Name: proteomic analysis of human macrophage polarization under a low oxygen environment
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment at JoVE.com

صباحا هو الممول من قبل "برنامج زعيم مجموعة الشباب" (ATIP/افينير Inserm-يزار)، بلوس أنجليس الرابطة الوطنية le مكافحة السرطان ولوس أنجليس "مؤسسة قوس" من أجل la بحوث sur le السرطان. ونحن نشكر مارييت ماتوندو من "قياس الطيف الكتلي" لمنهاج علم الأحياء (أوتيتشس مسبيو، ومعهد باستور، باريس). ونحن نشكر لورين أندرسون للقراءة لها من المخطوطة.

وتم الحصول على عينات الدم البشري (لرسك) من الجهات المانحة صحية، وإزالة الألغام التي تم تحديدها من EFS (خدمة الدم الوطنية الفرنسية) كجزء من وضع بروتوكول معتمد (DC كوديكوه-2018-3114). وقدم المانحون موافقة موقعة لاستخدام الدم.
1-وسائل الإعلام وإعداد المخزن المؤقت
<ol><li>إعداد متوسطة بلع?...

<ol>
	<li>Okabe, Y., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+biology+perspective+on+macrophages.">Tissue biology perspective on macrophages.</a> Nature Immunology. 17 (1), 9-17 (2016).</li><li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+plasticity+and+polarization:+in+vivo+veritas.">Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).</li><li>Murray, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+Polarization.">Macrophage Polarization.</a> Annual Review of Physiology. 79, 541-566 (2017).</li><li>Chinetti-Gbaguidi, G., Staels, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+polarization+in+metabolic+disorders:+functions+and+regulation.">Macrophage polarization in metabolic disorders: functions and regulation.</a> Current Opinion in Lipidology. 22 (5), 365-372 (2011).</li><li>Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+mononuclear+phagocyte+system+in+the+molecular+age.">Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).</li><li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation.">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).</li><li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets.">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).</li><li>Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+multidimensional+concept+of+macrophage+ontogeny,+activation+and+function.">New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function.</a> Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).</li><li>Xue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-based+network+analysis+reveals+a+spectrum+model+of+human+macrophage+activation.">Transcriptome-based network analysis reveals a spectrum model of human macrophage activation.</a> Immunity. 40 (2), 274-288 (2014).</li><li>Csete, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+in+the+cultivation+of+stem+cells.">Oxygen in the cultivation of stem cells.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1049, 1-8 (2005).</li><li>Johansson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional,+morphological,+and+phenotypical+differences+between+rat+alveolar+and+interstitial+macrophages.">Functional, morphological, and phenotypical differences between rat alveolar and interstitial macrophages.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 16 (5), 582-588 (1997).</li><li>Pfau, J. C., Schneider, J. C., Archer, A. J., Sentissi, J., Leyva, F. J., Cramton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+oxygen+tension+affects+phenotype+in+cultured+bone+marrow-derived+macrophages.">Environmental oxygen tension affects phenotype in cultured bone marrow-derived macrophages.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (2), L354-L362 (2004).</li><li>Grodzki, A. C. G., Giulivi, C., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+tension+modulates+differentiation+and+primary+macrophage+functions+in+the+human+monocytic+THP-1+cell+line.">Oxygen tension modulates differentiation and primary macrophage functions in the human monocytic THP-1 cell line.</a> PLoS One. 8 (1), e54926 (2013).</li><li>Court, M., Petre, G., Atifi, M. E., Millet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Signature+Reveals+Modulation+of+Human+Macrophage+Polarization+and+Functions+Under+Differing+Environmental+Oxygen+Conditions.">Proteomic Signature Reveals Modulation of Human Macrophage Polarization and Functions Under Differing Environmental Oxygen Conditions.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 16 (12), 2153-2168 (2017).</li><li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+proteome-wide+label-free+quantification+by+delayed+normalization+and+maximal+peptide+ratio+extraction,+termed+MaxLFQ.">Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).</li><li>Cox, J., Neuhauser, N., Michalski, A., Scheltema, R. A., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Andromeda:+a+peptide+search+engine+integrated+into+the+MaxQuant+environment.">Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment.</a> Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).</li><li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes.">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li><li>Court, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+standardized+urine+proteome+analysis+methodology.">Toward a standardized urine proteome analysis methodology.</a> Proteomics. 11 (6), 1160-1171 (2011).</li><li>Wi&#347;niewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).</li><li>Liebler, D. C., Ham, A. -. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spin+filter-based+sample+preparation+for+shotgun+proteomics.">Spin filter-based sample preparation for shotgun proteomics.</a> Nature Methods. 6 (11), 785-786 (2009).</li><li>Hubner, N. C., Ren, S., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+separation+with+immobilized+pI+strips+is+an+attractive+alternative+to+in-gel+protein+digestion+for+proteome+analysis.">Peptide separation with immobilized pI strips is an attractive alternative to in-gel protein digestion for proteome analysis.</a> Proteomics. 8 (23-24), 4862-4872 (2008).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Informed-Proteomics:+open-source+software+package+for+top-down+proteomics.">Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics.</a> Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).</li><li>Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+oxygen+and+culture+media+on+plating+efficiency+of+some+mammalian+tissue+cells.">Influence of oxygen and culture media on plating efficiency of some mammalian tissue cells.</a> Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).</li><li>Packer, L., Fuehr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+oxygen+concentration+extends+the+lifespan+of+cultured+human+diploid+cells.">Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells.</a> Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).</li><li>Lengner, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+pre-X+inactivation+human+embryonic+stem+cells+under+physiological+oxygen+concentrations.">Derivation of pre-X inactivation human embryonic stem cells under physiological oxygen concentrations.</a> Cell. 141 (5), 872-883 (2010).</li><li>Sidoli, S., Kulej, K., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+proteomics+is+not+the+new+genomics+and+the+future+of+mass+spectrometry+in+cell+biology.">Why proteomics is not the new genomics and the future of mass spectrometry in cell biology.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 21-24 (2017).</li></ol>

