Name: proteomic analysis of human macrophage polarization under a low oxygen environment
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment at JoVE.com

AM wordt gefinancierd door de jonge groep Leader programma ATIP/Avenir Inserm-CNRS, door la Ligue Nationale contre le Cancer en la ARC van de Fondation pour la recherche sur le Cancer. Wij danken Mariette Matondo van de Spectrometrie van de massa voor biologie-platform (UTECHS MSBIO, Pasteur Instituut, Parijs). Wij danken Lauren Anderson voor haar lezing van het manuscript.

Menselijke bloedmonsters (LRSC) van gezonde, de aangeduide donoren waren verkregen EFS (Frans nationaal bloed Service) als onderdeel van een geautoriseerde protocol (CODECOH DC-2018 – 3114). Donoren gaf ondertekende toestemming voor het gebruik van bloed.
1. Media en Buffer voorbereiding
<ol><li>Bereiden van het medium van de macrofaag [RPMI glutamax + 10 mM HEPES + 1 x niet-essentiële aminozuren (NEAA)] en het warm tot 37 ° C.</li>
	<li>Bereiden de macrofaag medium + 10% menselijk serum...

<ol>
	<li>Okabe, Y., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+biology+perspective+on+macrophages.">Tissue biology perspective on macrophages.</a> Nature Immunology. 17 (1), 9-17 (2016).</li><li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+plasticity+and+polarization:+in+vivo+veritas.">Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).</li><li>Murray, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+Polarization.">Macrophage Polarization.</a> Annual Review of Physiology. 79, 541-566 (2017).</li><li>Chinetti-Gbaguidi, G., Staels, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+polarization+in+metabolic+disorders:+functions+and+regulation.">Macrophage polarization in metabolic disorders: functions and regulation.</a> Current Opinion in Lipidology. 22 (5), 365-372 (2011).</li><li>Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+mononuclear+phagocyte+system+in+the+molecular+age.">Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).</li><li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation.">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).</li><li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets.">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).</li><li>Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+multidimensional+concept+of+macrophage+ontogeny,+activation+and+function.">New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function.</a> Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).</li><li>Xue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-based+network+analysis+reveals+a+spectrum+model+of+human+macrophage+activation.">Transcriptome-based network analysis reveals a spectrum model of human macrophage activation.</a> Immunity. 40 (2), 274-288 (2014).</li><li>Csete, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+in+the+cultivation+of+stem+cells.">Oxygen in the cultivation of stem cells.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1049, 1-8 (2005).</li><li>Johansson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional,+morphological,+and+phenotypical+differences+between+rat+alveolar+and+interstitial+macrophages.">Functional, morphological, and phenotypical differences between rat alveolar and interstitial macrophages.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 16 (5), 582-588 (1997).</li><li>Pfau, J. C., Schneider, J. C., Archer, A. J., Sentissi, J., Leyva, F. J., Cramton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+oxygen+tension+affects+phenotype+in+cultured+bone+marrow-derived+macrophages.">Environmental oxygen tension affects phenotype in cultured bone marrow-derived macrophages.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (2), L354-L362 (2004).