Name: listeria monocytogenes infection of the brain
Uploaded: 2018-10-02T15:00:00
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Questo lavoro è stato supportato da U.S. Public Health Service concedere AI103806 dal National Institutes of Health.

Tutti gli animali sono essere mantenute e gestite con la massima cura per minimizzare il disagio nel corso della procedura. La procedura deve essere effettuata in conformità con la cura degli animali istituzionale, uso europeo e tutte le leggi federali, statali e locali. Si noti inoltre che gli esperimenti di laboratorio devono essere condotte conformemente agli orientamenti di livello 2 di biosicurezza.
1. crescita di L. monocytogenes per gli studi di infezione di Mouse
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	<li>Radoshevich, L., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes:+towards+a+complete+picture+of+its+physiology+and+pathogenesis.">Listeria monocytogenes: towards a complete picture of its physiology and pathogenesis.</a> Nature Reviews Microbiology. 16 (1), 32-46 (2018).</li><li>de Noordhout, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+burden+of+listeriosis:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">The global burden of listeriosis: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Infectious Diseases. 14 (11), 1073-1082 (2014).</li><li>Drevets, D. A., Leenen, P. J., Greenfield, R. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+Listeria+monocytogenes+hypervirulence+by+harnessing+its+biodiversity.">Uncovering Listeria monocytogenes hypervirulence by harnessing its biodiversity.</a> Nature Genetics. 48 (3), 308-313 (2016).</li></ol>

L. monocytogenes è in grado di causare meningoencefalite pericolosa in esseri umani. Studi precedenti hanno dimostrato la capacità dei batteri di attraversare la barriera emato-encefalica (BBB) e di colonizzare il cervello. Tre percorsi dell'invasione del cervello sono stati proposti durante l'infezione: diretta penetrazione della BBB da batteri, trasporto stealth da batteri contenuti all'interno di cellule mononucleari3e migrazione assonale da ceppi di L. monocytogenes che cau...

Il batterio gram-positivo Listeria monocytogenes è un agente patogeno intracellulare facoltativo e uno del maggior parte dei patogeni di origine alimentare mortale in tutto il mondo. Ingestione di cibo di L. monocytogenes contaminato può condurre alla listeriosi nell'uomo, una grave malattia invasiva mira principalmente gestanti, neonati, anziani che immunocompromised individui1. L. monocytogenes è tra le principali cause di morte da un agente patogeno alimentare negli Stati Uniti e case fatalità tariffe da listeriosi sono alte come 20 – 30%, il più alto per tutti i patogeni di origine alimentare2. Nessun vaccino attualmente esiste per L. monocytogenes e la capacità dei batteri di diffondere efficacemente a organi distali e il cervello attraversando l'emato - encefalica (BBB) può portare a pericolose meningite e colonizzazione del cervello3 , 4 , 5 , 6. la meningite batterica è in genere grave; mentre la maggior parte delle persone che ricevono il trattamento recuperano, infezioni possono causare gravi complicazioni, ad esempio, danni cerebrali, perdita dell'udito o difficoltà di apprendimento nei bambini. L. monocytogenes è preveduta per tenere conto di almeno il 10% di tutte le comunità acquisita meningite in US7.
Un itinerario importante per diffusione batterica al cervello e meningi è attraverso il flusso sanguigno. I batteri che circolano nei vasi sanguigni nel cervello sono in grado di attraversare la BBB per causare infezione del cervello. La BBB è un sistema altamente vascularized barriera che protegge il cervello da particelle estranee circolanti nel sangue. Cellule endoteliali costituiscono uno strato che riveste la superficie interna dei vasi sanguigni8,9. Oltre a L. monocytogenes, più batteri patogeni quali Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Escherichia colie Haemophilus influenzae di tipo b (Hib) sono in grado di colonizzare il cervello di attraversare la BBB3,4,5,6. Tuttavia, quando si esaminano gli oneri batterici nel cervello dei topi infettati, è importante determinare che se i batteri hanno attraversato la BBB, altrimenti la carica batterica nel cervello può rappresentare i batteri che sono ancora nei vasi sanguigni del cervello. Pertanto, è necessario di irrorare i topi di tutto il sangue prima di determinare le unità formanti colonie (CFU) degli omogeneati del cervello.
In questo studio, descriviamo i metodi in vivo per esaminare L. monocytogenes infezione del cervello. Per i metodi descritti qui, abbiamo utilizzato il ceppo di L. monocytogenes 10403S. L. monocytogenes 10403S è uno dei ceppi di laboratorio più ampiamente usati per studiare la listeriosi sistemica nel modello murino di infezione10. Questo protocollo è basato su standard iniezione endovenosa di L. monocytogenes seguita da aspersione dei topi. Una struttura schematica del protocollo infezione nei topi è illustrata nella Figura 1. L. monocytogenes-infetti cervello e altri organi da topi non perfusi o perfusi sono stati raccolti e l'onere di organo batterica determinato. Questi metodi sono utili per determinare non solo la totale colonizzazione batterica del cervello in animali infettati, ma sono anche utili per determinare se i batteri hanno penetrato il BBB in vivo per mediare l'invasione del cervello. È importante sottolineare che questo protocollo di laboratorio dovrebbe essere condotta a seguito della consultazione con rilevanti biosicurezza istituzionali Comitato e animal facility management.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:665px;" width="665">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Brain Heart Infusion media</td>
			<td style="width:119px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">237200</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptomycin sulfate&#160;</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0382-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:261px;">IKA T18 ULTRA-TURRAX Basic Homogenizer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3352109</td>
			<td>Model: T18BS1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectrophotometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>DU 800 series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BALB/c mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Model #000651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 mL syringes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">26-gauge needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">21-gauge butterfly needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Round-bottom test tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60819-546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel spatula</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel scissors (6.5 in)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel scissors (4.5 in)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel blunt forceps&#160; (4.5 in)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel fine tip forceps&#160; (6 in)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-406</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