لأن البروتيوميات أداة قوية لدراسة التعبير عن البروتينات المختلفة من خلية كاملة أو مقصورات سوبسيلولار، الأمثل للبروتوكول تحلل الخلية وهضم البروتينات قد عولجت بعدد من الدراسات. وهناك ثلاث فئات رئيسية من الأساليب، التي تشمل في جل الهضم (هضم البروتينات في مصفوفة جل polyacrylamide)17، ا...

الضامة هي الخلايا المناعية الفطرية تشارك في عدد من الوظائف الفسيولوجية التي تتراوح من الردود على مسببات الأمراض المعدية إلى التوازن الأنسجة، بما في ذلك إزالة الخلايا أبوبتوتيك وتجديد المصفوفة خارج الخلية1. تتميز هذه الخلايا اللدونة المظهرية قوية2 أن يترجم إلى إمكانية تنشيط العديد من دول، التي تسمى أيضا الاستقطابات. الوصف الجزيئي الدقيق لهذه الاستقطابات المختلفة أولويات في مجال علم الأحياء بلعم3. اقترح تصنيف هذه الاستقطابات استخدام ما يسمى الانقسام M1/M2، الذي يمثل M1 برو التحريضية و M2 يمثل الضامة للالتهابات. يناسب هذا النموذج جيدا في مختلف الحالات المرضية مثل الالتهابات الحادة والحساسية والسمنة4. ومع ذلك، في الأنسجة الملتهبة المزمن والسرطان، وقد ثبت أن هذا التصنيف غير قادر على فهم مرجع المظهرية الواسعة التي الضامة الموجودة في بعض البيئات الخلوية5،6، 7-توافق الآراء الحالي أن بلعم الاستقطاب أفضل وصف باستخدام نموذج متعدد الأبعاد لدمج إشارات محددة ميكرونفيرونمينتال8. وقد أكد هذا الاستنتاج من خلال تحليل ترانسكريبتوميك الضامة البشرية تبين أن طراز M1/M2 غير فعال في وصف الاستقطابات حصل على9.
قدمت الدراسة يهدف إلى توفير بروتوكول للحصول على توقيعات البروتين من استقطابات مختلفة في الضامة البشرية. ونحن تصف كيفية التفريق الضامة البشرية في بيئات لمختلف مستويات الأوكسجين والحصول على الببتيدات من البروتين بلعم كاملة القيام بإجراء تقييم كمي خالية من التسمية. ويسمح هذا التحديد الكمي مقارنة مستويات التعبير من البروتينات المختلفة. كما كشفت الأبحاث حول الخلايا الجذعية أهمية الأوكسجين معلمة رئيسية بيئية10، نحن نسعى إلى فهم كيف يمكن أن تؤثر هذه المعلمة الأنسجة بلعم الاستقطاب في البشر. الضغط الجزئي للأكسجين قد وجد أن تتراوح من 3 إلى 20% (من مجموع الضغط الجوي) في جسم الإنسان، حيث يقابل 20% تقريبا لما يستخدم عادة في حاضنة ثقافة خلية (القيمة الصحيحة هي حوالي 18.6 في المائة مع مراعاة وجود الماء في الاعتبار).
وقد أظهرت الأعمال السابقة أن السنخية تختلف عن الضامة فراغي من الوظيفية والمورفولوجية نقطة المشاهدات11 وأن هذه الاختلافات على الأرجح جزئيا نظراً لمستويات مختلفة من الأكسجين التي هي عرضه12. وعلاوة على ذلك، تظهر المشتقة من نخاع العظم الضامة زيادة قدرة على فاجوسيتيزي البكتيريا عند تعرضها ل بيئة منخفضة أكسجين12. تم العثور على تأثير معاكس الضامة البشرية المتباينة THP113، ولكن هذه النتائج تدعم الفكرة القائلة بأن الأكسجين منظم للبيولوجيا بلعم وأن من الضروري توضيح هذا الدور على المستوى الجزيئي في الضامة البشرية. وفي دراسة سابقة، المطبقة لدينا نهج البروتيوميات لمعالجة هذه القضايا. عن طريق قياس مستويات التعبير لآلاف بروتينات في نفس الوقت، سلطت الضوء على تأثير الأكسجين على الاستقطاب، وقدمت قائمة بالمؤشرات الجزيئية الجديدة. تمكنا أيضا من ربط هذه النتائج ببعض وظائف الضامة. جدير بالذكر أن وجدنا أن معدل البلعمه لخلايا apoptotic قد زيدت في الضامة IL4/IL13-الاستقطاب، التي ترتبط ب upregulation ALOX15 كما يتبين من تحليل البروتين14. في هذه الدراسة، ونحن تصف كيفية إجراء هذا تحليل.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hypoxia Working Station</td>
			<td>Oxford Optronix</td>
			<td>Hypoxylab</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C6 Flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>Accuri C6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5188-6435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (FA)</td>
			<td>ARISTAR</td>
			<td>450122M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-250 Coomassie blue</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1,610,436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide, E.Coli (LPS)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>437627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2D clean-up kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>80-6484-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium, glutamax supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1 M</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) Solution 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harvard Apparatus column Reverse C18 micro spin column</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>74-4601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5 M, pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Bis-Tris 4-12%</td>
			<td>Life Technologies SAS</td>
			<td>NP0321 BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 Microbeads human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS separation column LS</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 4 (IL4)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 13 (IL13)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-112-410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interferon gamma (INF&#947;)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14-FITC (clone T&#220;K4)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-080-701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSmix Tube Rotator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic Acid (TFA)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>28904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/Lys-C Mix</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>V5073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Mini, EDTA-free Protease Inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density Gradient Solution (Histopaque 1077)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10771-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accumax</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7089-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum from human male AB plasma (SAB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4522-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) solution 30%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9576-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisma-base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>49767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>114405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 20%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>57670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiourea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C9426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL sterile plastic pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer C Eppendorf</td>
			<td>VWR</td>
			<td>460-0223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak tC18 reverse phase cartridges, 100 mg</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT036820</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proteomic analysis of human macrophage polarization under a low oxygen environment