</li><li>Grodzki, A. C. G., Giulivi, C., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+tension+modulates+differentiation+and+primary+macrophage+functions+in+the+human+monocytic+THP-1+cell+line.">Oxygen tension modulates differentiation and primary macrophage functions in the human monocytic THP-1 cell line.</a> PLoS One. 8 (1), e54926 (2013).</li><li>Court, M., Petre, G., Atifi, M. E., Millet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Signature+Reveals+Modulation+of+Human+Macrophage+Polarization+and+Functions+Under+Differing+Environmental+Oxygen+Conditions.">Proteomic Signature Reveals Modulation of Human Macrophage Polarization and Functions Under Differing Environmental Oxygen Conditions.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 16 (12), 2153-2168 (2017).</li><li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+proteome-wide+label-free+quantification+by+delayed+normalization+and+maximal+peptide+ratio+extraction,+termed+MaxLFQ.">Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).</li><li>Cox, J., Neuhauser, N., Michalski, A., Scheltema, R. A., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Andromeda:+a+peptide+search+engine+integrated+into+the+MaxQuant+environment.">Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment.</a> Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).</li><li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes.">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li><li>Court, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+standardized+urine+proteome+analysis+methodology.">Toward a standardized urine proteome analysis methodology.</a> Proteomics. 11 (6), 1160-1171 (2011).</li><li>Wi&#347;niewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).</li><li>Liebler, D. C., Ham, A. -. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spin+filter-based+sample+preparation+for+shotgun+proteomics.">Spin filter-based sample preparation for shotgun proteomics.</a> Nature Methods. 6 (11), 785-786 (2009).</li><li>Hubner, N. C., Ren, S., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+separation+with+immobilized+pI+strips+is+an+attractive+alternative+to+in-gel+protein+digestion+for+proteome+analysis.">Peptide separation with immobilized pI strips is an attractive alternative to in-gel protein digestion for proteome analysis.</a> Proteomics. 8 (23-24), 4862-4872 (2008).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Informed-Proteomics:+open-source+software+package+for+top-down+proteomics.">Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics.</a> Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).</li><li>Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+oxygen+and+culture+media+on+plating+efficiency+of+some+mammalian+tissue+cells.">Influence of oxygen and culture media on plating efficiency of some mammalian tissue cells.</a> Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).</li><li>Packer, L., Fuehr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+oxygen+concentration+extends+the+lifespan+of+cultured+human+diploid+cells.">Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells.</a> Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).</li><li>Lengner, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+pre-X+inactivation+human+embryonic+stem+cells+under+physiological+oxygen+concentrations.">Derivation of pre-X inactivation human embryonic stem cells under physiological oxygen concentrations.</a> Cell. 141 (5), 872-883 (2010).</li><li>Sidoli, S., Kulej, K., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+proteomics+is+not+the+new+genomics+and+the+future+of+mass+spectrometry+in+cell+biology.">Why proteomics is not the new genomics and the future of mass spectrometry in cell biology.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 21-24 (2017).</li></ol>

