Name: proteomic analysis of human macrophage polarization under a low oxygen environment
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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AM est financé par le programme Leader du groupe Young (ATIP/Avenir Inserm-CNRS), de la Ligue Nationale contre le Cancer et la Fondation ARC versez la recherche sur le Cancer. Nous remercions Mariette Matondo de la spectrométrie de masse pour plateforme de biologie (UTECHS MSBIO, Institut Pasteur, Paris). Nous remercions Lauren Anderson pour sa lecture du manuscrit.

Des échantillons de sang humain (LRSC) provenant de donneurs sains, dépersonnalisées proviennent de l’EFS (Français National Blood Service) dans le cadre d’un protocole autorisé (CODECOH DC-2018-3114). Donateurs ont donné le consentement signé pour l’utilisation du sang.
1. médias et préparation du tampon
<ol><li>Préparer le milieu de macrophage [RPMI glutamax + 10 mM HEPES + 1 x non essentiels des acides aminés (NEAA)] et elle chauffé à 37 ° C.</li>
	<li>Préparer le mil...

<ol>
	<li>Okabe, Y., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+biology+perspective+on+macrophages.">Tissue biology perspective on macrophages.</a> Nature Immunology. 17 (1), 9-17 (2016).</li><li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+plasticity+and+polarization:+in+vivo+veritas.">Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).</li><li>Murray, P. 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D., Merad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+mononuclear+phagocyte+system+in+the+molecular+age.">Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).</li><li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation.">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).</li><li>Murray, P. J., Wynn, T. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+multidimensional+concept+of+macrophage+ontogeny,+activation+and+function.">New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function.</a> Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).</li><li>Xue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-based+network+analysis+reveals+a+spectrum+model+of+human+macrophage+activation.">Transcriptome-based network analysis reveals a spectrum model of human macrophage activation.</a> Immunity. 40 (2), 274-288 (2014).</li><li>Csete, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+in+the+cultivation+of+stem+cells.">Oxygen in the cultivation of stem cells.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1049, 1-8 (2005).</li><li>Johansson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional,+morphological,+and+phenotypical+differences+between+rat+alveolar+and+interstitial+macrophages.">Functional, morphological, and phenotypical differences between rat alveolar and interstitial macrophages.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 16 (5), 582-588 (1997).</li><li>Pfau, J. C., Schneider, J. C., Archer, A. J., Sentissi, J., Leyva, F. J., Cramton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+oxygen+tension+affects+phenotype+in+cultured+bone+marrow-derived+macrophages.">Environmental oxygen tension affects phenotype in cultured bone marrow-derived macrophages.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (2), L354-L362 (2004).</li><li>Grodzki, A. C. G., Giulivi, C., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+tension+modulates+differentiation+and+primary+macrophage+functions+in+the+human+monocytic+THP-1+cell+line.">Oxygen tension modulates differentiation and primary macrophage functions in the human monocytic THP-1 cell line.</a> PLoS One. 8 (1), e54926 (2013).</li><li>Court, M., Petre, G., Atifi, M. E., Millet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Signature+Reveals+Modulation+of+Human+Macrophage+Polarization+and+Functions+Under+Differing+Environmental+Oxygen+Conditions.">Proteomic Signature Reveals Modulation of Human Macrophage Polarization and Functions Under Differing Environmental Oxygen Conditions.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 16 (12), 2153-2168 (2017).</li><li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+proteome-wide+label-free+quantification+by+delayed+normalization+and+maximal+peptide+ratio+extraction,+termed+MaxLFQ.">Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).</li><li>Cox, J., Neuhauser, N., Michalski, A., Scheltema, R. A., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Andromeda:+a+peptide+search+engine+integrated+into+the+MaxQuant+environment.">Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment.</a> Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).</li><li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes.">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li><li>Court, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+standardized+urine+proteome+analysis+methodology.">Toward a standardized urine proteome analysis methodology.</a> Proteomics. 11 (6), 1160-1171 (2011).</li><li>Wi&#347;niewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).</li><li>Liebler, D. C., Ham, A. -. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spin+filter-based+sample+preparation+for+shotgun+proteomics.">Spin filter-based sample preparation for shotgun proteomics.</a> Nature Methods. 6 (11), 785-786 (2009).</li><li>Hubner, N. C., Ren, S., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+separation+with+immobilized+pI+strips+is+an+attractive+alternative+to+in-gel+protein+digestion+for+proteome+analysis.">Peptide separation with immobilized pI strips is an attractive alternative to in-gel protein digestion for proteome analysis.</a> Proteomics. 8 (23-24), 4862-4872 (2008).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Informed-Proteomics:+open-source+software+package+for+top-down+proteomics.">Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics.</a> Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).</li><li>Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+oxygen+and+culture+media+on+plating+efficiency+of+some+mammalian+tissue+cells.">Influence of oxygen and culture media on plating efficiency of some mammalian tissue cells.</a> Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).</li><li>Packer, L., Fuehr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+oxygen+concentration+extends+the+lifespan+of+cultured+human+diploid+cells.">Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells.</a> Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).</li><li>Lengner, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+pre-X+inactivation+human+embryonic+stem+cells+under+physiological+oxygen+concentrations.">Derivation of pre-X inactivation human embryonic stem cells under physiological oxygen concentrations.</a> Cell. 141 (5), 872-883 (2010).</li><li>Sidoli, S., Kulej, K., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+proteomics+is+not+the+new+genomics+and+the+future+of+mass+spectrometry+in+cell+biology.">Why proteomics is not the new genomics and the future of mass spectrometry in cell biology.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 21-24 (2017).</li></ol>