الضامة هي الخلايا المناعية الفطرية تشارك في عدد من الوظائف الفسيولوجية التي تتراوح من الردود على مسببات الأمراض المعدية إلى التوازن الأنسجة. وظائف مختلفة من هذه الخلايا تتصل بدولهم التنشيط، الذي يسمى أيضا الاستقطاب. الوصف الجزيئي الدقيق لهذه الاستقطابات المختلفة أولويات في مجال البيولوجيا بلعم. من المسلم به حاليا أن اتباع نهج متعدد الأبعاد ضروري لوصف كيفية التحكم في استقطاب الإشارات البيئية. وفي هذا التقرير، يصف لنا بروتوكول مصمم للحصول على توقيع البروتين استقطابات مختلفة في الضامة البشرية. ويستند هذا البروتوكول إجراء تقييم كمي للتعبير البروتين بلعم الحصول عليها من مجزأ بهلام ومحتوى تحلل الخلوية Lys ج/التربسين-يهضم خالية من التسمية. نحن نقدم أيضا بروتوكول استناداً إلى الهضم بالحل و isoelectric تركز تجزئة لاستخدامه كبديل لذلك. نظراً لأن تركيز الأكسجين معلمة بيئية ذات صلة في الأنسجة، يمكننا استخدام هذا البروتوكول لاستكشاف تركيبة الغلاف الجوي كيف أو بيئة منخفضة أكسجين يؤثر على تصنيف بلعم الاستقطاب.

بدءاً من خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى (ببمكس) التي تم الحصول عليها باستخدام الطرد المركزي التفاضلي، يسمح البروتوكول الحصول على عدد سكانها CD14+ وحيدات مع نقاء المقررة أكثر من 98 في المائة من التدفق الخلوي (الشكل 1). هذه وحيدات تختلف بشكل ثانوي نحو اس...

Watch this Scientific Journal Video about Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment at JoVE.com

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

نقدم بروتوكول للحصول على توقيعات البروتين الضامة البشرية وتطبيق هذا على تحديد أثر بيئة منخفضة الأكسجين في الاستقطاب بلعم.