Omdat proteomics een krachtig hulpmiddel om te bestuderen van de expressie van verschillende eiwitten uit een hele cel of subcellular compartimenten is, is optimalisatie van het protocol van de lysis van de cel en de vertering van eiwitten aangepakt door een aantal studies. Er zijn drie belangrijke klassen van methoden, waaronder in-gel spijsvertering (vertering van eiwitten in polyacrylamidegel matrix)17, spijsvertering in oplossing18 en filter-aided monster voorbereiding<...

Macrofagen zijn ingeboren immune cellen die betrokken zijn bij een aantal fysiologische functies variërend van reacties op infectieziekten pathogenen tot weefsel homeostase, met inbegrip van de verwijdering van apoptotic cellen en reorganisatie van de extracellulaire matrix1. Deze cellen worden gekenmerkt door een sterke fenotypische plasticiteit2 dat vertaalt zich in een veel mogelijke activering Staten, ook wel genoemd polarisaties. De exacte moleculaire beschrijving van deze verschillende polarisaties is een prioriteit op het gebied van macrofaag biologie3. Er is voorgesteld om te classificeren deze polarisaties met behulp van de zogenaamde M1/M2-tweedeling, waarin M1 staat voor pro-inflammatoire en M2 voor anti-inflammatoire macrofagen. Dit model past goed in diverse pathologische situaties zoals acute infecties, allergie en obesitas4. Echter in chronisch ontstoken weefsels en kanker, is gebleken dat deze indeling is niet in staat om te begrijpen de brede fenotypische repertoire dat macrofagen aanwezig in bepaalde cellulaire omgevingen5,6,, 7. de huidige consensus is dat de macrofaag polarisatie beter wordt beschreven met behulp van een multidimensionale model te integreren van specifieke microenvironmental signalen8. Deze conclusie werd bevestigd door transcriptomic analyse van menselijke macrofagen waaruit blijkt dat het model van de M1/M2 in het beschrijven van de verkregen polarisaties9inefficiënt.
De studie gepresenteerd is gericht op het bieden van een protocol voor proteomic handtekeningen voor verschillende polarisaties in menselijke macrofagen. We beschrijven hoe onderscheiden van menselijke macrofagen in omgevingen van verschillende zuurstofniveaus en peptiden te verkrijgen van de hele macrofaag Proteoom voor het uitvoeren van een label-vrije kwantificering. Deze kwantificering kan de vergelijking van de expressie niveaus van verschillende eiwitten. Als het onderzoek aan stamcellen blijkt het belang van zuurstof als een milieu belangrijke parameter10, proberen wij te begrijpen hoe deze parameter weefsel macrofaag polarisatie in mensen kan beïnvloeden. De gedeeltelijke druk van zuurstof is gebleken dat bereik van 3 tot 20% (van totale luchtdruk) in het menselijk lichaam, waarbij 20% overeenkomt met ongeveer wat vaak in een cel cultuur incubator gebruikt wordt (de exacte waarde is ongeveer 18,6% terwijl het nemen van de aanwezigheid van water rekening).
Vorige werk heeft aangetoond dat alveolaire verschillen van interstitiële macrofagen van functionele en morfologische punt van uitzicht11 en dat deze verschillen zijn waarschijnlijk gedeeltelijk te wijten aan de verschillende zuurstofniveaus waaraan zij blootgesteld12 zijn. Beenmerg-afgeleide macrofagen Toon bovendien een verhoogde kunnen bacteriën bij blootstelling aan een lage zuurstof milieu12phagocytize. Het tegenovergestelde effect is gebleken voor menselijke macrofagen THP1-gesplitste13, maar deze resultaten ondersteunen het idee dat zuurstof een regulator van macrofaag biologie is en dat het noodzakelijk is deze rol op moleculair niveau in menselijke macrofagen te verduidelijken. In een eerdere studie, hebben wij toegepast een proteomics benadering van deze kwesties. Door gelijktijdig bij het meten van expressie niveaus voor duizenden eiwitten, we gewezen op het effect van zuurstof op polarisatie en verstrekt een lijst van nieuwe moleculaire markers. We hebben ook kunnen betrekking hebben op deze bevindingen tot enkele functies van de macrofagen. Met name, vonden we dat het percentage fagocytose van apoptotic cellen was verhoogd in IL4/IL13-gepolariseerde macrofagen, die was gekoppeld aan de opregulatie van ALOX15 zoals geopenbaard door de Proteoom analyse14. In de huidige studie beschrijven we het uitvoeren van een dergelijke analyse.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hypoxia Working Station</td>
			<td>Oxford Optronix</td>
			<td>Hypoxylab</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C6 Flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>Accuri C6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5188-6435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (FA)</td>
			<td>ARISTAR</td>
			<td>450122M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-250 Coomassie blue</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1,610,436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide, E.Coli (LPS)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>437627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2D clean-up kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>80-6484-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium, glutamax supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1 M</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) Solution 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harvard Apparatus column Reverse C18 micro spin column</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>74-4601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5 M, pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Bis-Tris 4-12%</td>
			<td>Life Technologies SAS</td>
			<td>NP0321 BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 Microbeads human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS separation column LS</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 4 (IL4)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 13 (IL13)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-112-410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interferon gamma (INF&#947;)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14-FITC (clone T&#220;K4)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-080-701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSmix Tube Rotator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic Acid (TFA)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>28904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/Lys-C Mix</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>V5073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Mini, EDTA-free Protease Inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density Gradient Solution (Histopaque 1077)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10771-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accumax</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7089-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum from human male AB plasma (SAB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4522-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) solution 30%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9576-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisma-base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>49767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>114405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 20%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>57670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiourea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C9426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL sterile plastic pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer C Eppendorf</td>
			<td>VWR</td>
			<td>460-0223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak tC18 reverse phase cartridges, 100 mg</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT036820</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proteomic analysis of human macrophage polarization under a low oxygen environment

