Name: proteomic analysis of human macrophage polarization under a low oxygen environment
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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AM la Ligue Nationale Contre le Cancer und la Fondation ARC pour la recherche Sur le Cancer vom Young Group Leader Programm (ATIP/Avenir Inserm-CNRS) finanziert. Wir bedanken uns bei Mariette Matondo von Massenspektrometrie für Biologie-Plattform (UTECHS MSBIO, Institut Pasteur, Paris). Wir danken Lauren Anderson für ihre Lektüre des Manuskripts.

Menschlichen Blutproben (LRSC) von gesunden, anonymisierte Spender wurden von EFS (Französisch nationalen Blut Service) im Rahmen eines genehmigten Protokolls (CODECOH DC-2018-3114) erhalten. Gebern gab unterschriebene Zustimmung für die Verwendung von Blut.
(1) Medien und Puffer-Vorbereitung
<ol><li>Bereiten Sie die Makrophagen Medium [RPMI Glutamax + 10 mM HEPES + 1 X nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA)] und auf 37 ° c warm</li>
	<li>Vorbereiten der Makrophagen Medium + 10 % humanem ...

<ol>
	<li>Okabe, Y., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+biology+perspective+on+macrophages.">Tissue biology perspective on macrophages.</a> Nature Immunology. 17 (1), 9-17 (2016).</li><li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+plasticity+and+polarization:+in+vivo+veritas.">Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).</li><li>Murray, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+Polarization.">Macrophage Polarization.</a> Annual Review of Physiology. 79, 541-566 (2017).</li><li>Chinetti-Gbaguidi, G., Staels, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+polarization+in+metabolic+disorders:+functions+and+regulation.">Macrophage polarization in metabolic disorders: functions and regulation.</a> Current Opinion in Lipidology. 22 (5), 365-372 (2011).</li><li>Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+mononuclear+phagocyte+system+in+the+molecular+age.">Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).</li><li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation.">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).</li><li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets.">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).</li><li>Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+multidimensional+concept+of+macrophage+ontogeny,+activation+and+function.">New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function.</a> Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).</li><li>Xue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-based+network+analysis+reveals+a+spectrum+model+of+human+macrophage+activation.">Transcriptome-based network analysis reveals a spectrum model of human macrophage activation.</a> Immunity. 40 (2), 274-288 (2014).</li><li>Csete, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+in+the+cultivation+of+stem+cells.">Oxygen in the cultivation of stem cells.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1049, 1-8 (2005).</li><li>Johansson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional,+morphological,+and+phenotypical+differences+between+rat+alveolar+and+interstitial+macrophages.">Functional, morphological, and phenotypical differences between rat alveolar and interstitial macrophages.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 16 (5), 582-588 (1997).</li><li>Pfau, J. C., Schneider, J. C., Archer, A. J., Sentissi, J., Leyva, F. J., Cramton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+oxygen+tension+affects+phenotype+in+cultured+bone+marrow-derived+macrophages.">Environmental oxygen tension affects phenotype in cultured bone marrow-derived macrophages.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (2), L354-L362 (2004).</li><li>Grodzki, A. C. G., Giulivi, C., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+tension+modulates+differentiation+and+primary+macrophage+functions+in+the+human+monocytic+THP-1+cell+line.">Oxygen tension modulates differentiation and primary macrophage functions in the human monocytic THP-1 cell line.</a> PLoS One. 8 (1), e54926 (2013).</li><li>Court, M., Petre, G., Atifi, M. E., Millet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Signature+Reveals+Modulation+of+Human+Macrophage+Polarization+and+Functions+Under+Differing+Environmental+Oxygen+Conditions.">Proteomic Signature Reveals Modulation of Human Macrophage Polarization and Functions Under Differing Environmental Oxygen Conditions.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 16 (12), 2153-2168 (2017).</li><li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+proteome-wide+label-free+quantification+by+delayed+normalization+and+maximal+peptide+ratio+extraction,+termed+MaxLFQ.">Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).</li><li>Cox, J., Neuhauser, N., Michalski, A., Scheltema, R. A., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Andromeda:+a+peptide+search+engine+integrated+into+the+MaxQuant+environment.">Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment.</a> Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).</li><li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes.">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li><li>Court, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+standardized+urine+proteome+analysis+methodology.">Toward a standardized urine proteome analysis methodology.</a> Proteomics. 11 (6), 1160-1171 (2011).</li><li>Wi&#347;niewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).</li><li>Liebler, D. C., Ham, A. -. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spin+filter-based+sample+preparation+for+shotgun+proteomics.">Spin filter-based sample preparation for shotgun proteomics.</a> Nature Methods. 6 (11), 785-786 (2009).</li><li>Hubner, N. C., Ren, S., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+separation+with+immobilized+pI+strips+is+an+attractive+alternative+to+in-gel+protein+digestion+for+proteome+analysis.">Peptide separation with immobilized pI strips is an attractive alternative to in-gel protein digestion for proteome analysis.</a> Proteomics. 8 (23-24), 4862-4872 (2008).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Informed-Proteomics:+open-source+software+package+for+top-down+proteomics.">Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics.</a> Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).</li><li>Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+oxygen+and+culture+media+on+plating+efficiency+of+some+mammalian+tissue+cells.">Influence of oxygen and culture media on plating efficiency of some mammalian tissue cells.</a> Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).</li><li>Packer, L., Fuehr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+oxygen+concentration+extends+the+lifespan+of+cultured+human+diploid+cells.">Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells.</a> Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).</li><li>Lengner, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+pre-X+inactivation+human+embryonic+stem+cells+under+physiological+oxygen+concentrations.">Derivation of pre-X inactivation human embryonic stem cells under physiological oxygen concentrations.</a> Cell. 141 (5), 872-883 (2010).</li><li>Sidoli, S., Kulej, K., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+proteomics+is+not+the+new+genomics+and+the+future+of+mass+spectrometry+in+cell+biology.">Why proteomics is not the new genomics and the future of mass spectrometry in cell biology.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 21-24 (2017).</li></ol>