تحليل البروتين الاستقطاب بلعم البشرية تحت بيئة منخفضة الأكسجين

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

لذلك يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأحياء الضامة ، مثل كيفية توصيف حالة التنشيط في ظل بيئة مختلفة على مستوى البروتين. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر الفرصة للحصول على تعبير مختلف عن العديد من البروتينات في الضامة البشرية باستخدام طريقة القياس الكمي الخالية من التسميات. إثبات الإجراء سيكون ماري مالير وماغالي كورت من مختبري.للبدء، إضافة 15 ملليلتر من كثافة حل فصل الخلية التدرج في كل من اثنين من أنابيب الطرد المركزي 50 ملليلتر بحيث يمكن أن الحارة الحل إلى درجة حرارة الغرفة قبل تلقي LRSC. وهذا أمر ضروري حيث تعتمد الكثافة على درجة الحرارة. إفراغ LRSC في أنبوب الطرد المركزي 50 ملليلتر.إضافة 1x برنامج تلفزيوني يصل إلى 50 ملليلتر ومزيج. ثم، ببطء شديد، إضافة 25 ملليلتر من المزيج على رأس 15 ملليلتر من حل التدرج الكثافة التوازنية. يجب الحرص على عدم خلط المراحل خلال هذه الخطوة.يجب إضافة الدم على حل التدرج الكثافة دون أي إزعاج لهذه المرحلة. جهاز طرد مركزي كلا أنابيب الطرد المركزي لمدة 25 دقيقة في 700 G دون فواصل. في نهاية الكثافة الانحدار الطرد المركزي، والطبقات من أسفل إلى أعلى هي كريات الدم الحمراء والميقبتات، وتشكيل بيليه، ومرحلة حل التدرج الكثافة، وطبقة PBMCs، والبلازما المخففة.مع ماصة، تمر من خلال مرحلة البلازما دون التعرق عليه. ثم، وجمع طبقة PBMC في أنبوب جديد 50 ملليلتر الطرد المركزي. إضافة ما يصل إلى 50 ملليلتر من 1X PBS إلى PBMCs كإعداد الغسيل والطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 300 G.Aspirate اكبر و إعادة تعليق بيليه في 40 ملليلتر من وسط الضامة.بعد صياغة PBMCs في غرفة Malassez ، قم بنقل كمية PBMCs اللازمة لإجراء التجربة إلى أنبوب الطرد المركزي. الطرد المركزي الخلايا لمدة 10 دقائق في 300 G.Aspirate اشغال واعادة تعليق بيليه في 80 ميكروليتر من التخزين المؤقت الفرز لكل 10 مليون PBMCs. ثم أضف 20 ميكروليتر من ميكروبات CD14 لكل 10 ملايين PBMCs.اخلطي جيدا، وحضني لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية تحت الانفعالات المستمرة. بعد الحضانة، إضافة ملليلتر واحد من التخزين المؤقت للفرز لكل 10 ملايين PBMCs كخطوة الغسيل، والطرد المركزي كما كان من قبل. ثم ، الطامح من كبرى وإعادة تعليق بيليه في 500 ميكرولتردات من التخزين المؤقت للفرز لكل 100 مليون PBMCs.الآن، ضع عمود في المجال المغناطيسي للفاصل. تحضير العمود عن طريق شطفه مع ثلاثة ملليلترات من مخزن الفرز المؤقت. تطبيق تعليق الخلية على العمود.ثم جمع تدفق من خلال احتواء الخلايا غير المُطلق عليها لتلوين اللاحقة، إذا لزم الأمر. اغسل العمود ثلاث مرات بثلاثة ملليلترات من مخزن الفرز المؤقت. يجب الحرص على عدم تجفيف العمود الخاص بك.ثم ضع أنبوب تجميع تحت العمود ثم إزالته من الفاصل. بعد الغسيل، الماصات خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت للفرز في العمود. طرد فورا من الخلايا المغناطيسي المسمى عن طريق دفع بقوة المكبس في العمود.وأخيراً، كرر هذه الخطوات مع عمود جديد قبل طلاء أحادية و تنفيذ استقطاب الضامة كما هو موضح في بروتوكول النص. الحفاظ على أحادية و الضامة في بيئة تسيطر عليها الأكسجين لإجراء تحليل حالة نقص الأكسجة. استخدام محطة عمل نقص الأكسجة من أجل الحفاظ على الخلايا تحت ضغط الأكسجين الجزئي المطلوب أثناء التجربة.عند العمل تحت ضغط الأكسجين المنخفض، من المهم إعداد جميع وسائل الإعلام والغسيل العازلة تحت المحطة، والانتظار بما فيه الكفاية للحصول على الضغط الجزئي الصحيح في السائل. تنفيذ تحلل الخلايا في مخزن مؤقت تحت غطاء محرك السيارة المتكيف. تحميل ما يعادل البروتين من 300، 000 خلية لكل عينة على 4-12٪ الكرييلاميد الهلاميد التككرميد.