, ob Bakterien die BBB überquert haben, ansonsten die bakterielle Belastung im Gehirn Bakterien darstellen kann, die noch in den Blutgefäßen des Gehirns sind. Daher ist es notwendig, die Mäuse alles Blut vor der Festlegung der koloniebildenden Einheiten (KBE) des Gehirns Homogenates durchspülen.
In dieser Studie beschreiben wir in-Vivo -Methoden um L. Monocytogenes -Infektion des Gehirns zu untersuchen. Für die hier beschriebenen Methoden verwendet wir L. Monocytogenes Stamm 10403S. L. Monocytogenes 10403S ist eines der am weitesten verbreitete laborbelastungen systemische Listeriose im Mausmodell der Infektion10zu studieren. Dieses Protokoll basiert auf standard intravenöse Injektion von L. Monocytogenes gefolgt von Perfusion der Mäuse. Abbildung 1zeigt ein schematischer Überblick über die Infektion Protokoll bei Mäusen. L. Monocytogenes-infizierten Gehirn und andere Organe von nicht durchblutet oder PERFUNDIERTEN Mäuse wurden gesammelt und die bakterielle Orgel Belastung bestimmt. Diese Methoden eignen sich für die Bestimmung nicht nur total bakteriellen Besiedelung des Gehirns bei infizierten Tieren, sondern sind auch vorteilhaft zur Feststellung, ob Bakterien die BBB in Vivo , Invasion des Gehirns zu vermitteln eingedrungen sind. Es ist wichtig hervorzuheben, dass diese Laborprotokoll durchgeführt werden sollte, nach Rücksprache mit dem relevanten institutionellen Biosafety Committee und Tier Facilitymanagement.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:665px;" width="665">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Brain Heart Infusion media</td>
			<td style="width:119px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">237200</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptomycin sulfate&#160;</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0382-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:261px;">IKA T18 ULTRA-TURRAX Basic Homogenizer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3352109</td>
			<td>Model: T18BS1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectrophotometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>DU 800 series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BALB/c mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Model #000651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 mL syringes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">26-gauge needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">21-gauge butterfly needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Round-bottom test tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60819-546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel spatula</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel scissors (6.5 in)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel scissors (4.5 in)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel blunt forceps&#160; (4.5 in)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel fine tip forceps&#160; (6 in)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-406</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

listeria monocytogenes infection of the brain

Listeria Monocytogenes ist eine intrazelluläre bakterielle Erreger, die häufig von lebensmittelbedingten Infektionen zugeordnet ist. Die Fähigkeit von L. Monocytogenes , überqueren Sie die Blut - Hirn-Schranke (BBB) ist über, wie es zu lebensbedrohlichen Meningitis und Enzephalitis führen kann. Die BBB schützt das Gehirn Mikroumgebung von verschiedenen toxischen Metaboliten und mikrobielle Krankheitserreger im Blut nach Infektion gefunden und unterstützt damit Gehirn Homöostase. Die Mechanismen, durch die L. Monocytogenes in den Blutkreislauf vorhanden überqueren die BBB verursachen Gehirn, die Infektionen nicht vollständig verstanden sind und es fehlt auch an ein stabiles Modellsystem Gehirn Infektionen von L. Monocytogeneszu studieren. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache Mausmodell Infektion zu bestimmen, ob Bakterien die BBB überquert haben und die Belastung durch Bakterien quantitate, die das Gehirn in Vivobesiedelt haben. Bei dieser Methode Tiere wurden intravenös mit L. Monocytogenes infiziert und wurden durch die Einwirkung von CO2 gefolgt von zervikale Dislokation Human eingeschläfert. Kardiale Perfusion der Tiere erfolgte vor der Ernte infizierter Organen. Blut war vor Perfusion gesammelt und die Anzahl der Bakterien pro Organ oder mL Blut wurde bestimmt durch Ausplattieren Verdünnungen von Blut oder Orgel Homogenates auf Agarplatten und zählen die Anzahl der Kolonien gebildet. Diese Methode kann verwendet werden, um neuartige Rezeptor-Ligand-Interaktionen zu untersuchen, die Infektion des Gehirns von L. Monocytogenes und kann für die Untersuchung von mehreren bakteriellen Krankheitserregern leicht angepasst werden.

