Name: proteomic analysis of human macrophage polarization under a low oxygen environment
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment at JoVE.com

AM er finansieret af den unge gruppe Leader Program (ATIP/Avenir Inserm-CNRS), af la Ligue Nationale contre le Cancer og la Fondation ARC pour la recherche sur le kræft. Vi takker Mariette Matondo fra massespektrometri for biologi platform (UTECHS MSBIO, Institut Pasteur, Paris). Vi takker Lauren Anderson for hendes læsning af manuskriptet.

Menneskelige blodprøver (LRSC) fra sunde, de identificerede donorer blev indhentet fra EFS (franske nationale blod Service) som en del af en autoriseret protokol (CODECOH DC-2018-3114). Donorer gav underskrevet samtykke til brug af blod.
1. medier og Buffer forberedelse
<ol><li>Forberede makrofag medium [RPMI glutamax + 10 mM HEPES + 1 x ikke-essentielle aminosyrer (NEAA)] og varm det til 37 ° C.</li>
	<li>Forberede makrofag medium + 10% humant serum fra AB plasma (SAB), filtrere det (0,22...

<ol>
	<li>Okabe, Y., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+biology+perspective+on+macrophages.">Tissue biology perspective on macrophages.</a> Nature Immunology. 17 (1), 9-17 (2016).</li><li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+plasticity+and+polarization:+in+vivo+veritas.">Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).</li><li>Murray, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+Polarization.">Macrophage Polarization.</a> Annual Review of Physiology. 79, 541-566 (2017).</li><li>Chinetti-Gbaguidi, G., Staels, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+polarization+in+metabolic+disorders:+functions+and+regulation.">Macrophage polarization in metabolic disorders: functions and regulation.</a> Current Opinion in Lipidology. 22 (5), 365-372 (2011).</li><li>Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+mononuclear+phagocyte+system+in+the+molecular+age.">Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).</li><li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation.">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).</li><li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets.">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).</li><li>Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+multidimensional+concept+of+macrophage+ontogeny,+activation+and+function.">New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function.</a> Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).</li><li>Xue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-based+network+analysis+reveals+a+spectrum+model+of+human+macrophage+activation.">Transcriptome-based network analysis reveals a spectrum model of human macrophage activation.</a> Immunity. 40 (2), 274-288 (2014).</li><li>Csete, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+in+the+cultivation+of+stem+cells.">Oxygen in the cultivation of stem cells.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1049, 1-8 (2005).</li><li>Johansson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional,+morphological,+and+phenotypical+differences+between+rat+alveolar+and+interstitial+macrophages.">Functional, morphological, and phenotypical differences between rat alveolar and interstitial macrophages.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 16 (5), 582-588 (1997).</li><li>Pfau, J. C., Schneider, J. C., Archer, A. J., Sentissi, J., Leyva, F. J., Cramton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+oxygen+tension+affects+phenotype+in+cultured+bone+marrow-derived+macrophages.">Environmental oxygen tension affects phenotype in cultured bone marrow-derived macrophages.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (2), L354-L362 (2004).</li><li>Grodzki, A. C. G., Giulivi, C., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+tension+modulates+differentiation+and+primary+macrophage+functions+in+the+human+monocytic+THP-1+cell+line.">Oxygen tension modulates differentiation and primary macrophage functions in the human monocytic THP-1 cell line.</a> PLoS One. 8 (1), e54926 (2013).</li><li>Court, M., Petre, G., Atifi, M. E., Millet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Signature+Reveals+Modulation+of+Human+Macrophage+Polarization+and+Functions+Under+Differing+Environmental+Oxygen+Conditions.">Proteomic Signature Reveals Modulation of Human Macrophage Polarization and Functions Under Differing Environmental Oxygen Conditions.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 16 (12), 2153-2168 (2017).</li><li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+proteome-wide+label-free+quantification+by+delayed+normalization+and+maximal+peptide+ratio+extraction,+termed+MaxLFQ.">Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).</li><li>Cox, J., Neuhauser, N., Michalski, A., Scheltema, R. A., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Andromeda:+a+peptide+search+engine+integrated+into+the+MaxQuant+environment.">Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment.</a> Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).</li><li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes.">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li><li>Court, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+standardized+urine+proteome+analysis+methodology.">Toward a standardized urine proteome analysis methodology.</a> Proteomics. 11 (6), 1160-1171 (2011).</li><li>Wi&#347;niewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).</li><li>Liebler, D. C., Ham, A. -. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spin+filter-based+sample+preparation+for+shotgun+proteomics.">Spin filter-based sample preparation for shotgun proteomics.</a> Nature Methods. 6 (11), 785-786 (2009).</li><li>Hubner, N. C., Ren, S., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+separation+with+immobilized+pI+strips+is+an+attractive+alternative+to+in-gel+protein+digestion+for+proteome+analysis.">Peptide separation with immobilized pI strips is an attractive alternative to in-gel protein digestion for proteome analysis.</a> Proteomics. 8 (23-24), 4862-4872 (2008).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Informed-Proteomics:+open-source+software+package+for+top-down+proteomics.">Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics.</a> Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).</li><li>Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+oxygen+and+culture+media+on+plating+efficiency+of+some+mammalian+tissue+cells.">Influence of oxygen and culture media on plating efficiency of some mammalian tissue cells.</a> Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).</li><li>Packer, L., Fuehr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+oxygen+concentration+extends+the+lifespan+of+cultured+human+diploid+cells.">Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells.</a> Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).</li><li>Lengner, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+pre-X+inactivation+human+embryonic+stem+cells+under+physiological+oxygen+concentrations.">Derivation of pre-X inactivation human embryonic stem cells under physiological oxygen concentrations.</a> Cell. 141 (5), 872-883 (2010).</li><li>Sidoli, S., Kulej, K., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+proteomics+is+not+the+new+genomics+and+the+future+of+mass+spectrometry+in+cell+biology.">Why proteomics is not the new genomics and the future of mass spectrometry in cell biology.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 21-24 (2017).</li></ol>