التحكم في مدة الهجرة الكهربائية للسماح لكل عينة بروتين لتقسيم إلى ستة شرائط هلام كما هو مبين هنا. بعد تحديد وتلطيخ كما هو موضح في بروتوكول النص، ازيلوا من نطاقات البروتين بمشرط نظيف. النرد كل الفرقة استئصال قبل وضعها في 500 أنابيب ميكروليتر.الآن، غسل شرائح هلام ثلاث مرات في 200 ميكرولتر من 25 ميليمولاري بيكربونات لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية، والتخلص من بيكربونات الأمونيوم بين كل خطوة. اتبع هذا مع غسل واحد في 25 ميليمولار بيكربونات و acetonitrile. ثم، وتجفيف القطع هلام مع 200 ميكرولترات من 100٪ الأسيتونيتريل لمدة 10 دقائق.احتضان كل قطعة هلام مع 10 ملليمولار DTT و 25 ميليمولار بيكربونات الاميونيوم لمدة 45 دقيقة في 56 درجة مئوية. ثم، والتخلص من DTT واحتضان قطعة هلام مع 55 ملليمولار iodoacetamide في bicarbonate الأمونيوم 25 ملليمتر لمدة 35 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة. لوقف الألكيليشن، والتخلص من الحل المستخدم واحتضان كل قطعة هلام مع 200 ميكرولتر من 10 ملليمتر DTT في 25 ميليمولاري الميكرومونيوم bicarbonate لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.غسل القطع هلام في 200 ميكرولترات من بيكربونات الميكرومونيوم 25 ملليمتر. ثم, الجفاف مع 200 ميكرولترات من 100٪ الأسيتونتريل لمدة 10 دقائق. استوعب البروتينات بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع تريبسين/ليس-سي ميكس وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.استخراج الببتيدات الناتجة من قطع هلام بإضافة 50 ميكرولترات من 50٪ الأسيتونتريل لمدة 15 دقيقة في أنابيب منخفضة الامتصاص. بعد إضافة 50 ميكرولترات من حمض 5٪ من ففورميك لمدة 15 دقيقة، إضافة 50 ميكرولترات من 100٪ الأسيتونتريل لمدة 15 دقيقة. سحب وتجفيف كل جزء في أنابيب منخفضة الامتصاص للحد من امتصاص الببتيدات وفقدان العينة.تخزين العينات في 80 درجة مئوية حتى مزيد من التحليل كما هو مفصل في بروتوكول النص. يظهر هنا هو النقاء ممثل تقييمها من قبل تدفق الخلايا بعد اختيار الخرز المغناطيسي من أحادية CD14 إيجابية. تظهر صور الطور التباين للضامة البشرية المتباينة عدم تجانس المورفولوجيا التي تم الحصول عليها لاثنين من الاستقطابات المختلفة بعد تسعة أيام من الثقافة.مثال على الهضم خارج هلام باستخدام الفضة ملطخة SDS صفحة المواد الهلامية. تقييم البروتين من تحلل الخلايا وبعد الهضم في حل يظهر عدم وجود تدهور أثناء التحلل وكفاءة الهضم. يظهر هنا مثال على طيف تفكك الناجم عن الاصطدام من الببتيد وجدت في نسبة الشامل إلى تهمة من 597.29 على الطيف MS مع شحنة كهربائية من اثنين إيجابي.ومن هذا الطيف، تم تحديد التسلسل المقابل. والنتيجة النهائية بعد التحليل هي خريطة حرارية تمثل التجميع الهرمي لجميع حالات الاستقطاب باستخدام البروتينات المعبّر عنها بشكل تفاضلي. تحليل يكشف عن مجموعة من البروتينات الإفراط في التعبير عنها في جميع الاستقطابات في حالة الأكسجين 3٪.أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن عليك أن تقرر أولاً أي نوع من الكسر سوف تؤدي على عينات جديدة لتكييف بروتوكول الخاص وفقا لذلك. إن النهج البروتومي الذي يستخدم هذا العمل مكمل للنهج الجينومية التي استخدمت خلال السنوات الأخيرة في مجال دراسات الاستقطاب البيولوجية الضامة. بعد تطورها ، تمهد هذه التقنية الطريق للباحث في مجال علم المناعة لاستكشاف الحالات المختلفة لتنشيط الخلايا المناعية في البشر وكذلك في الثدييات الأخرى.لا ننسى أن العمل مع DTT يمكن أن تكون خطرة لذلك تحتاج إلى العمل تحت غطاء محرك السيارة تكييفها للقيام بهذا الإجراء.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

