Name: proteomic analysis of human macrophage polarization under a low oxygen environment
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment at JoVE.com

AM ממומן על-ידי התוכנית מנהיג קבוצה צעירה (ATIP/Avenir Inserm-CNRS), על ידי לה ליגה נאסיונאל חדר מרווח וחדיש le סרטן ו la Fondation ARC למזוג לה רשרש sur le סרטן. אנו מודים מארייט Matondo מספקטרומטריית לפלטפורמה ביולוגיה (UTECHS MSBIO, מכון פסטר, פריז). אנו מודים לורן אנדרסון על אותה קריאה של כתב היד.

דגימות דם אדם (LRSC) מתורמים בריאים, מבטל את מזוהה, התקבלו EFS (שירות דם הלאומית הצרפתית) במסגרת פרוטוקול מורשה (CODECOH DC-2018-3114). תורמים נתן הסכמה חתומים לשימוש של דם.
1. הכנת מאגר ומדיה
<ol><li>להכין המדיום מקרופאג [RPMI glutamax + 10 מ מ HEPES + חומצות אמינו שאינן הכרחיות x 1 (NEAA)], לחמם את זה ל- 37 מעלו?...

<ol>
	<li>Okabe, Y., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+biology+perspective+on+macrophages.">Tissue biology perspective on macrophages.</a> Nature Immunology. 17 (1), 9-17 (2016).</li><li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+plasticity+and+polarization:+in+vivo+veritas.">Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).</li><li>Murray, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+Polarization.">Macrophage Polarization.</a> Annual Review of Physiology. 79, 541-566 (2017).</li><li>Chinetti-Gbaguidi, G., Staels, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+polarization+in+metabolic+disorders:+functions+and+regulation.">Macrophage polarization in metabolic disorders: functions and regulation.</a> Current Opinion in Lipidology. 22 (5), 365-372 (2011).</li><li>Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+mononuclear+phagocyte+system+in+the+molecular+age.">Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).</li><li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation.">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).</li><li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets.">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).</li><li>Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+multidimensional+concept+of+macrophage+ontogeny,+activation+and+function.">New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function.</a> Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).</li><li>Xue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-based+network+analysis+reveals+a+spectrum+model+of+human+macrophage+activation.">Transcriptome-based network analysis reveals a spectrum model of human macrophage activation.</a> Immunity. 40 (2), 274-288 (2014).</li><li>Csete, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+in+the+cultivation+of+stem+cells.">Oxygen in the cultivation of stem cells.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1049, 1-8 (2005).</li><li>Johansson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional,+morphological,+and+phenotypical+differences+between+rat+alveolar+and+interstitial+macrophages.">Functional, morphological, and phenotypical differences between rat alveolar and interstitial macrophages.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 16 (5), 582-588 (1997).</li><li>Pfau, J. C., Schneider, J. C., Archer, A. J., Sentissi, J., Leyva, F. J., Cramton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+oxygen+tension+affects+phenotype+in+cultured+bone+marrow-derived+macrophages.">Environmental oxygen tension affects phenotype in cultured bone marrow-derived macrophages.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (2), L354-L362 (2004).</li><li>Grodzki, A. C. G., Giulivi, C., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+tension+modulates+differentiation+and+primary+macrophage+functions+in+the+human+monocytic+THP-1+cell+line.">Oxygen tension modulates differentiation and primary macrophage functions in the human monocytic THP-1 cell line.</a> PLoS One. 8 (1), e54926 (2013).</li><li>Court, M., Petre, G., Atifi, M. E., Millet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Signature+Reveals+Modulation+of+Human+Macrophage+Polarization+and+Functions+Under+Differing+Environmental+Oxygen+Conditions.">Proteomic Signature Reveals Modulation of Human Macrophage Polarization and Functions Under Differing Environmental Oxygen Conditions.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 16 (12), 2153-2168 (2017).</li><li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+proteome-wide+label-free+quantification+by+delayed+normalization+and+maximal+peptide+ratio+extraction,+termed+MaxLFQ.">Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).</li><li>Cox, J., Neuhauser, N., Michalski, A., Scheltema, R. A., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Andromeda:+a+peptide+search+engine+integrated+into+the+MaxQuant+environment.">Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment.</a> Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).</li><li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes.">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li><li>Court, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+standardized+urine+proteome+analysis+methodology.">Toward a standardized urine proteome analysis methodology.</a> Proteomics. 11 (6), 1160-1171 (2011).</li><li>Wi&#347;niewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).</li><li>Liebler, D. C., Ham, A. -. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spin+filter-based+sample+preparation+for+shotgun+proteomics.">Spin filter-based sample preparation for shotgun proteomics.</a> Nature Methods. 6 (11), 785-786 (2009).</li><li>Hubner, N. C., Ren, S., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+separation+with+immobilized+pI+strips+is+an+attractive+alternative+to+in-gel+protein+digestion+for+proteome+analysis.">Peptide separation with immobilized pI strips is an attractive alternative to in-gel protein digestion for proteome analysis.</a> Proteomics. 8 (23-24), 4862-4872 (2008).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Informed-Proteomics:+open-source+software+package+for+top-down+proteomics.">Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics.</a> Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).</li><li>Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+oxygen+and+culture+media+on+plating+efficiency+of+some+mammalian+tissue+cells.">Influence of oxygen and culture media on plating efficiency of some mammalian tissue cells.</a> Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).</li><li>Packer, L., Fuehr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+oxygen+concentration+extends+the+lifespan+of+cultured+human+diploid+cells.">Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells.</a> Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).</li><li>Lengner, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+pre-X+inactivation+human+embryonic+stem+cells+under+physiological+oxygen+concentrations.">Derivation of pre-X inactivation human embryonic stem cells under physiological oxygen concentrations.</a> Cell. 141 (5), 872-883 (2010).</li><li>Sidoli, S., Kulej, K., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+proteomics+is+not+the+new+genomics+and+the+future+of+mass+spectrometry+in+cell+biology.">Why proteomics is not the new genomics and the future of mass spectrometry in cell biology.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 21-24 (2017).</li></ol>