Fordi proteomics er et kraftfuldt værktøj til at studere udtryk for forskellige proteiner fra en hel celle eller subcellulært segmenter, er optimering af celle lysis protokol og fordøjelse af proteiner blevet behandlet af en række undersøgelser. Der er tre vigtigste klasser af metoder, som omfatter i-gel fordøjelsen (fordøjelsen af proteiner i polyacrylamid gel matrix)17, fordøjelsen i løsning18 og filter-støttede prøve forberedelse19. De...

Makrofager er medfødte immun celler involveret i en række fysiologiske funktioner lige fra svar til smittefarlige patogener til væv homøostase, herunder fjernelse af apoptotiske celler og ombygning af ekstracellulære matrix1. Disse celler er karakteriseret ved en stærk fænotypisk plasticitet2 , der giver sig udslag i en mange mulige aktivering stater, der også kaldes polarisationer. Den præcise molekylære beskrivelse af disse forskellige polariseringer er en prioritet inden for makrofag biologi3. Det har været foreslået at klassificere disse polariseringer, ved hjælp af den såkaldte M1/M2 dikotomi, hvor M1 repræsenterer pro-inflammatoriske og M2 repræsenterer anti-inflammatoriske makrofager. Denne model passer godt i forskellige patologiske situationer som akutte infektioner, allergi og fedme4. Men i kronisk betændte væv og kræft, det er blevet påvist, denne klassificering er i stand til at forstå de brede fænotypiske repertoire, der makrofager til stede i visse cellulære miljøer5,6, 7. den nuværende konsensus er at makrofag polarisering bedre er beskrevet ved hjælp af en multidimensional model for at integrere specifikke microenvironmental signaler8. Denne konklusion er blevet bekræftet gennem transkriptom analyse af menneskers makrofager viser, at modellen M1/M2 er ineffektive i beskrivelsen af de fremkomne polariseringer9.
Undersøgelsen præsenteret sigter på at give en protokol for at opnå proteom underskrifter fra forskellige polariseringer i menneskelige makrofager. Vi beskriver, hvordan du skelne menneskelige makrofager i miljøer forskellige ilt niveauer og få peptider fra hele makrofag proteomet til at udføre en etiket-fri kvantificering. Denne kvantificering tillader sammenligning af udtryk niveauer af forskellige proteiner. Som forskning i stamceller har afsløret betydningen af ilt som en miljømæssig vigtigste parameter10, søger vi at forstå, hvordan dette væv parameter kan påvirke makrofag polarisering i mennesker. Partialtrykket af ilt er blevet fundet at vifte fra 3 til 20% (af samlede atmosfæretryk) i den menneskelige krop, hvor 20% svarer nogenlunde til hvad er almindeligt anvendt i en celle kultur inkubator (den nøjagtige værdi er omkring 18,6% mens du nyder tilstedeværelsen af vand i betragtning).
Tidligere arbejde har vist, at alveolaris afviger fra interstitiel makrofager fra funktionelle og morfologiske punkt udsigt11 , og at disse forskelle er formentlig delvis på grund af de forskellige ilt niveauer, de er udsatte12. Desuden viser knoglemarv-afledte makrofager en øget evne til at phagocytize bakterier, når de udsættes for en lav ilt miljø12. Den modsatte effekt er blevet fundet for THP1-opdelte menneskelige makrofager13, men disse resultater støtter tanken om, at ilt er en regulator af makrofag biologi og at det er nødvendigt at tydeliggøre denne rolle på det molekylære niveau i menneskelige makrofager. I en tidligere undersøgelse, har vi anvendt en proteomics tilgang for at løse disse problemer. Ved at måle udtryk niveauer for tusindvis af proteiner samtidig, vi fremhævet virkningen af ilt på polarisering og forelagt en liste over nye molekylære markører. Vi var også i stand til at relatere disse resultater til nogle makrofager funktioner. Vi fandt navnlig, at satsen for fagocytose af apoptotiske celler var steget i IL4/IL13-polariseret makrofager, som var knyttet til opregulering af ALOX15, som det fremgår af proteom analyse14. I den foreliggende undersøgelse beskriver vi, hvordan til at udføre en sådan analyse.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hypoxia Working Station</td>
			<td>Oxford Optronix</td>
			<td>Hypoxylab</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C6 Flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>Accuri C6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5188-6435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (FA)</td>
			<td>ARISTAR</td>
			<td>450122M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-250 Coomassie blue</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1,610,436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide, E.Coli (LPS)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>437627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2D clean-up kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>80-6484-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium, glutamax supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1 M</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) Solution 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harvard Apparatus column Reverse C18 micro spin column</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>74-4601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5 M, pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Bis-Tris 4-12%</td>
			<td>Life Technologies SAS</td>
			<td>NP0321 BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 Microbeads human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS separation column LS</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 4 (IL4)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 13 (IL13)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-112-410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interferon gamma (INF&#947;)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14-FITC (clone T&#220;K4)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-080-701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSmix Tube Rotator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic Acid (TFA)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>28904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/Lys-C Mix</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>V5073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Mini, EDTA-free Protease Inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density Gradient Solution (Histopaque 1077)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10771-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accumax</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7089-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum from human male AB plasma (SAB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4522-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) solution 30%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9576-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisma-base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>49767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>114405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 20%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>57670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiourea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C9426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL sterile plastic pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer C Eppendorf</td>
			<td>VWR</td>
			<td>460-0223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak tC18 reverse phase cartridges, 100 mg</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT036820</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proteomic analysis of human macrophage polarization under a low oxygen environment