حل تقارب تنقية البروتين المجمعات التي كتبها Blue الأصلية PAGE والبروتين الارتباط التنميط

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

تشريح RPE-المشيمية والشبكية البشرية لتحليل البروتين

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

سبليت-بيويد-تحليل البروتين مجمعات البروتين محددة السياق في بيئتها الخلوية الأصلية

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

أخذ العينات والمعالجة المسبقة لميناء الأسنان كربونات الكربون مستقرة وتحليل نظائر الأكسجين

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

دينامية البروتين وميرنا "تحليل بوليسوميس" من "قلب الفأرة متفرقة بعد نضح لانجيندورف"

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

خالية من المعايرة في المختبر الكمي للبروتين هومو-أوليجوميريزيشن باستخدام الأجهزة التجارية والحرة والمفتوحة المصدر برمجيات التحليل السطوع

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

تنقية البروتين اللاهوائية وتحليل الحركية عبر مسرى الأوكسجين لدراسة النشاط ديوكسيجيناسي دسب وتثبيط

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

قياس وتفسير معدلات استهلاك الأوكسجين كلياً يطير رئيس قطاعات

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

دراسة عن الأيض من المبيدات الحشرية النظامية الستة في ثقافة تعليق الخلية المنشأة حديثا المستمدة من الشاي(كاميليا سينينسيس L.) يترك

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...