Parce que la protéomique est un outil puissant pour étudier l’expression des différentes protéines d’une cellule entière ou compartiments subcellulaires, optimisation du protocole de la lyse cellulaire et la digestion des protéines a été traitées par un certain nombre d’études. Il y a trois grandes classes de méthodes, qui incluent la digestion en gel (digestion des protéines en gel de polyacrylamide matrice)17, digestion en solution18 et filtre assistée ...

Les macrophages sont des cellules immunitaires innées impliqués dans un certain nombre de fonctions physiologiques allant de réactions aux agents pathogènes infectieux à l’homéostasie tissulaire, y compris l’enlèvement de cellules apoptotiques et remodelage de la matrice extracellulaire1. Ces cellules sont caractérisées par une forte plasticité phénotypique2 qui se traduit par un nombreux États d’activation possible, qui sont aussi appelés les polarisations. La description moléculaire précise de ces polarisations différentes est une priorité dans le domaine des macrophages biologie3. Il a été proposé de classer ces polarisations à l’aide de la dichotomie de M1/M2 ce qu’on appelle, dans laquelle M1 représente pro-inflammatoires et M2 macrophages anti-inflammatoires. Ce modèle s’intègre bien dans diverses situations pathologiques comme les infections aiguës, allergies et obésité4. Toutefois, dans les tissus chroniquement enflammés et le cancer, il a été démontré que cette classification est incapable de comprendre le large répertoire phénotypique que macrophages présent dans certains environnements cellulaires5,,6, 7. le consensus actuel est que polarisation macrophage est mieux décrit en utilisant un modèle multidimensionnel pour intégrer des signaux micro-environnementales spécifiques8. Cette conclusion a été confirmée par analyse transcriptomique des macrophages humains montrant que le modèle M1/M2 est inefficace en décrivant les polarisations obtenu9.
L’étude présentée a pour but de fournir un protocole afin d’obtenir les signatures de protéomique de polarisations différentes dans les macrophages humains. Nous décrivons comment différencier les macrophages humains dans des environnements de divers niveaux d’oxygène et d’obtenir des peptides du protéome macrophage ensemble pour effectuer une quantification exempte d’étiquette. Cette quantification permet la comparaison des niveaux d’expression de diverses protéines. Recherche sur les cellules souches a révélé l’importance de l’oxygène comme un paramètre key environmental10, nous cherchons à comprendre comment ce paramètre tissu peut influencer polarisation macrophages chez les humains. La pression partielle d’oxygène a été trouvée à intervalle de 3 à 20 % (de la pression atmosphérique totale) dans le corps humain, où 20 % correspond à peu près à ce qui est couramment utilisé dans un incubateur de culture cellulaire (la valeur exacte est d’environ 18,6 % tout en prenant la présence d’eau en compte).
Travaux antérieurs ont montré qu’alvéolaire diffèrent des macrophages interstitielles de fonctionnelles et morphologique point de vues11 et que ces différences sont probablement partiellement en raison des niveaux d’oxygène différents auxquels ils sont exposés12. En outre, les dérivés de la moelle osseuse montrent une capacité accrue de phagocyter les bactéries lorsqu’ils sont exposés à un environnement de faible teneur en oxygène12. L’effet inverse a été trouvé pour les macrophages humains dissociés THP113, mais ces résultats appuient l’idée que l’oxygène est un organisme de réglementation de la biologie du macrophage et qu’il est nécessaire de préciser ce rôle au niveau moléculaire dans les macrophages humains. Dans une étude précédente, nous avons appliqué une approche protéomique pour résoudre ces problèmes. En mesurant les niveaux d’expression pour des milliers de protéines en même temps, nous avons mis en évidence l’impact de l’oxygène sur la polarisation ainsi qu’une liste de nouveaux marqueurs moléculaires. Nous avons également pu faire le lien entre ces résultats à certaines fonctions de macrophages. Notamment, nous avons constaté que le taux de la phagocytose des cellules apoptotiques a augmenté dans les macrophages IL4/IL13-polarisé, qui était liée à la stimulation de l’expression de ALOX15 tel que révélé par l' analyse de protéomique14. Dans la présente étude, nous décrivons comment effectuer une telle analyse.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hypoxia Working Station</td>
			<td>Oxford Optronix</td>
			<td>Hypoxylab</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C6 Flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>Accuri C6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5188-6435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (FA)</td>
			<td>ARISTAR</td>