Makrofager er medfødte immun celler involveret i en række fysiologiske funktioner lige fra svar til smittefarlige patogener til væv homøostase. De forskellige funktioner i disse celler er relateret til deres aktivering stater, som også kaldes polarisering. Den præcise molekylære beskrivelse af disse forskellige polariseringer er en prioritet inden for makrofag biologi. Det er i øjeblikket erkendt, at en flerdimensional tilgang er nødvendig for at beskrive, hvordan polarisering er kontrolleret af miljømæssige signaler. I denne rapport beskriver vi en protokol, der er designet til at opnå forskellige polariseringer i menneskelige makrofager proteom underskrift. Denne protokol er baseret på en label-fri kvantificering af makrofag protein udtryk fra in-gel fraktioneret og Lys C/trypsin-fordøjet cellulære lysis indhold. Vi tilbyder også en protokol baseret på-løsning fordøjelse og isoelektrisk fokusering fraktionering at bruge som et alternativ. Fordi iltkoncentrationen er relevante miljømæssige parameter i væv, vi bruge denne protokol til at udforske hvordan atmosfærens sammensætning eller en lav ilt miljø påvirker tariferingen af makrofag polarisering.

Startende fra perifert blod mononukleære celler (PBMC) fremstillet ved differentieret centrifugering, protokollen tillader opnåelse af en population af CD14+ monocytter med en vurderet renhed af mere end 98% ved flowcytometri (figur 1). Disse monocytter er sekundært differentieret mod forskellige polariseringer (figur 2). Når en fraktionering på gel er valgt, migration på SDS-page geler er tilpasset til at få an...

Watch this Scientific Journal Video about Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment at JoVE.com

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Vi præsenterer en protokol for at opnå proteom signaturer af menneskelige makrofager og anvende dette til bestemmelse af virkningerne af en lav ilt miljø på makrofag polarisering.

