Name: listeria monocytogenes infection of the brain
Uploaded: 2018-10-02T15:00:00
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Este trabalho foi apoiado pelo serviço de saúde pública dos EUA conceder AI103806 do National Institutes of Health.

Todos os animais estão a ser mantida e tratada com o máximo cuidado para minimizar o desconforto durante o curso do procedimento. O procedimento está a ser conduzida em conformidade com o cuidado de Animal institucional e Comissão de uso e todas as leis federais, estaduais e locais. Observe também que os experimentos de laboratório devem ser conduzidos de acordo com as diretrizes de biossegurança nível 2.
1. crescimento de L. monocytogenes para estudos de infecção de Mouse...

<ol>
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L. monocytogenes é capaz de causar meningoencefalite fatais em seres humanos. Estudos prévios têm demonstrado a capacidade das bactérias para atravessar a sangue-cérebro-barreira (BBB) e a colonizar o cérebro. Três rotas de invasão do cérebro têm sido propostas durante a infecção: direto a penetração do BBB por bactérias, stealth transporte por bactérias contidas dentro de células mononucleares3e migração axonal por cepas de L. monocytogenes que causam rhombenc...

A bactéria Gram-positiva Listeria monocytogenes é um patógeno intracelular facultativo e um dos maioria dos mortais comida patógenos em todo o mundo. Ingestão de alimentos de L. monocytogenes contaminado pode levar a listeriose em humanos, uma grave doença invasiva visando principalmente grávidas, os recém-nascidos, os indivíduos idosos e imunocomprometidos1. L. monocytogenes está entre as principais causas de morte por um patógeno de origem alimentar nos Estados Unidos e taxas de fatalidade casos de listeriose são tão elevadas como 20 a 30%, o mais elevado para todos os agentes patogénicos de origem alimentar2. Nenhuma vacina atualmente existe para L. monocytogenes e a capacidade das bactérias para efetivamente espalhou para o cérebro e órgãos distais por atravessar a barreira hemato - encefálica (BBB) pode levar a risco de vida meningite e colonização do cérebro3 , 4 , 5 , 6. meningite bacteriana é geralmente severa; enquanto a maioria das pessoas que recebem tratamento recuperam, infecções podem causar sérias complicações, por exemplo, danos cerebrais, perda de audição ou dificuldades de aprendizagem em crianças. L. monocytogenes é previsto compensar pelo menos 10% de toda a Comunidade adquiriu meningite no EUA7.
Uma importante rota para a disseminação bacteriana para o cérebro e as meninges é através da corrente sanguínea. Bactérias circulantes em vasos sanguíneos no cérebro são capazes de atravessar o BBB para causar infecção cerebral. O BBB é um sistema altamente vascularizado barreira que protege o cérebro de partículas estranhas que circulam no sangue. Células endoteliais constituem uma camada que reveste a superfície interior do vasos sanguíneos8,9. Além de L. monocytogenes, vários agentes patogénicos bacterianos como Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Escherichia colie Haemophilus influenzae tipo b (Hib) são capazes de colonizar o cérebro através do cruzamento do BBB3,4,5,6. No entanto, ao examinar a carga bacteriana no cérebro de ratos infectados, é importante determinar que se as bactérias cruzaram o BBB, caso contrário a carga bacteriana no cérebro pode representar as bactérias que são ainda nos vasos sanguíneos do cérebro. Assim, é necessário perfundir os ratos de todo o sangue antes da determinação de unidades formadoras de Colônia (UFC) dos homogenates do cérebro.
Neste estudo, descrevemos na vivo métodos para examinar a infecção de L. monocytogenes do cérebro. Para os métodos descritos aqui, usamos a L. monocytogenes estirpe 10403S. L. monocytogenes 10403S é uma das variedades de laboratório mais amplamente utilizado para estudar a listeriose sistêmica no modelo do rato de infecção10. Este protocolo é baseado em padrão injecção intravenosa de L. monocytogenes , seguido de perfusão dos ratos. Um esboço esquemático do protocolo de infecção em camundongos é mostrado na Figura 1. L. monocytogenes-cérebros infectados e outros órgãos de ratos perfundidos ou não perfundidos foram coletados e a carga bacteriana órgão determinado. Esses métodos são úteis para determinar não só a colonização bacteriana total do cérebro de animais infectados, mas também são benéficos para determinar se a bactéria ter penetrado o BBB na vivo para mediar a invasão do cérebro. É importante salientar que este protocolo do laboratório deve ser realizado após consulta com a gestão de instalações de biossegurança institucional relevante Comissão e animal.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:665px;" width="665">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Brain Heart Infusion media</td>
			<td style="width:119px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">237200</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptomycin sulfate&#160;</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0382-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:261px;">IKA T18 ULTRA-TURRAX Basic Homogenizer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3352109</td>
			<td>Model: T18BS1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectrophotometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>DU 800 series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BALB/c mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Model #000651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 mL syringes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">26-gauge needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">21-gauge butterfly needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Round-bottom test tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60819-546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel spatula</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel scissors (6.5 in)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel scissors (4.5 in)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel blunt forceps&#160; (4.5 in)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel fine tip forceps&#160; (6 in)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-406</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