			<td>450122M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-250 Coomassie blue</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1,610,436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide, E.Coli (LPS)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>437627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2D clean-up kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>80-6484-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium, glutamax supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1 M</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) Solution 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harvard Apparatus column Reverse C18 micro spin column</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>74-4601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5 M, pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Bis-Tris 4-12%</td>
			<td>Life Technologies SAS</td>
			<td>NP0321 BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 Microbeads human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS separation column LS</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 4 (IL4)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 13 (IL13)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-112-410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interferon gamma (INF&#947;)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14-FITC (clone T&#220;K4)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-080-701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSmix Tube Rotator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic Acid (TFA)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>28904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/Lys-C Mix</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>V5073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Mini, EDTA-free Protease Inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density Gradient Solution (Histopaque 1077)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10771-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accumax</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7089-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum from human male AB plasma (SAB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4522-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) solution 30%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9576-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisma-base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>49767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>114405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 20%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>57670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiourea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C9426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL sterile plastic pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer C Eppendorf</td>
			<td>VWR</td>
			<td>460-0223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak tC18 reverse phase cartridges, 100 mg</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT036820</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proteomic analysis of human macrophage polarization under a low oxygen environment

Les macrophages sont des cellules immunitaires innées impliqués dans un certain nombre de fonctions physiologiques allant de réactions aux agents pathogènes infectieux à l’homéostasie tissulaire. Les différentes fonctions de ces cellules sont liées à leurs États d’activation, qui est aussi appelé polarisation. La description moléculaire précise de ces polarisations différentes est une priorité dans le domaine de la biologie du macrophage. Il est actuellement reconnu qu’une approche multidimensionnelle est nécessaire pour décrire comment la polarisation est contrôlée par des signaux environnementaux. Dans ce rapport, nous décrivons un protocole visant à obtenir la signature de la protéomique des polarisations différentes dans les macrophages humains. Ce protocole est basé sur une quantification exempte d’étiquette d’expression de protéine macrophage provenant de fractionnés en gel et le contenu de lyse cellulaire Lys C/trypsine-digéré. Nous fournissons également un protocole basé sur la solution en digestion et isoélectrique mise au point de fractionnement à utiliser comme solution de rechange. Parce que la concentration en oxygène est un paramètre environnemental pertinent dans les tissus, nous permet de découvrir la composition de l’atmosphère comment ce protocole ou un environnement pauvre en oxygène influe sur la classification de la polarisation du macrophage.

À partir de cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) obtenus par centrifugation différentielle, le protocole permet l’obtention d’une population de CD14+ monocytes avec une pureté mises en recouvrement de plus de 98 % par cytométrie en flux (Figure 1). Ces monocytes sont différencient secondairement vers diverses polarisations (Figure 2). Quand un fractionnement sur gel est choisi, la migration s...