Das Gehirn ist stark durchblutet und L. Monocytogenes ist bekanntermaßen Zelltypen im Blut3,13infizieren. Das beschriebene Protokoll wird verwendet, um die Fähigkeit von L. Monocytogenes , überqueren Sie die Blut - Hirn-Schranke (BBB) führt zur Infektion des Gehirns bei Mäusen zeigen. Um festzustellen, ob Bakterien die BBB in Vivoüberquert haben, erfolgt die Perfusion des Blutes in die Maus vor der...

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Listeria monocytogenes Infection of the Brain

Listeria monocytogenes Infektion des Gehirns

Während der Infektion kann Listeria Monocytogenes überqueren der Blut - Hirn-Schranke um das Gehirn zu besiedeln. In diesem Protokoll veranschaulichen wir die bakterielle Besiedlung der Organe nach Infektion der Mäuse zu beurteilen. Ein Verfahren zur gesamten Organ Perfusion zur spezifischen Bestimmung der bakteriellen Zahlen in der Anwesenheit von durchführen steht zur Verfügung.

Listeria monocytogenes is an intracellular bacterial pathogen that is frequently associated with food-borne infection. The ability of&#160;L. ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der bakteriellen Pathogenese zu beantworten, ob blutgetragene Bakterien die Blut-Hirn-Schranke überqueren können, um das zentrale Nervensystem und das Gehirn zu infizieren. Mit dieser Technik können Bakterienzahlen im Blut und Hirngewebe infizierter Tiere bestimmt werden, während die Anzahl der Bakterien, die sich in den Blutgefäßen des Gehirns befinden, ausgeschlossen wird. Demonstrieren sie das Verfahren wird Pallab Ghosh, ein wissenschaftlicher Mitarbeiter aus meinem Labor.Nach 72 Stunden nach der Infektion, stellen Sie ein automatisiertes Perfusionssystem auf eine Durchflussrate von vier Milliliter PBS ergänzt mit 10 Millimolar EDTA pro Minute. Und legen Sie das eingeschläferte Tier in die Supine-Position in eine Sezierpfanne. Bestätigen Sie die Euthanasie durch mangelnde Reaktion auf Pfoten-Pinch.Und den Bauch mit 75% Ethanol befeuchten. Verwenden Sie eine Schere, um einen Bauchwandschnitt direkt unter dem Rippenkäfig zu machen, um das Zwerchfell und die viszeralen Organe freizulegen. Und schneiden Sie das Zwerchfell, um die Brusthöhle zu öffnen.Schneiden Sie den Reibekäfig bilateral, um den linken Ventrikel freizulegen, und verwenden Sie Zangen, um das Herz sanft zu greifen. Legen Sie eine 21-Spur-Schmetterlingsnadel, die mit dem Perfusionssystem verbunden ist, in den linken Ventrikel ein und schneiden Sie vorsichtig das rechte Atrium, um etwa 200 Mikroliter Blut in eine Zwei-Milliliter-Röhre mit 10 Millimolar EDTA zu sammeln, um eine Gerinnung zu verhindern. Dann durchdringen Sie das Tier für vier Minuten mit 15 bis 20 Milliliter PBS plus EDTA.Nach vollständiger Perfusion erscheinen Gehirn und Leber blanchiert und stellen sicher, dass die verbleibenden Bakterien aus den geernteten Organen stammen und nicht das zirkulierende Blut. Übertragen Sie die interessierten Organe nach der Perfusion sorgfältig in einzelne sterile, 15-Milliliter konische Röhren, die fünf Milliliter sterile vier Grad Celsius PBS pro Röhre enthalten. Um das Gehirn nach der Enthauptung zu ernten, verwenden Sie eine Schere, um die Kopfhaut auf der Mittellinie zwischen den Augen zu schneiden, wobei die Spitzen gegen den Schädel gedrückt werden, um überschüssiges Gewebe nach Bedarf zu trimmen.Legen Sie vorsichtig eine Spitze der Schere in das Foramen magnum und schneiden Sie seitlich in den Schädel auf beiden Seiten. Schneiden Sie vorsichtig den Schädel zwischen den Augen die Mittellinie im Schädel hinunter, wobei Sie darauf achten, seitlichen Druck auszuüben und Eine Störung des Gehirns zu vermeiden. Öffnen Sie mit Zangen den Schädel, um das Gehirn freizulegen, und