listeria monocytogenes infection of the brain

Listeria monocytogenes è un agente patogeno batterico intracellulare che è frequentemente associato con l'infezione di origine alimentare. La capacità di L. monocytogenes di attraversare la barriera sangue - encefalica (BBB) è relativa come può portare a pericolose meningite ed encefalite. Il BBB protegge il microambiente di cervello da vari metaboliti tossici e agenti patogeni microbici trovati nel sangue dopo l'infezione e pertanto supporta l'omeostasi del cervello. I meccanismi da cui L. monocytogenes presente nel sangue attraversare la BBB per causare cervello infezioni completamente non sono capite e c'è anche una mancanza di un sistema robusto modello per studiare le infezioni del cervello da L. monocytogenes. Qui, presentiamo un modello di infezione mouse semplice per determinare se i batteri hanno attraversato la barriera emato-encefalica e per quantificare l'onere di batteri che hanno colonizzato il cervello in vivo. In questo metodo, gli animali sono stati infettati per via endovenosa con L. monocytogenes e umanamente sono stati eutanasizzati tramite l'esposizione al CO2 seguita da dislocazione cervicale. Aspersione cardiaca degli animali è stato effettuato prima della raccolta di organi infetti. Il sangue è stato raccolto prima di aspersione e il numero di batteri per organo o mL di sangue è stata determinata mediante diluizioni degli omogeneati su piastre di agar sangue e di organi di placcatura e contando il numero di colonie formate. Questo metodo può essere utilizzato per studiare le interazioni recettore-ligando romanzo che migliorano l'infezione del cervello da L. monocytogenes e possono essere facilmente adattato per lo studio di più agenti patogeni batterici.

Il cervello è altamente vascolarizzato e L. monocytogenes è conosciuto per infettare i tipi di cellule presenti nel sangue3,13. Il protocollo descritto viene utilizzato per dimostrare la capacità di L. monocytogenes di attraversare l'emato - encefalica (BBB) che conduce all'infezione del cervello nei topi. Per determinare se i batteri hanno attraversato il BBB in vivo, l'aspersione del sangue nel topo...

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Listeria monocytogenes Infection of the Brain

Listeria monocytogenes Infezione del cervello

Durante l'infezione, la Listeria monocytogenes è in grado di attraversare la barriera ematomeningea per colonizzare il cervello. In questo protocollo, dimostriamo come valutare la colonizzazione batterica degli organi a seguito di infezione dei topi. È disponibile una procedura per eseguire perfusione d'organo intero per determinazione specifica di numeri batterici nel parenchima del cervello.

Listeria monocytogenes is an intracellular bacterial pathogen that is frequently associated with food-borne infection. The ability of&#160;L. ...

Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave nel campo della patogenesi batterica se i batteri ematici possono attraversare la barriera emato-encefalica per infettare il sistema nervoso centrale e il cervello. Con questa tecnica, i numeri batterici all'interno del sangue e del tessuto cerebrale degli animali infetti possono essere determinati escludendo il numero di batteri residenti all'interno dei vasi sanguigni del cervello. A dimostrare la procedura sarà Pallab Ghosh, un ricercatore del mio laboratorio.A 72 ore dopo l'infezione, impostare un sistema di perfusione automatizzato su una portata di quattro millilitri di PBS integrata con 10 millimolare di EDTA al minuto. E mettere l'animale eutanasiato in posizione supina in una padella di dissezione. Conferma l'eutanasia per mancanza di risposta al paw pinch.E bagnare l'addome con il 75% di etanolo. Usa le forbici per fare un'incisione della parete addominale appena sotto la gabbia toracica per esporre il diaframma e gli organi viscerali. E tagliare il diaframma per aprire la cavità toracica.Tagliare la gabbia di strofinare bilateralmente per esporre il ventricolo sinistro e utilizzare le forcep per afferrare delicatamente il cuore. Inserire un ago a farfalla calibro 21 collegato al sistema di perfusione nel ventricolo sinistro e tagliare accuratamente l'atrio destro per raccogliere circa 200 microlitri di sangue in un tubo da due millilitri contenente EDTA da 10 millimolare per prevenire la coagulazione. Quindi perfondere l'animale per quattro minuti con da 15 a 20 millilitri di PBS più EDTA.Dopo una completa perfusione, il cervello e il fegato appariranno sbiancati assicurando che i batteri rimanenti provengono dagli organi raccolti e non dal sangue circolante. Dopo la perfusione, trasferire accuratamente gli organi di interesse in singoli tubi conici sterili da 15 millilitri contenenti cinque millilitri di pbs sterile a quattro gradi Celsius per tubo. Per raccogliere il cervello dopo la decapitazione, utilizzare le forbici per tagliare la pelle del cuoio capelluto lungo la linea mediana tra gli occhi, tenendo le punte premute contro il cranio per tagliare qualsiasi tessuto in eccesso se necessario.Inserire delicatamente una punta delle forbici nel magnum del forame e tagliarla lateralmente nel cranio su entrambi i lati. Tagliare con cura il cranio tra gli occhi lungo la linea mediana nel cranio, facendo attenzione ad applicare la pressione laterale ed evitare perturbazioni del cervello. Usando le forcep, apri il cranio per esporre il cervello e posizionare una spatola tra la parte inferiore del cervello e la base del cranio per trasferire attentamente il cervello in un tubo da 15 millilitri contenente cinque millilitri di quattro gradi Celsius PBS.In un armadio per la biosicurezza, inserire la punta ed eseguire un omogeneizzatore tissutale per 10 secondi in 5% di candeggina sequenziale, acqua sterile, 75% etanolo e soluzioni di acqua sterile in tubi conici separati da 15 millilitri. Quando la punta è stata completamente sterilizzata, omogeneizzare il cervello infetto nel suo tubo. Quando non rimangono frammenti di tessuto visibili, rister sterilizzare la punta per impedire il riporto batterico al campione di organo successivo e omogeneizzare l'organo successivo.Quando tutti gli organi sono stati omogeneizzati, preparare diluizioni seriali 10 volte di ogni organo omogeneato in PBS sterile e placcare le diluizioni sulle piastre di agar per infusione cervello-cuore. Quindi incubare le colture di diluizione omogenea a 37 gradi Celsius durante la notte e contare il numero di colonie su ogni piastra per determinare il numero totale di batteri per organo o millilitro di sangue. Il calcolo dei fardelli batterici negli organi del topo infetti da L.monocytogenes, come appena dimostrato, suggerisce che la post-infezione da perfusione non altera significativamente il carico batterico nel sangue o negli organi dei topi infetti esaminati in questo studio rappresentativo.Seguendo questa procedura, gli organi infetti da Listeria monocytogenes possono essere ulteriormente elaborati per ulteriori analisi come l'elaborazione istopatologica per rispondere a ulteriori domande sull'infiltrazione di cellule infiammatorie negli organi del topo infetti rispetto agli animali di controllo non infetti. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di evitare la perturbazione del cervello e di mantenere un contatto minimo tra le forbici e il tessuto cerebrale.

Research

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