Da Proteomics ein mächtiges Werkzeug ist, um den Ausdruck verschiedener Proteine aus einer ganzen Zelle oder subzelluläre Kompartimente zu studieren, wurde Optimierung des Protokolls Zelle Lysis und Verdauung der Proteine durch eine Reihe von Studien behoben. Es gibt drei Hauptklassen von Methoden, die im Gel Verdauung (Verdauung von Proteinen in Polyacrylamid Gelmatrix)17, Verdauung in Lösung18 und Filter-gestützte Probe Vorbereitung19enthalten....

Makrophagen sind angeborene Immunzellen beteiligt in einer Reihe von physiologischen Funktionen von Antworten auf infektiöse Erreger bis hin zu Gewebe Homöostase, einschließlich der Entfernung des apoptotischen Zellen und der extrazellulären Matrix1Umbau. Diese Zellen zeichnen sich durch eine starke phänotypische Plastizität2 , die in einem viele mögliche Aktivierung Staaten übersetzt die Polarisationen auch genannt werden. Der genaue molekulare Beschreibung dieser verschiedenen Polarisationen ist eine Priorität im Bereich der Makrophagen Biologie3. Es wurde vorgeschlagen, diese mit Hilfe der sogenannten M1/M2 Dichotomie, in denen M1 steht Pro-inflammatorischen und M2 für entzündungshemmende Makrophagen Polarisationen zu klassifizieren. Dieses Modell passt gut in verschiedenen pathologischen Situationen wie akute Infektionen, Allergien und Übergewicht4. Allerdings wurde in chronisch entzündeten Geweben und Krebs nachgewiesen, dass diese Klassifizierung nicht in der Lage ist, das breite phänotypische Repertoire zu erfassen, das Makrophagen in bestimmten zellulären Umgebungen5,6, zu präsentieren 7. der aktuelle Konsens ist, dass Makrophagen Polarisation besser ein mehrdimensionales Modell beschrieben ist, um spezifische microenvironmental Signale8zu integrieren. Diese Schlussfolgerung wurde bestätigt durch die transkriptomischen Analyse der menschlichen Makrophagen, die zeigen, dass das Modell M1/M2 bei der Beschreibung der erhaltenen Polarisationen9ineffizient ist.
Die Studie präsentiert zielt darauf ab, ein Protokoll zur Proteomic Unterschriften von verschiedenen Polarisationen in menschliche Makrophagen zu erhalten. Wir beschreiben, wie menschliche Makrophagen im Umfeld der verschiedenen Sauerstoff-Niveaus zu unterscheiden und das ganze Makrophagen Proteom markierungsfreie Quantifizierung durchführen Peptide einzuholen. Diese Quantifizierung ermöglicht den Vergleich der Ausdruck verschiedener Proteine. Wie die Forschung an Stammzellen die Bedeutung von Sauerstoff als eine ökologische Schlüsselparameter10gezeigt hat, versuchen wir zu verstehen, wie dieser Parameter Gewebe Makrophagen Polarisierung in den Menschen beeinflussen kann. Der Partialdruck des Sauerstoffs ist Reichweite von 3 bis 20 % (des gesamten atmosphärischen Drucks) im menschlichen Körper gefunden worden wo entspricht in etwa 20 %, was in einer Zelle Kultur Inkubator verbreitet ist (der genaue Wert ist rund 18,6 % während der Einnahme der Anwesenheit von Wasser nicht berücksichtigt).
Bisherigen Arbeit hat gezeigt, dass alveoläre unterscheiden sich von interstitielle Makrophagen aus funktionellen und morphologischen Ansichten11 und diese Unterschiede wahrscheinlich teilweise aufgrund der unterschiedlichen Sauerstoff-Niveaus sind, die sie ausgesetzt12sind. Darüber hinaus zeigen dem Knochenmark stammenden Makrophagen eine erhöhte Fähigkeit, Bakterien bei einer sauerstoffarmen Umgebung12phagocytize. Der gegenteiligen Effekt hat für THP1 differenziert menschliche Makrophagen13gefunden worden, aber diese Ergebnisse unterstützen die Idee, dass Sauerstoff ein Regulator von Makrophagen Biologie ist, es ist zu klären, diese Rolle auf molekularer Ebene in menschliche Makrophagen. In einer früheren Studie haben wir einen Proteomics-Ansatz zur Behebung dieser Probleme angewendet. Durch gleichzeitige Messung Ausdruck Niveaus für Tausende von Proteinen, wir haben die Auswirkungen von Sauerstoff auf Polarisierung und stellte eine Liste von neuen molekularen Markern. Wir waren auch in der Lage, diese Erkenntnisse zu einigen Funktionen der Makrophagen zu beziehen. Vor allem fanden wir, dass die Rate der Phagozytose apoptotischer Zellen im IL4/IL13-polarisierten Makrophagen erhöht wurde, die an die Hochregulation des ALOX15 gebunden war, wie der Proteomik Analyse14offenbart. In der vorliegenden Studie beschreiben wir wie eine solche Analyse durchführen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hypoxia Working Station</td>
			<td>Oxford Optronix</td>
			<td>Hypoxylab</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C6 Flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>Accuri C6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5188-6435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (FA)</td>
			<td>ARISTAR</td>
			<td>450122M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-250 Coomassie blue</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1,610,436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide, E.Coli (LPS)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>437627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2D clean-up kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>80-6484-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium, glutamax supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1 M</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) Solution 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harvard Apparatus column Reverse C18 micro spin column</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>74-4601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5 M, pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Bis-Tris 4-12%</td>
			<td>Life Technologies SAS</td>
			<td>NP0321 BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 Microbeads human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS separation column LS</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 4 (IL4)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 13 (IL13)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-112-410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interferon gamma (INF&#947;)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14-FITC (clone T&#220;K4)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-080-701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSmix Tube Rotator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic Acid (TFA)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>28904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/Lys-C Mix</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>V5073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Mini, EDTA-free Protease Inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density Gradient Solution (Histopaque 1077)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10771-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accumax</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7089-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum from human male AB plasma (SAB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4522-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) solution 30%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9576-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisma-base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>49767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>114405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 20%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>57670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiourea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C9426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL sterile plastic pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer C Eppendorf</td>
			<td>VWR</td>
			<td>460-0223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak tC18 reverse phase cartridges, 100 mg</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT036820</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proteomic analysis of human macrophage polarization under a low oxygen environment