legen Sie einen Spachtel zwischen der Unterseite des Gehirns und der Schädelbasis, um das Gehirn vorsichtig in eine 15-Milliliter-Röhre mit fünf Millilitern vier Grad Celsius PBS zu übertragen.In einem Biosicherheitsschrank die Spitze einlegen und einen Gewebehomogenisator 10 Sekunden lang in sequenziellen 5%Bleichmittel, sterilem Wasser, 75% Ethanol und sterilen Wasserlösungen in separaten 15-Milliliter-Konikonröhren ausführen. Wenn die Spitze gründlich sterilisiert wurde, homogenisieren Sie das infizierte Gehirn in seiner Röhre. Wenn keine sichtbaren Gewebefragmente übrig bleiben, sterilisieren Sie die Spitze erneut, um eine bakterielle Übertragung auf die nächste Organprobe zu verhindern, und homogenisieren Sie das nächste Organ.Wenn alle Organe homogenisiert sind, bereiten Sie 10-fache serielle Verdünnungen jedes Organs in sterilem PBS vor und verfestigen die Verdünnungen auf Gehirn-Herz-Infusionsagarplatten. Dann inkubieren Sie die homogenaten Verdünnungskulturen bei 37 Grad Celsius über Nacht und zählen Sie die Anzahl der Kolonien auf jeder Platte, um die Gesamtzahl der Bakterien pro Organ oder Milliliter Blut zu bestimmen. Die Berechnung der bakteriellen Belastungen in L.monocytogenes-infizierten Mausorganen, wie sie gerade nachgewiesen wurde, legt nahe, dass die Perfusion nach der Infektion die bakterielle Belastung im Blut oder in den Organen infizierter Mäuse, die in dieser repräsentativen Studie untersucht wurden, nicht signifikant verändert.Im Anschluss an dieses Verfahren können Listeria monocytogenes-infizierte Organe für zusätzliche Analysen wie die histopathologische Verarbeitung weiterverarbeitet werden, um zusätzliche Fragen zur Infiltration von Entzündungszellen in infizierte Mausorgane im Vergleich zu nicht infizierten Kontrolltieren zu beantworten. Beim Versuch dieses Verfahrens, Es ist wichtig, zu denken, um Störungen des Gehirns zu vermeiden und minimalen Kontakt zwischen der Schere und dem Gehirngewebe zu halten.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Listeria monocytogenes Infection of the Brain

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Mess-bakterielle Belastung und Immunreaktionen in Mäuse Infizierte mit Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Auswahl der Plasmodium falciparum Parasiten für Cytoadhesion zu Human Brain Endothelial Cells

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolierung und Analyse von Brain-sequestered Leukozyten aus<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-infizierte Mäuse

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

Mündliche Übertragung von<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; In Mäusen über die Aufnahme von kontaminierten Speisen

L. monocytogenes are facultative intracellular bacterial pathogens that cause food borne infections in humans. Very little is known about the ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Sekretion to Cellular-Infektion durch den bakteriellen Erreger untersuchen<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Beurteilung der bakteriellen Invasion von Herzzellen in Kultur und Herzkolonisation bei infizierten Mäusen mit Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA-Reinigung aus intrazellulär Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; In Makrophagenzellen

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³ Responses

Experimentelle Infektion mit<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Als Modell für die Untersuchung Host-Interferon-γ Antworten

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

The Galleria mellonella Waxworm Infection Model for Disseminated Candidiasis

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