מכיוון פרוטאומיקס הוא כלי רב עוצמה כדי ללמוד הביטוי של חלבונים שונים תא שלם או תאים subcellular, אופטימיזציה של פרוטוקול פירוק תא ועיכול של חלבונים טופלה על ידי מספר מחקרים. יש שלוש מחלקות עיקריות של שיטות, הכוללים בג'ל עיכול (עיכול חלבונים במטריצת לזיהוי ג'ל)17, עיכול פתרון...

המקרופאגים הם תאים חיסוניים מולדת מעורב מספר פונקציות פיזיולוגיים ועד רקמות הומאוסטזיס, כולל הסרה של מוות תאים ו remodelling של מטריצה חוץ-תאית1תגובות למחלות זיהומיות. תאים אלה מאופיינים חזק פנוטיפית2 שמתרגמת מדינות רבות הפעלה אפשריים, אשר נקראים גם polarizations. תיאור מדויק מולקולרית של polarizations שונים אלה היא עדיפות בתחום הביולוגיה מקרופאג3. זה הוצע לסווג אלה polarizations באמצעות הדיכוטומיה M1/M2 כביכול, שבו M1 מייצג פרו דלקתיים ו M2 מייצג מקרופאגים אנטי דלקתיות. מודל זה מתאים גם מצבים פתולוגיים שונים כמו זיהומים חריפים, אלרגיה, השמנת יתר4. עם זאת, רקמות דלקתי כרוני, סרטן, זה הוכח כי סיווג זה אינו מסוגל להבין את הרפרטואר פנוטיפי הרחב שמציגים מקרופאגים מסוימים סביבות הסלולר5,6, 7. הקונצנזוס הנוכחי הוא מקרופאג קיטוב יותר מתואר באמצעות מודל רב-ממדי כדי לשלב את אותות מסוימים microenvironmental8. מסקנה זו אושרה באמצעות ניתוח transcriptomic של מקרופאגים האנושי מראה כי המודל M1/M2 הוא יעיל בתיאור שהושג polarizations9.
המחקר הציג שואפת לספק פרוטוקול להשיג חתימות פרוטיאומיה מבנית של polarizations שונים ב מקרופאגים אנושי. אנחנו מתארים כיצד להבדיל מקרופאגים האנושי בסביבות של רמות החמצן שונים ולקבל פפטידים פרוטאום מקרופאג כל לביצוע של כימות ללא תווית. כימות זו מאפשרת ההשוואה של רמות ביטוי של חלבונים שונים. כמו מחקר בתאי גזע חשף את חשיבות החמצן הסביבה פרמטר מפתח10, אנו שואפים להבין כיצד פרמטר רקמות יכולים להשפיע על קיטוב מקרופאג בבני אדם. לחץ חלקי של חמצן נמצאה בטווח מ-3 עד 20% (לחץ אטמוספרי סך) בגוף האדם, שבו 20% מקביל בערך מה הוא נפוץ של חממה התרבות התא (הערך המדויק הוא בסביבות 18.6% בזמן נטילת הנוכחות של מים בחשבון).
עבודה קודמים הראו כי מכתשי נבדלים בין-תאי מקרופאגים מ פונקציונלי, נקודת מורפולוגי של נופים11 וכי ההבדלים הללו הם כנראה חלקית עקב רמות החמצן שונים שאליהם הם חשופים12. יתר על כן, מקרופאגים הנגזרות מח עצם מראים יכולת מוגברת כדי phagocytize חיידקים כאשר הם נחשפים בסביבת חמצן נמוך12. האפקט ההפוך נמצאה עבור מקרופאגים האנושי הבדיל THP113, אך תוצאות אלו תומך את הרעיון כי חמצן הוא מווסת של ביולוגיה מקרופאג וכי זהו צורך להבהיר את התפקיד הזה ברמה המולקולרית בתוך המקרופאגים אנושי. במחקר הקודם, אנחנו החלת בגישה פרוטאומיקס לטיפול בבעיות אלה. על ידי מדידת רמות הביטוי אלפי חלבונים בו-זמנית, אנו הדגיש את ההשפעה של חמצן על קיטוב, מספק רשימה של סמנים מולקולריים חדשים. הצלחנו גם להתייחס ממצאים אלה כמה פונקציות מקרופאגים. ראוי לציין, מצאנו כי הקצב של phagocytosis של מוות תאים הוגדל ב IL4/IL13-מקוטב מקרופאגים, אשר היה קשור קולטנים upregulation של ALOX15 כפי ניתוח פרוטיאומיה מבנית14. במחקר הנוכחי, אנו נתאר כיצד לבצע ניתוח כזה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hypoxia Working Station</td>
			<td>Oxford Optronix</td>
			<td>Hypoxylab</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C6 Flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>Accuri C6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5188-6435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (FA)</td>
			<td>ARISTAR</td>
			<td>450122M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-250 Coomassie blue</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1,610,436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide, E.Coli (LPS)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>437627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2D clean-up kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>80-6484-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium, glutamax supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1 M</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) Solution 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harvard Apparatus column Reverse C18 micro spin column</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>74-4601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5 M, pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Bis-Tris 4-12%</td>
			<td>Life Technologies SAS</td>
			<td>NP0321 BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 Microbeads human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS separation column LS</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 4 (IL4)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 13 (IL13)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-112-410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interferon gamma (INF&#947;)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14-FITC (clone T&#220;K4)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-080-701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSmix Tube Rotator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic Acid (TFA)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>28904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/Lys-C Mix</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>V5073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Mini, EDTA-free Protease Inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density Gradient Solution (Histopaque 1077)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10771-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accumax</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7089-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum from human male AB plasma (SAB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4522-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) solution 30%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9576-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisma-base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>49767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>114405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 20%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>57670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiourea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C9426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL sterile plastic pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer C Eppendorf</td>
			<td>VWR</td>
			<td>460-0223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak tC18 reverse phase cartridges, 100 mg</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT036820</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proteomic analysis of human macrophage polarization under a low oxygen environment