Makrophagen sind angeborene Immunzellen beteiligt in einer Reihe von physiologischen Funktionen von Antworten auf infektiöse Erreger bis hin zu Gewebe Homöostase. Die verschiedenen Funktionen dieser Zellen beziehen sich auf deren Aktivierungsstatus die Polarisation auch genannt. Der genaue molekulare Beschreibung dieser verschiedenen Polarisationen ist eine Priorität im Bereich der Makrophagen Biologie. Anerkanntermaßen ist derzeit die ein mehrdimensionaler Ansatz ist notwendig, um zu beschreiben wie Polarisation durch Umweltsignale gesteuert wird. In diesem Bericht beschreiben wir ein Protokoll entwickelt, um die Proteomik-Signatur von verschiedenen Polarisationen in menschliche Makrophagen zu erhalten. Dieses Protokoll basiert auf einem markierungsfreie Quantifizierung der Makrophagen-Protein-Expression von fraktioniert auf dem Gel und Lys C/Trypsin-verdaut zellulären Lyse Inhalt erhalten. Wir bieten auch ein Protokoll basierend auf in-Lösung Verdauung und isoelektrischen Fokussierung Fraktionierung, als Alternative zu verwenden. Da Sauerstoff-Konzentration einen relevanten ökologischen Parameter im Gewebe ist, verwenden wir dieses Protokoll, um wie atmosphärische Zusammensetzung zu erkunden oder eine sauerstoffarmen Umgebung wirkt sich auf die Klassifizierung von Makrophagen Polarisation.

Ausgehend von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) durch differentielle Zentrifugation gewonnen, das Protokoll ermöglicht den Erhalt einer Population von CD14+ Monozyten mit einem veranlagten Reinheit von mehr als 98 % von Durchflusszytometrie (Abbildung 1). Diese Monozyten werden sekundär gegenüber verschiedenen Polarisationen (Abbildung 2) unterschieden. Wenn eine Fraktionierung auf Gel gewählt, die Migra...

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Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll zur Proteomic Unterschriften von menschlichen Makrophagen und wenden Sie diese zur Bestimmung der Auswirkungen einer sauerstoffarmen Umgebung auf Makrophagen Polarisation.

Proteomic Analysen der menschlichen Makrophagen Polarisierung in einer sauerstoffarmen Umgebung