listeria monocytogenes infection of the brain

Listeria monocytogenes é um patógeno bacteriano intracelular que está frequentemente associado com infecção de origem alimentar. A capacidade de L. monocytogenes de atravessar a barreira hemato - encefálica (BBB) é relativo, pode levar a risco de vida meningite e encefalite. O BBB protege o microambiente do cérebro de vários metabólitos tóxicos e patógenos microbianos no sangue após a infecção e, portanto, suporta a homeostase do cérebro. Os mecanismos pelos quais L. monocytogenes presente na corrente sanguínea cruzar o BBB para causar cérebro infecções não são totalmente compreendidas e há também a falta de um sistema de modelo robusto para estudar infecções cerebrais por L. monocytogenes. Aqui, apresentamos um modelo de infecção de mouse simples para determinar se as bactérias cruzaram o BBB e para dosar a carga de bactérias que colonizaram o cérebro em vivo. Neste método, os animais foram infectados por via intravenosa com L. monocytogenes em humanamente foram sacrificados por exposição ao CO2 , seguido por deslocamento cervical. Perfusão cardíaca dos animais foi realizada antes da colheita de órgãos infectados. Sangue foi coletado antes da perfusão e o número de bactérias por órgão ou mL de sangue foi determinada por chapeamento diluições do sangue ou órgão homogenates em placas de ágar e contando o número de colônias formadas. Esse método pode ser usado para estudar interações ligante-receptor romance que aumentam a infecção do cérebro por L. monocytogenes e podem ser facilmente adaptado para o estudo de vários patógenos bacterianos.

O cérebro é altamente vascularizado e L. monocytogenes é conhecido para infectar os tipos de células presentes no sangue3,13. O protocolo descrito é usado para demonstrar a capacidade de L. monocytogenes de atravessar a barreira hemato - encefálica (BBB) levando a infecção do cérebro de ratos. Para determinar se as bactérias cruzaram o BBB na vivo, perfusão de sangue no mouse é executada ante...

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Listeria monocytogenes Infection of the Brain

Listeria monocytogenes Infecção do cérebro

Durante a infecção, a Listeria monocytogenes é capaz de atravessar a barreira hemato - encefálica para colonizar o cérebro. Neste protocolo, demonstramos como avaliar a colonização bacteriana de órgãos após a infecção de camundongos. Está previsto um procedimento para executar a perfusão de órgão inteiro para determinação específica dos números bacterianas do parênquima cerebral.

Listeria monocytogenes is an intracellular bacterial pathogen that is frequently associated with food-borne infection. The ability of&#160;L. ...