Proteom-analyse af menneskers makrofag polarisering Under en lav ilt miljø

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Så denne metode kan bidrage til at besvare centrale spørgsmål i makrofag biologi område, såsom hvordan man karakteriserer tilstanden af aktivering under forskellige miljø på proteinniveau. Den største fordel ved denne teknik er, at den giver mulighed for at opnå forskellige udtryk for mange proteiner i menneskelige makrofager ved hjælp af etiketfri kvantificeringsmetode. At demonstrere proceduren vil være Marie Malier og Magali Court fra mit laboratorium.Til at begynde, tilsættes 15 milliliter af densitet gradient celle adskillelse løsning i hver af to 50 milliliter centrifugering rør, således at opløsningen kan varme til stuetemperatur, før du modtager LRSC. Dette er vigtigt, da tætheden afhænger af temperaturen. LRSC tømmes til et centrifugeringsrør på 50 milliliter.Tilsæt 1x PBS op til 50 milliliter og bland. Derefter, meget langsomt, tilsættes 25 milliliter af blandingen på toppen af 15 milliliter ækvibreringstæthed gradient opløsning. Pas på ikke at blande faserne under dette trin.Blodet skal tilsættes på densitetsgradientopløsningen uden forstyrrelser i denne fase. Centrifuge begge centrifugeringsrør i 25 minutter ved 700 G uden pauser. Ved afslutningen af densitetsgradientcentrifugering er lagene fra bund til top er erythrocytter og granulocytter, der danner pellet, densitetsgradientopløsningsfasen, et lag PBM'er og det fortyndede plasma.Med en pipette, passere gennem plasma fase uden at aspirere det. Derefter indsamles PBMC-laget i et nyt 50 milliliter centrifugeringsrør. Der tilsættes op til 50 milliliter 1x PBS til PBM'erne som vaskeopsætning og centrifuge i 10 minutter ved 300 G.Aspirate supernatanten, og pelleten skal suspenderes igen i 40 milliliter makrofagmedium.Efter at have formuleret PBM'erne i et Malassez-kammer, overføres den mængde PBPC'er, der er nødvendig for at gennemføre forsøget, til et centrifugeringsrør. Centrifuge cellerne i 10 minutter ved 300 G.Aspirate supernatant og re-suspendere pellet i 80 mikroliter af sortering buffer pr 10 millioner PBM' er. Tilføj derefter 20 mikroliter CD14-mikroperler pr. 10 millioner PBC'er.Bland godt, og inkubere i 15 minutter ved 4 grader Celsius under konstant omrøring. Efter inkubation, tilføje en milliliter sortering buffer pr 10 millioner PBPC'er som en vask trin, og centrifuge som før. Derefter aspirere supernatant og re-suspendere pellet i 500 mikroliter sortering buffer pr 100 millioner PBMCs.Læg nu en kolonne i separatorens magnetfelt. Forbered kolonnen ved at skylle den med tre milliliter sorteringsbuffer. Anvend cellesuspensionen på kolonnen.Derefter indsamles strømmen gennem indeholdende umærkede celler til efterfølgende farvning, hvis det er nødvendigt. Kolonnen vaskes tre gange med tre milliliter sorteringsbuffer. Pas på ikke at tørre din kolonne.Derefter placere en samling rør under kolonnen og fjerne det fra separatoren. Efter vask, pipette fem milliliter sortering buffer i kolonnen. Skyl straks de magnetisk mærkede celler ud ved at skubbe stemplet ind i kolonnen.Gentag til sidst disse trin med en ny kolonne, før du pletter monocyterne og udfører makrophagepolariseringen som beskrevet i tekstprotokollen. Vedligehold monocytterne og makrofagerne i et iltkontrolleret miljø for at udføre hypoxisk tilstandsanalyse. Brug en hypoxi arbejdsstation for at opretholde celler under den ønskede ilt partielle tryk under forsøget.Når du arbejder under lavt ilttryk, er det vigtigt at forberede alle medier og vaskepuffere under stationen og vente tilstrækkeligt til at opnå det korrekte delvise tryk i væsken. Udfør cellelysis i en buffer under en tilpasset emhætte. Belastning proteinækvivalenten på 300.000 celler for hver prøve på 4-12% bis-tris acrylamidgelser.Kontroller varigheden af den elektroforetiske migration, så hver proteinprøve kan opdeles i seks gelbånd som vist her. Efter fastsættelse og farvning som beskrevet i tekstprotokollen, punktafgifter proteinbånd med en ren skalpel. Skær hvert punktbånd i tern, før de anbringes i 500 mikroliterrør.Nu vaske gel skiver tre gange i 200 mikroliter af 25 millimolar ammonium bikarbonat i 20 minutter ved 37 grader Celsius, kassere ammonium bikarbonat mellem hvert trin. Følg dette med en vask i 25 millimolar ammonium bikarbonat og acetonitril. Derefter dehydrere gel stykker med 200 mikroliter af 100% acetonitril