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

So kann diese Methode helfen, wichtige Fragen im Bereich der Makrophagenbiologie zu beantworten, wie zum Beispiel, wie der Zustand der Aktivierung unter verschiedenen Umgebungen auf Proteinebene charakterisiert werden kann. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie die Möglichkeit bietet, eine unterschiedliche Expression vieler Proteine in menschlichen Makrophagen mit hilfe einer etikettenfreien Quantifizierungsmethode zu erhalten. Demonstrieren das Verfahren werden Marie Malier und Magali Court aus meinem Labor sein.Zunächst fügen Sie 15 Milliliter Dichtegradienten-Zelltrennlösung in zwei 50-Milliliter-Zentrifugationsrohre ein, damit sich die Lösung vor Erhalt des LRSC auf Raumtemperatur erwärmen kann. Dies ist wichtig, da die Dichte von der Temperatur abhängt. Leeren Sie den LRSC in ein 50 Milliliter Zentrifugationsrohr.1x PBS bis zu 50 Milliliter hinzufügen und mischen. Dann, sehr langsam, fügen Sie 25 Milliliter der Mischung auf 15 Milliliter der gleichgewichtiver Dichte Gradientlösung. Achten Sie darauf, die Phasen in diesem Schritt nicht zu mischen.Das Blut muss auf die Dichtegradientenlösung ohne Störung dieser Phase hinzugefügt werden. Zentrifugieren Sie beide Zentrifugationsrohre für 25 Minuten bei 700 G ohne Pausen. Am Ende der Dichtegradientenzentrifugation sind die Schichten von unten nach oben die Erythrozyten und Granulozyten, die das Pellet bilden, die Dichtegradientenlösungsphase, eine Schicht von PBMCs und das verdünnte Plasma.Mit einer Pipette durchdieen, ohne sie zu aspitrieren. Dann sammeln Sie die PBMC-Schicht in ein neues 50 Milliliter Zentrifugationsrohr. Fügen Sie bis zu 50 Milliliter 1x PBS zu den PBMCs als Wascheinrichtung und Zentrifuge für 10 Minuten bei 300 G hinzu. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 40 Milliliter Makrophagenmedium wieder auf.Nachdem Sie die PBMCs in einer Malassez-Kammer eingepfert haben, übertragen Sie die Menge an PBMCs, die für die Durchführung des Experiments erforderlich sind, auf ein Zentrifugationsrohr. Zentrifugieren Sie die Zellen für 10 Minuten bei 300 G. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 80 Mikroliter des Sortierpuffers pro 10 Millionen PBMCs wieder auf. Fügen Sie dann 20 Mikroliter CD14 Mikroperlen pro 10 Millionen PBMCs hinzu.Gut mischen und 15 Minuten bei 4 Grad Celsius unter ständiger Agitation brüten. Fügen Sie nach der Inkubation einen Milliliter Sortierpuffer pro 10 Millionen PBMCs als Waschschritt und Zentrifuge wie bisher hinzu. Dann aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 500 Mikroliter Sortierpuffer pro 100 Millionen PBMCs wieder auf.Platzieren Sie nun eine Säule im Magnetfeld des Separators. Bereiten Sie die Spalte vor, indem Sie sie mit drei Millilitern Sortierpuffer spülen. Tragen Sie die Zellsuspension auf die Spalte auf.Dann sammeln Sie den Durchfluss mit nicht beschrifteten Zellen für die nachfolgende Färbung, falls erforderlich. Waschen Sie die Säule dreimal mit drei Millilitern Sortierpuffer. Achten Sie darauf, Ihre Säule nicht zu trocknen.Platzieren Sie dann ein Sammelrohr unter der Spalte, und entfernen Sie es aus dem Trennzeichen. Nach dem Waschen, Pipette fünf Milliliter Sortierpuffer in die Spalte. Spülen Sie die magnetisch