Macrofagen zijn ingeboren immune cellen die betrokken zijn bij een aantal fysiologische functies variërend van reacties op infectieziekten pathogenen tot weefsel homeostase. De verschillende functies van deze cellen zijn gerelateerd aan hun activatie-Staten, die heet ook polarisatie. De exacte moleculaire beschrijving van deze verschillende polarisaties is een prioriteit op het gebied van macrofaag biologie. Momenteel wordt erkend dat een multidimensionale aanpak is noodzakelijk om te beschrijven hoe polarisatie wordt gecontroleerd door Milieusignalen. In dit verslag beschrijven we een protocol ontworpen voor de proteomic ondertekening van verschillende polarisaties in menselijke macrofagen. Dit protocol is gebaseerd op een label-vrije kwantificering van macrofaag eiwituitdrukking verkregen in-gel gespreide en Lys C/trypsine-verteerd cellulaire lysis inhoud. We bieden ook een protocol op basis van-oplossing spijsvertering en elektrisch gericht fractionering als alternatief te gebruiken. Omdat zuurstofconcentratie een relevante milieu-parameter in de weefsels is, we gebruiken dit protocol om te verkennen hoe atmosferische samenstelling of een lage zuurstof-omgeving is van invloed op de indeling van de macrofaag polarisatie.

Vanaf perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) verkregen door differentiële centrifugeren, het protocol toestaat het verkrijgen van een bevolking van CD14+ monocyten met een beoordeeld zuiverheid van meer dan 98% door stroom cytometry (Figuur 1). Deze monocyten zijn subsidiair gedifferentieerd naar verschillende polarisaties (Figuur 2). Wanneer een fractionering op gel wordt gekozen, de migratie op SDS-pagina gelen...

Watch this Scientific Journal Video about Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment at JoVE.com

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Presenteren we een protocol voor het verkrijgen van proteomic handtekeningen van menselijke macrofagen en dit toepassen op de bepaling van de invloed van een lage zuurstof milieu op macrophage polarisatie.

Proteoom analyse van menselijke Macrophage polarisatie onder een lage zuurstof-omgeving