המקרופאגים הם תאים חיסוניים מולדת מעורב מספר פונקציות פיזיולוגיים ועד תגובות למחלות זיהומיות רקמות הומאוסטזיס. הפונקציות השונות של תאים אלה קשורים הברית ההפעלה שלהם, אשר נקרא גם קיטוב. תיאור מדויק מולקולרית של polarizations שונים אלה היא עדיפות בתחום הביולוגיה מקרופאג. זה כרגע הוא הודה כי בגישה רב-ממדי הכרחי לתאר איך קיטוב נשלטת על ידי אותות סביבתיים. בדו ח זה, אנו מתארים פרוטוקול המיועד להשיג את החתימה פרוטיאומיה מבנית של polarizations שונים ב מקרופאגים אנושי. פרוטוקול זה מבוסס על כימות ללא תווית של ביטוי חלבון מקרופאג המתקבל בבית-ג'ל fractionated ותוכן פירוק התאית Lys C/טריפסין-מעוכלים. אנו מספקים גם פרוטוקול מבוסס על עיכול תוך-פתרון ו לגירויי כאב תוך התמקדות fractionation להשתמש כחלופה. בגלל ריכוז חמצן הוא פרמטר הסביבתיים הרלוונטיים ברקמות, אנו משתמשים בפרוטוקול זה לחקור את הרכב האטמוספירה איך או סביבה חמצן נמוך משפיע על הסיווג של מקרופאג קיטוב.

החל מ היקפיים תאי תאי דם (PBMCs) מתקבל על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית, הפרוטוקול מאפשר השגת אוכלוסייה של CD14+ ומונוציטים עם טוהר המוערך של יותר מ- 98% על ידי cytometry זרימה (איור 1). אלה ומונוציטים בגיחות מובחנים לכיוון polarizations השונות (איור 2). כאשר...

Watch this Scientific Journal Video about Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment at JoVE.com

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

אנו מציגים פרוטוקול כדי להשיג חתימות פרוטיאומיה מבנית של מקרופאגים האנושית ואת ליישם את זה נחישות ההשפעה של סביבה חמצן נמוך על מקרופאג קיטוב.