beschrifteten Zellen sofort aus, indem Sie den Kolben fest in die Säule drücken.Wiederholen Sie diese Schritte schließlich mit einer neuen Spalte, bevor Sie die Monozyten plattieren und die Makrophagenpolarisation durchführen, wie im Textprotokoll beschrieben. Bewahren Sie die Monozyten und Makrophagen in einer sauerstoffgesteuerten Umgebung auf, um eine hypoxische Zustandsanalyse durchzuführen. Verwenden Sie eine Hypoxie-Arbeitsstation, um Zellen während des Experiments unter dem gewünschten Sauerstoffpartialdruck zu halten.Bei Arbeiten unter niedrigem Sauerstoffdruck ist es wichtig, alle Medien und Waschpuffer unter der Station vorzubereiten und ausreichend zu warten, um den richtigen Teildruck in der Flüssigkeit zu erhalten. Führen Sie die Zelllyse in einem Puffer unter einer angepassten Haube durch. Laden Sie das Proteinäquivalent von 300.000 Zellen für jede Probe auf 4-12%bis-tris Acrylamidgele.Steuern Sie die Dauer der elektrophoretischen Migration, damit sich jede Proteinprobe in sechs Gelbänder aufteilen kann, wie hier gezeigt. Nach der Fixierung und Färbung, wie im Textprotokoll beschrieben, verbrauchen Sie die Proteinbänder mit einem sauberen Skalpell. Würfeln Sie jedes ausgeschnittene Band, bevor Sie sie in 500 Mikroliter-Röhren legen.Waschen Sie nun die Gelscheiben dreimal in 200 Mikroliter 25 Millimolar Ammoniumbicarbonat für 20 Minuten bei 37 Grad Celsius, wobei das Ammoniumbicarbonat zwischen jedem Schritt entsorgt wird. Folgen Sie dies mit einer Wäsche in 25 Millimolar Ammoniumbicarbonat und Acetonitril. Dann die Gelstücke mit 200 Mikroliter100%Acetonitril für 10 Minuten dehydrieren.Inkubieren Sie jedes Gelstück mit 10 Millimolar DTT und 25 Millimolar Ammoniumbicarbonat für 45 Minuten bei 56 Grad Celsius. Dann entsorgen Sie das DTT und inkubieren Sie das Gelstück mit 55 Millimolar-Iodoacetamid in 25 Millimolar Ammoniumbicarbonat für 35 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur. Um die Alkylierung zu stoppen, entsorgen Sie die verwendete Lösung und inkubieren Sie jedes Gelstück mit 200 Mikrolitern 10 Millimolar DTT in 25 Millimolar Ammoniumbicarbonat für 10 Minuten bei Raumtemperatur.Waschen Sie die Gelstücke in 200 Mikroliter 25 Millimolar Ammoniumbicarbonat. Dann mit 200 Mikroliter 100%Acetonitril für 10 Minuten dehydrieren. Verdauen Sie die Proteine über Nacht bei 37 Grad Celsius mit Trypsin/Lys-C Mix gemäß den Anweisungen des Herstellers.Extrahieren Sie die resultierenden Peptide aus Gelstücken, indem Sie 50 Mikroliter 50%Acetonitril für 15 Minuten in Subsitten mit geringer Absorption hinzufügen. Nach Zugabe von 50 Mikroliter5%Ameisensäure für 15 Minuten 50 Mikroliter 100% Acetonitril für 15 Minuten hinzufügen. Ziehen und trocknen Sie jede Fraktion in Absorptionsröhrchen, um die Absorption von Peptiden und Probenverlust zu begrenzen.Bewahren Sie die Proben bei 80 Grad Celsius auf, bis weitere Analysen durchgeführt werden, wie im Textprotokoll beschrieben. Hier ist die repräsentative Reinheit dargestellt, die durch Durchflusszytometrie nach der magnetischen Perlenauswahl von CD14-positiven Monozyten beurteilt wird. Phasenkontrast-Bildgebung von differenzierten menschlichen Makrophagen zeigen Heterogenität der erhaltenen Morphologien für zwei verschiedene Polarisationen nach neun Tagen