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Dus deze methode kan helpen om belangrijke vragen in de macrofaag biologie veld te beantwoorden, zoals hoe de toestand van activering te karakteriseren onder verschillende omgevingen op eiwitniveau. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de mogelijkheid biedt om verschillende expressie van vele eiwitten in menselijke macrofagen te verkrijgen met behulp van labelvrije kwantificeringsmethode. Het demonstreren van de procedure zal Marie Malier en Magali Court uit mijn laboratorium.Om te beginnen, voeg 15 milliliter van dichtheid gradiënt cel scheiding oplossing in elk van twee 50 milliliter centrifugatie buizen, zodat de oplossing kan opwarmen tot kamertemperatuur voor ontvangst van de LRSC. Dit is essentieel omdat de dichtheid afhankelijk is van de temperatuur. Maak de LRSC leeg in een 50 milliliter centrifugatiebuis.Voeg 1x PBS tot 50 milliliter toe en meng. Voeg vervolgens heel langzaam 25 milliliter van het mengsel toe bovenop 15 milliliter geëquilibreerde dichtheidsgradiëntoplossing. Wees voorzichtig niet te mengen van de fasen tijdens deze stap.Het bloed moet worden toegevoegd aan de dichtheidgradiëntoplossing zonder enige verstoring van deze fase. Centrifuge beide centrifugatiebuizen gedurende 25 minuten bij 700 G zonder pauzes. Aan het einde van de dichtheid gradiënt centrifugatie, de lagen van de bodem naar boven zijn de erytrocyten en granulocyten, de vorming van de pellet, de dichtheid gradiënt oplossing fase, een laag van PBMCs, en het verdunde plasma.Met een pipet, door de plasmafase zonder het te aspireren. Verzamel vervolgens de PBMC-laag in een nieuwe 50 milliliter centrifugatiebuis. Voeg tot 50 milliliter 1x PBS toe aan de PBMCs als wassetup en centrifuge gedurende 10 minuten bij 300 G.Aspirate de supernatant en schort de pellet opnieuw op in 40 milliliter macrofaagmedium.Nadat u de PBMC's in een Malassez-kamer hebt geplaatst, draagt u de hoeveelheid PBMCs die nodig is voor het uitvoeren van het experiment over naar een centrifugatiebuis. Centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten op 300 G.Aspirate de supernatant en schort de pellet opnieuw op in 80 microliter van de sorteerbuffer per 10 miljoen PBMCs. Voeg vervolgens 20 microliter cd14-microbeads per 10 miljoen PBMCs toe.Meng goed, en incubeer gedurende 15 minuten op 4 graden Celsius onder constante agitatie. Voeg na incubatie een milliliter sorteerbuffer per 10 miljoen PBMCs toe als wasstap en centrifuge als voorheen. Vervolgens, aspirate de supernatant en opnieuw opschorten de pellet in 500 microliters van sorteren buffer per 100 miljoen PBMCs.Plaats nu een kolom in het magnetisch veld van de scheidingsteken. Bereid de kolom door het spoelen met drie milliliter van sorteren buffer. Breng de celsuspensie aan op de kolom.Dan verzamelen van de stroom door met niet-gelabelde cellen voor latere kleuring, indien nodig. Was de kolom drie keer met drie milliliter sorteerbuffer. Zorg ervoor dat u uw kolom niet droogt.Plaats vervolgens een opvangbuis onder de kolom en verwijder deze uit de scheidingsteken. Na de was, pipet vijf milliliter van sorteren buffer in de kolom. Spoel onmiddellijk de magnetisch gelabelde cellen door de zuiger stevig in de kolom te duwen.Herhaal deze stappen ten slotte met een nieuwe kolom voordat u de monocyten platmeert en de macrofaagpolarisatie uitvoert zoals beschreven in het tekstprotocol. Onderhoud de monocyten en de macrofagen in een zuurstofgecontroleerde omgeving om hypoxische conditieanalyse uit te voeren. Gebruik een hypoxie werkstation om cellen te behouden onder de gewenste zuurstof gedeeltelijke druk tijdens het experiment.Bij het werken onder lage zuurstofdruk is het belangrijk om alle media- en wasbuffers onder het station voor te bereiden en voldoende te wachten om de juiste gedeeltelijke druk in de vloeistof te verkrijgen. Voer cellyse uit in een buffer onder een aangepaste kap. Laad het eiwitequivalent van 300.000 cellen voor elk monster op 4-12% bis-tris acrylamide gels.Controleer de duur van de elektroforetische migratie om elk eiwitmonster te laten splitsen in zes gelbanden, zoals hier wordt getoond. Na het bevestigen en bevlekken zoals beschreven in het tekstprotocol, verlamt u de eiwitbanden met een schone scalpel. Dobbelstenen elke uitgesneden band voor het plaatsen van hen in 500 microliter buizen.Nu, was de gel plakjes drie keer in 200 microliters van 25 millimolar ammonium bicarbonaat gedurende 20 minuten op 37 graden Celsius, het weggooien van de ammonium bicarbonaat tussen elke stap. Volg dit met een wasbeurt in 25 millimolar ammonium bicarbonaat en acetonitril. Vervolgens dehydrateren de gel stukken met 200 microliters van 100%acetonitril