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Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Nous présentons un protocole visant à obtenir les signatures de protéomique des macrophages humains et cela s’applique à la détermination de l’impact d’un environnement pauvre en oxygène sur la polarisation de macrophages.

Analyse protéomique de polarisation des macrophages humains dans un environnement pauvre en oxygène

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Ainsi, cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie macrophage, comme la façon de caractériser l’état d’activation sous divers environnements au niveau des protéines. Le principal avantage de cette technique est qu’elle offre la possibilité d’obtenir l’expression différente de nombreuses protéines dans les macrophages humains en utilisant la méthode de quantification sans étiquette. Marie Malier et Magali Court de mon laboratoire feront la démonstration de la procédure.Pour commencer, ajoutez 15 millilitres de solution de séparation cellulaire de gradient de densité dans chacun des deux tubes de centrifugation de 50 millilitres afin que la solution puisse chauffer à température ambiante avant de recevoir le LRSC. Ceci est essentiel car la densité dépend de la température. Videz le LRSC dans un tube de centrifugation de 50 millilitres.Ajouter 1x PBS jusqu’à 50 millilitres et mélanger. Puis, très lentement, ajouter 25 millilitres du mélange sur le dessus de 15 millilitres de solution de gradient de densité équilibrée. Veillez à ne pas mélanger les phases au cours de cette étape.Le sang doit être ajouté sur la solution de gradient de densité sans aucune perturbation de cette phase. Centrifugeuse les deux tubes de centrifugation pendant 25 minutes à 700 G sans pauses. À la fin de la centrifugation du gradient de densité, les couches du bas vers le haut sont les érythrocytes et les granulocytes, formant la pastille, la phase de solution de gradient de densité, une couche de PBMCs, et le plasma dilué.Avec une pipette, passer à travers la phase plasmatique sans l’aspirer. Ensuite, rassemblez la couche PBMC dans un nouveau tube de centrifugation de 50 millilitres. Ajouter jusqu’à 50 millilitres de 1x PBS aux PBMCs comme installation de lavage et centrifugeuse pendant 10 minutes à 300 G.Aspirer le supernatant et suspendre à nouveau la pastille en 40 millilitres de macrophage moyen.Après avoir couché les PBMCs dans une chambre Malassez, transférez la quantité de PBMCs nécessaires à la conduite de l’expérience dans un tube de centrifugation. Centrifuger les cellules pendant 10 minutes à 300 G.Aspirate le supernatant et re-suspendre la pastille dans 80 microlitres du tampon de tri pour 10 millions de PBMCs. Ajoutez ensuite 20 microlitres de microbilles de CD14 pour 10 millions de PBMCs.Bien mélanger et incuber pendant 15 minutes à 4 degrés Celsius sous agitation constante. Après l’incubation, ajouter un millilitre de tampon de tri pour 10 millions de PMC comme étape de lavage, et centrifugeuse comme avant. Ensuite, aspirez le supernatant et suspendez la pastille en 500 microlitres de tampon de tri pour 100 millions de PBMCs.Maintenant, placez une colonne dans le champ magnétique du séparateur. Préparez la colonne en la rinçant avec trois millilitres de tampon de tri. Appliquez la suspension cellulaire sur la colonne.Puis recueillir le flux à travers contenant des cellules non étiquetées pour la coloration ultérieure, si nécessaire. Lavez la colonne trois fois avec trois millilitres de tampon de tri. Veillez à ne pas sécher votre colonne.Ensuite, placez un tube de collecte sous la colonne et retirez-le du séparateur. Après le lavage, pipette cinq millilitres de tampon de tri dans la colonne. Rincez immédiatement les cellules étiquetées magnétiquement en poussant fermement le piston dans la colonne.Enfin, répétez ces étapes avec une nouvelle colonne avant de placage des monocytes et d’effectuer la polarisation macrophage tel que décrit dans le protocole de texte. Maintenir les monocytes et les macrophages dans un environnement contrôlé par l’oxygène pour effectuer une analyse de l’état hypoxique. Utilisez un poste de travail d’hypoxie afin de maintenir les cellules sous la pression partielle d’oxygène désirée pendant l’expérience.Lorsque vous travaillez sous basse pression d’oxygène, il est important de préparer tous les supports et les tampons de lavage sous la station, et d’attendre