ניתוח פרוטיאומיה מבנית של קיטוב מקרופאג האנושי תחת סביבה חמצן נמוך

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

אז שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה מקרופאג, כגון כיצד לאפיין את מצב ההפעלה תחת סביבה רזה ברמת החלבון. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת את ההזדמנות לקבל ביטוי שונה של חלבונים רבים במקרופאגים אנושיים בשיטת כימות ללא תווית. הדגמת ההליך תהיה מארי מאליאר וחזור מגלי מהמעבדה שלי.כדי להתחיל, להוסיף 15 מיליליטר של פתרון הפרדת תאים הדרגתי צפיפות לתוך כל אחד משני צינורות צנטריפוגה 50 מיליליטר, כך הפתרון יכול להתחמם לטמפרטורת החדר לפני קבלת LRSC. זה חיוני כמו צפיפות תלויה בטמפרטורה. רוקן את ה-LRSC לצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר.מוסיפים 1x PBS עד 50 מיליליטר ומערבבים. לאחר מכן, לאט מאוד, להוסיף 25 מיליליטר של התערובת על גבי 15 מיליליטר של פתרון שיפוע צפיפות שיווי משקל. היזהר לא לערבב את השלבים במהלך שלב זה.יש להוסיף את הדם על פתרון שיפוע הצפיפות ללא כל הפרעה בשלב זה. צנטריפוגה שני צינורות צנטריפוגה במשך 25 דקות ב 700 G ללא הפסקות. בסוף צנטריפוגה הדרגתית צפיפות, השכבות מלמטה למעלה הם אריתרוציטים ו granulocytes, להרכיב את גלולה, שלב פתרון שיפוע צפיפות, שכבה של PBMCs, ואת הפלזמה מדולל.עם פיפטה, לעבור את שלב הפלזמה מבלי לשוות אותו. לאחר מכן, לאסוף את שכבת PBMC לתוך צינור צנטריפוגה חדש 50 מיליליטר. הוסף עד 50 מיליליטר של PBS 1x למחשבים כמערך כביסה וצנטריפוגה במשך 10 דקות ב 300 G.Aspirate supernatant ולהשעות מחדש את גלולה ב 40 מיליליטר של מדיום מקרופאג.לאחר הספה PBMCs בתא Malassez, להעביר את כמות PBMCs הדרושים לביצוע הניסוי לצינור צנטריפוגה. צנטריפוגה התאים במשך 10 דקות ב 300 G.Aspirate supernatant ולהשעות מחדש את גלולה ב 80 microliters של מאגר המיון לכל 10 מיליון PBMCs. לאחר מכן, הוסף 20 מיקרוליטרים של חיידקים CD14 לכל 10 מיליון PBMCs.מערבבים היטב, ודגירה במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס תחת תסיסה מתמדת. לאחר הדגירה, הוסף מיליליטר אחד של מאגר מיון לכל 10 מיליון PBMCs כצעד כביסה, וצנטריפוגה כבעבר. לאחר מכן, שאף את העל-טבעי והשהה מחדש את גלולת הכדור ב- 500 מיקרוליטרים של מאגר מיון לכל 100 מיליון מחשבים אישיים.עכשיו, למקם עמודה בשדה המגנטי של המפריד. הכן את העמודה על-ידי שטיפתה בשלושה מיליליטר של מאגר מיון. החל את ההשעיה של התא על העמודה.