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo de patogênese bacteriana sobre se as bactérias transmitidas pelo sangue podem atravessar a barreira hemencefálica para infectar o sistema nervoso central e o cérebro. Com essa técnica, os números bacterianos dentro do sangue e tecido cerebral de animais infectados podem ser determinados, excluindo o número de bactérias residentes dentro dos vasos sanguíneos do cérebro. Demonstrando o procedimento estará Pallab Ghosh, um pesquisador associado do meu laboratório.Às 72 horas após a infecção, defina um sistema automatizado de perfusão para uma taxa de fluxo de quatro mililitros de PBS suplementados com 10 mililitros de EDTA por minuto. E coloque o animal eutanizado na posição supina em uma panela de dissecção. Confirme a eutanásia por falta de resposta ao aperto de pata.E molhar o abdômen com 75% de etanol. Use uma tesoura para fazer uma incisão na parede abdominal logo abaixo da caixa torácica para expor o diafragma e órgãos viscerais. E corte o diafragma para abrir a cavidade torácica.Corte a gaiola de rublo bilateralmente para expor o ventrículo esquerdo e use fórceps para agarrar suavemente o coração. Insira uma agulha borboleta de 21 bitola conectada ao sistema de perfusão no ventrículo esquerdo e corte cuidadosamente o átrio direito para coletar cerca de 200 microliters de sangue em um tubo de dois mililitros contendo 10 mililitros EDTA para evitar a coagulação. Em seguida, perfunde o animal por quatro minutos com 15 a 20 mililitros de PBS mais EDTA.Após a perfusão completa, o cérebro e o fígado aparecerão branqueados garantindo que as bactérias remanescentes sejam dos órgãos colhidos e não do sangue circulante. Após a perfusão, transfira cuidadosamente os órgãos de interesse para tubos cônicos individuais de 15 mililitros contendo cinco mililitros de PBS estéreis de quatro graus Celsius por tubo. Para colher o cérebro após a decapitação, use uma tesoura para cortar a pele do couro cabeludo pela linha média entre os olhos, mantendo as pontas pressionadas contra o crânio para aparar qualquer excesso de tecido conforme necessário.Insira suavemente uma ponta da tesoura no foie magnum e corte lateralmente no crânio de ambos os lados. Corte cuidadosamente o crânio entre os olhos pela linha média do crânio, tomando o cuidado de aplicar pressão lateral e evitar perturbação do cérebro. Usando fórceps, abra o crânio para expor o cérebro e coloque uma espátula entre a parte inferior do cérebro e a base do crânio para transferir cuidadosamente o cérebro para um tubo de 15 mililitros contendo cinco mililitros de quatro graus Celsius PBS.Em um armário de biossegurança, insira a ponta e execute um homogeneizador de tecido por 10 segundos em alvejante sequencial de 5%, água estéril, 75% etanol e soluções de água estéril em tubos cônicos separados de 15 mililitros. Quando a ponta estiver completamente esterilizada, homogeneize o cérebro infectado em seu tubo. Quando não restam fragmentos de tecido visíveis, reesterirei a ponta para evitar a transferência bacteriana para a próxima amostra de órgão e homogeneizar o próximo órgão.Quando todos os órgãos tiverem sido homogeneizados, preparem diluições seriais de cada órgão homogeneizado em PBS estéril e emplaquem as diluições nas placas de ágar de infusão cérebro-coração. Em seguida, incubar as culturas de diluição homogeneate a 37 graus Celsius durante a noite e contar o número de colônias em cada placa para determinar o número total de bactérias por órgão ou mililitro de sangue. O cálculo das cargas bacterianas nos órgãos de camundongos infectados por L.monocytogenes como apenas demonstrado sugere que a perfusão pós-infecção não altera significativamente a carga bacteriana no sangue ou órgãos de camundongos infectados que foram examinados neste estudo representativo.Após este procedimento, os órgãos infectados por listeria monocytogenes podem ser processados para análises adicionais, como o processamento histopatológico, para responder a perguntas adicionais sobre a infiltração de células inflamatórias em órgãos de camundongos infectados em comparação com animais de controle não infectados. Ao tentar esse procedimento, é importante lembrar para evitar perturbação do cérebro e manter o mínimo contato entre a tesoura e o tecido cerebral.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Listeria monocytogenes Infection of the Brain

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

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Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Imunologia e Infecção

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

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Seleção de Plasmodium falciparum Parasitas para Cytoadhesion para células do cérebro humano endotelial

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolamento e Análise de Cérebro-sequestrados de Leucócitos<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA infectadas Mice

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

Transmissão Oral de<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Em camundongos através de ingestão de alimentos contaminados

L. monocytogenes are facultative intracellular bacterial pathogens that cause food borne infections in humans. Very little is known about the ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imagiologia inLC Secreção para investigar infecção celular pelo patógeno bacteriano<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

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Avaliação da invasão bacteriana de células cardíacas na cultura e colonização cardíaca em camundongos infectados usando listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

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A purificação a partir de ARN intracelularmente Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Em macrófagos

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

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Infecção experimental com<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Como um modelo para estudar o anfitrião Respostas interferão-y

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