gedurende 10 minuten.Incubeer elk gelstuk met 10 millimolar DTT en 25 millimolar ammoniumbicarbonaat gedurende 45 minuten bij 56 graden Celsius. Gooi vervolgens de DTT weg en ontcubeer het gelstuk met 55 millimolar iodoacetamide in 25 millimolar ammoniumbicarbonaat gedurende 35 minuten in het donker bij kamertemperatuur. Om alkylering te stoppen, gooi de gebruikte oplossing weg en ontcubeer je elk gelstuk met 200 microliter van 10 millimolar DTT in 25 millimolar ammoniumbicarbonaat gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.Was de gelstukken in 200 microliter van 25 millimolar ammoniumbicarbonaat. Vervolgens uitdrogen met 200 microliters van 100% acetonitril gedurende 10 minuten. Verteren de eiwitten 's nachts op 37 graden Celsius met Trypsin / Lys-C Mix volgens de instructies van de fabrikant.Haal de resulterende peptiden uit gelstukken door 50 microliters van 50% acetonitril gedurende 15 minuten toe te voegen in laagabsorptiebuizen. Voeg na 15 minuten 50 microliter van 5% mierenzuur toe, voeg 50 microliter van 100% acetonitril gedurende 15 minuten toe. Trek en droog elke fractie in laagabsorptiebuizen om de absorptie van peptiden en monsterverlies te beperken.Bewaar de monsters op 80 graden Celsius tot verdere analyse zoals beschreven in het tekstprotocol. Hier is de representatieve zuiverheid beoordeeld door flow cytometrie na magnetische kraal selectie van CD14 positieve monocyten. Fase contrast beeldvorming van gedifferentieerde menselijke macrofagen tonen heterogeniteit van verkregen morfologieën voor twee verschillende polarisaties na negen dagen van cultuur.Een voorbeeld van een off-gel spijsvertering met behulp van zilver-gekleurde SDS pagina gels wordt getoond. Evaluatie van eiwit uit cellyse en na in-oplossing spijsvertering toont de afwezigheid van afbraak tijdens lyse en de efficiëntie van de spijsvertering. Hier is een voorbeeld van een botsing-geïnduceerde dissociatie spectrum van een peptide gevonden bij massa-lading verhouding van 597,29 op het MS-spectrum met een elektrische lading van positieve twee.Uit dit spectrum werd de overeenkomstige volgorde bepaald. Het uiteindelijke resultaat na analyse is een warmtekaart die de hiërarchische clustering van alle polarisatietoestanden vertegenwoordigt met differentiaal uitgedrukte eiwitten. Analyse onthult een cluster van eiwitten over-uitgedrukt in alle polarisaties in de 3%zuurstof conditie.Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden dat je eerst moet beslissen wat voor soort fractionering u zal uitvoeren op nieuwe monsters om uw protocol dienovereenkomstig aan te passen. De proteomische benadering met behulp van dit werk is een aanvulling op genomische benaderingen die de afgelopen jaren zijn gebruikt op het gebied van de macrofaagbiologie polarisatiestudies. Na de ontwikkeling maakt deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van immunologie om de verschillende staten van activering van immuuncellen bij mensen en ook bij andere zoogdieren te verkennen.Vergeet niet dat het werken met DTT gevaarlijk kan zijn, dus je moet werken onder een aangepaste motorkap om deze procedure te doen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Het oplossen van Affiniteit gezuiverde eiwit complexen door Blue inheemse PAGE en Protein Correlatie Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

Dissectie van menselijke netvlies en RPE-vaatvlies voor proteoom-analyse

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID — Proteoom analyse van Context-specifieke eiwitcomplexen in hun inheemse cellulaire omgeving

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

Monstername en voorbehandeling van tandglazuur carbonaat voor stabiele koolstof en zuurstof isotoop analyse

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Dynamische Proteomic en miRNA analyse van Polysomes van geïsoleerde muis hart na Langendorff perfusie

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibratie-gratis In Vitro kwantificering van eiwit Homo-oligomerisatie met behulp van commerciële instrumentatie en Software van de analyse van de helderheid van gratis, Open Source

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Anaërobe EiwitReiniging en kinetische analyse via zuurstof-elektrode voor het bestuderen van de activiteit van de DesB Dioxygenase en inhibitie

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Meten en interpreteren van zuurstof verbruik geheel vliegen hoofd segmenten

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Studie over het metabolisme van zes systemische insecticiden in een nieuw opgerichte cel schorsing cultuur afgeleid van thee (Camellia sinensis L.) Bladeren

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...