suffisamment pour obtenir la pression partielle correcte dans le liquide. Effectuez la lyse cellulaire dans un tampon sous un capot adapté. Chargez l’équivalent protéique de 300 000 cellules pour chaque échantillon sur des gels acrylamides de 4-12%bis-tris.Contrôler la durée de la migration électrophoretic pour permettre à chaque échantillon de protéines de se diviser en six bandes de gel comme indiqué ici. Après fixation et coloration décrites dans le protocole textuel, excisez les bandes protéiques avec un scalpel propre. Couper chaque bande excisée en dés avant de la placer dans 500 tubes de microlitres.Maintenant, lavez les tranches de gel trois fois dans 200 microlitres de bicarbonate d’ammonium millimolaire pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius, jetant le bicarbonate d’ammonium entre chaque étape. Suivez ceci avec un lavage dans le bicarbonate de ammonium millimolar et l’acétyonitrile. Ensuite, déshydratez les morceaux de gel avec 200 microlitres de 100% acétyonitrile pendant 10 minutes.Incuber chaque morceau de gel avec 10 millimolar DTT et 25 millimolar ammonium bicarbonate pendant 45 minutes à 56 degrés Celsius. Ensuite, jetez la TNT et incubez le morceau de gel avec de l’iodoacetamide de 55 millimollaires en bicarbonate d’ammonium millimolaire pendant 35 minutes dans l’obscurité à température ambiante. Pour arrêter l’alkylation, jetez la solution utilisée et incubez chaque morceau de gel avec 200 microlitres de 10 millimolar DTT en bicarbonate d’ammonium millimolaire pendant 10 minutes à température ambiante.Laver les morceaux de gel en 200 microlitres de bicarbonate d’ammonium de 25 millimlaires. Ensuite, déshydratez avec 200 microlitres de 100% acetonitrile pendant 10 minutes. Digérer les protéines pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec Trypsin /Lys-C Mix selon les instructions du fabricant.Extraire les peptides qui en résultent des morceaux de gel en ajoutant 50 microlitres de 50% d’acétyonitrile pendant 15 minutes dans des tubes à faible absorption. Après avoir ajouté 50 microlitres d’acide 5% formic pendant 15 minutes, ajouter 50 microlitres de 100% acetonitrile pendant 15 minutes. Tirez et séchez chaque fraction dans des tubes à faible absorption pour limiter l’absorption des peptides et la perte d’échantillon.Stockez les échantillons à 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient analysés plus en détail dans le protocole texte. On y voit la pureté représentative évaluée par cytométrie d’écoulement à la suite de la sélection magnétique des monocytes positifs CD14. L’imagerie de contraste de phase des macrophages humains différenciés montrent l’hétérogénéité des morphologies obtenues pour deux polarisations différentes après neuf jours de culture.Un exemple de digestion hors gel à l’aide de gels de page SDS teintés d’argent est montré. L’évaluation des protéines de la lyse cellulaire et après la digestion en solution montre l’absence de dégradation pendant la lyse et l’efficacité de la digestion. Il est indiqué ici un exemple d’un spectre de dissociation induit par collision d’un peptide trouvé au rapport masse-charge de 597,29 sur le spectre de la SP avec une charge électrique de deux positifs.À partir de ce spectre, la séquence correspondante a été déterminée. Le résultat final après analyse est une carte thermique représentant le regroupement hiérarchique de tous les états de polarisation à l’aide de protéines exprimées différemment. L’analyse révèle un groupe de protéines sur-exprimées dans toutes les polarisations dans l’état d’oxygène de 3%.Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler que vous devez d’abord décider quel type de fractionnement vous effectuerez sur de nouveaux échantillons pour adapter votre protocole en conséquence. L’approche protéomique utilisant ces travaux est complémentaire aux approches génomiques qui ont été utilisées au cours des dernières années dans le domaine des études de polarisation de la biologie des macrophages. Après son développement, cette technique ouvre la voie à un chercheur dans le domaine de l’immunologie pour explorer les différents états d’activation des cellules immunitaires chez l’homme et aussi chez d’autres mammifères.N’oubliez pas que travailler avec la TNT pourrait être dangereux, vous devez donc travailler sous un capot adapté pour faire cette procédure.

Research

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