Kultur.Ein Beispiel für eine Off-Gel-Verdauung mit silberbefleckten SDS-Seitengelen wird gezeigt. Die Auswertung des Proteins aus der Zelllyse und nach der Verdauung in der Lösung zeigt das Fehlen von Abbau während der Lyse und die Effizienz der Verdauung. Hier ist ein Beispiel für ein kollisionsinduziertes Dissoziationsspektrum eines Peptids zu sehen, das bei einem Massen-Zu-Lade-Verhältnis von 597,29 im MS-Spektrum mit einer elektrischen Ladung von positiven zwei gefunden wird.Aus diesem Spektrum wurde die entsprechende Reihenfolge bestimmt. Das Endergebnis nach der Analyse ist eine Heatmap, die die hierarchische Clusterbildung aller Polarisationszustände mit differenziell exprimierten Proteinen darstellt. Die Analyse zeigt einen Cluster von Proteinen, die in allen Polarisationen im 3%-Sauerstoffzustand überexprimiert sind.Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass Sie zuerst entscheiden müssen, welche Art von Fraktionierung Sie für neue Samples durchführen, um Ihr Protokoll entsprechend anzupassen. Der proteomische Ansatz, der diese Arbeit verwendet, ergänzt genomische Ansätze, die in den letzten Jahren im Bereich der makrophagenbiologischen Polarisationsstudien verwendet wurden. Nach ihrer Entwicklung ebnet diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Immunologie, um die verschiedenen Zustände der Aktivierung von Immunzellen beim Menschen und auch bei anderen Säugetieren zu erforschen.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit DTT gefährlich sein könnte, so dass Sie unter einer angepassten Haube arbeiten müssen, um dieses Verfahren zu tun.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Auflösen von Affinity Purified Protein-Komplexen von Blue native PAGE und Protein Correlation Profilieren

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Forschung

Biochemie

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

Dissektion der menschlichen Netzhaut und RPE-Aderhaut für Proteomic Analysen

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID — Proteomic Analyse der kontextspezifischen Proteinkomplexe in ihrer natürlichen zellulären Umgebung

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

Probenahme und Vorbehandlung des Zahnschmelzes Carbonat für stabile Kohlenstoff und Sauerstoff-Isotopen-Analyse

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Dynamische Proteomic und MiRNA Analyse des Polysomes von isolierten Maus Herz nach Langendorff Perfusion

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrierung-kostenlose In-vitro- Quantifizierung von Protein Homo-Oligomerisierung mit kommerziellen Instrumentierung und kostenlose Open Source-Helligkeit-Analyse-Software

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Anaerobe Proteinreinigung und kinetische Analyse über Sauerstoff-Elektrode für das Studium DesB Dioxygenase Aktivität und Hemmung

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Messung und Interpretation von Sauerstoff-Verbrauch im ganzen fliegen Kopf Segmente

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Studie über den Stoffwechsel von sechs systemischen Insektiziden in einer neu etablierten Zellsuspensionskultur abgeleitet aus Tee (Camellia Sinensis L.) Blätter

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...