i 10 minutter.Inkuber hvert gelstykke med 10 millimolar DTT og 25 millimolar ammoniumbikarbonat i 45 minutter ved 56 grader Celsius. Derefter kasseres DTT og inkubere gelstykket med 55 millimolar iodoacetamid i 25 millimolar ammoniumbikarbonat i 35 minutter i mørke ved stuetemperatur. For at stoppe alkylering kasseres den brugte opløsning og indkubes hvert gelstykke med 200 mikroliter på 10 millimolar DTT i 25 millimolar ammoniumbikarbonat i 10 minutter ved stuetemperatur.Gelstykkerne vaskes i 200 mikroliter af 25 millimolar ammoniumbikarbonat. Derefter dehydreres med 200 mikroliter på 100%acetonitril i 10 minutter. Fordøje proteiner natten over ved 37 grader Celsius med Trypsin/Lys-C Mix i henhold til producentens anvisninger.Ekstrakt de resulterende peptider fra gel stykker ved at tilføje 50 mikroliter af 50%acetonitrile i 15 minutter i lav-absorption rør. Efter tilsætning af 50 mikroliter af 5% myresyre i 15 minutter tilsættes 50 mikroliter på 100%acetonitril i 15 minutter. Hver fraktion trækkes og tørres i rør med lav absorption for at begrænse absorptionen af peptider og prøvetab.Opbevar prøverne ved 80 grader Celsius indtil yderligere analyse som beskrevet i tekstprotokollen. Vist her er den repræsentative renhed vurderet af flow cytometri efter magnetisk perle valg af CD14 positive monocytter. Fase kontrast billeddannelse af differentierede menneskelige makrofager viser heterogenitet af opnåede morfologier for to forskellige polariseringer efter ni dages kultur.Et eksempel på en off-gel fordøjelse ved hjælp af sølv-farvede SDS side geler er vist. Evaluering af protein fra cellelyse og efter fordøjelsesopløsning viser fraværet af nedbrydning under lysis og fordøjelsens effektivitet. Vist her er et eksempel på en kollision-induceret dissociation spektrum af et peptid findes ved masse-til-opladning forhold på 597,29 på MS spektrum med en elektrisk ladning af positive to.Fra dette spektrum blev den tilsvarende sekvens bestemt. Det endelige resultat efter analyse er et varmekort, der repræsenterer den hierarkiske klyngedannelse af alle polariseringsstater ved hjælp af differentierede proteiner. Analyse afslører en klynge af proteiner over-udtrykt i alle polariseringer i 3% ilt tilstand.Mens du forsøger denne procedure, er det vigtigt at huske, at du er nødt til at beslutte først, hvilken slags fraktionering du vil udføre på nye prøver til at tilpasse din protokol i overensstemmelse hermed. Den proteomic tilgang ved hjælp af dette arbejde er et supplement til genomiske tilgange, der har været anvendt i løbet af de sidste år inden for makrofag biologi polarisering undersøgelser. Efter sin udvikling, denne teknik baner vejen for forsker inden for immunologi at udforske de forskellige tilstande for aktivering af immunceller hos mennesker og også i andre pattedyr.Glem ikke, at arbejde med DTT kan være farligt, så du skal arbejde under en tilpasset hætte til at gøre denne procedure.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Løsning affinitetsrensede proteinkomplekser ved Blå Native PAGE og protein Korrelation Profilering

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

Dissektion af menneskelige nethinde og RPE-choroidea proteom analyse

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID — Proteom analyse af kontekst-specifik proteinkomplekser i deres Native cellulære miljø

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

Prøveudtagning og forbehandling af tand emalje carbonat for stabil Carbon og Oxygen isotop analyser

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Dynamisk proteom og miRNA analyse af Polysomes fra isolerede mus hjertet efter Langendorff Perfusion

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrering-fri In Vitro kvantificering af Protein Homo-oligomerisering ved hjælp af kommercielle instrumentering og gratis, Open Source lysstyrke analyse Software

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Anaerob Protein oprensning og kinetisk analyse via ilt elektrode til at studere DesB Dioxygenase aktivitet og hæmning

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Måling og fortolke ilt forbrug satser helt flyve hoved segmenter

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Undersøgelse af metabolismen af seks systemiske insekticider i en nyetableret celle affjedrings kultur afledt af te (Camellia sinensis L.) Blade

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...