לאחר מכן לאסוף את הזרימה דרך המכיל תאים לא חגורים עבור כתמים הבאים, במידת הצורך. לשטוף את העמודה שלוש פעמים עם שלושה מיליליטר של חיץ מיון. היזהר לא לייבש את הטור שלך.לאחר מכן, מניחים צינור איסוף מתחת לעמודה ומסירים אותו מהמפריד. לאחר הכביסה, פיפטה חמישה מיליליטר של מאגר מיון לתוך העמודה. מיד לשטוף את התאים המסווים מגנטית על ידי בחוזקה דוחף את הבוכנה לתוך העמוד.לבסוף, חזור על שלבים אלה באמצעות עמודה חדשה לפני ציפוי המונוציטים וביצוע קיטוב המקרופאג' כמתואר בפרוטוקול הטקסט. שמור על המונוציטים והמאקרופאגים בסביבה הנשלטת על ידי חמצן כדי לבצע ניתוח מצב היפוקסי. השתמש בתחנת עבודה היפוקסיה על מנת לשמור על תאים תחת הלחץ החלקי חמצן הרצוי במהלך הניסוי.כאשר עובדים תחת לחץ חמצן נמוך, חשוב להכין את כל התקשורת ואת מאגרי הכביסה מתחת לתחנה, ולחכות מספיק כדי לקבל את הלחץ החלקי הנכון בנוזל. בצע תן תא במאגר מתחת למכסה המנוע המותאם. לטעון את החלבון שווה ערך של 300, 000 תאים עבור כל מדגם על 4-12%bis-tris אקרילאמיד ג'לים.שלוט במשך הנדידה האלקטרופורטית כדי לאפשר לכל דגימת חלבון להתפצל לשש להקות ג'ל כפי שמוצג כאן. לאחר תיקון וכתמים כמתואר בפרוטוקול הטקסט, יש למלמל את רצועות החלבון באזמל נקי. קוביות כל רצועה excised לפני הצבת אותם לתוך 500 צינורות microliter.עכשיו, לשטוף את פרוסות ג'ל שלוש פעמים ב 200 microliters של 25 מילימולר אמוניום ביקרבונט במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, השלכת אמוניום ביקרבונט בין כל צעד. בצע זאת עם שטיפה אחת ב 25 מילימולר אמוניום ביקרבונט ואצטוניטריל. לאחר מכן, לייבש את חתיכות ג'ל עם 200 microliters של 100% אצטוניטריל במשך 10 דקות.דגירה כל חתיכת ג'ל עם 10 מילימולר DTT ו 25 מילימולר אמוניום ביקרבונט במשך 45 דקות ב 56 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להשליך את DTT ו דגירה חתיכת ג'ל עם 55 מילימולרים iodoacetamide ב 25 מילימולר אמוניום ביקרבונט במשך 35 דקות בחושך בטמפרטורת החדר. כדי לעצור אלקילציה, להשליך את הפתרון בשימוש דגירה כל חתיכת ג'ל עם 200 microliters של 10 מילימולר DTT ב 25 מילימולר אמוניום ביקרבונט במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.לשטוף את חתיכות ג'ל 200 microliters של 25 מילימולר אמוניום ביקרבונט. לאחר מכן, להתייבש עם 200 microliters של 100% אצטוניטריל במשך 10 דקות. לעכל את החלבונים לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם טריפסין / Lys-C לערבב על פי הוראות היצרן.יש לחלץ את הפפטידים המתקבלים מפיסות ג'ל על ידי הוספת 50 מיקרוליטרים של 50% אצטוניטריל למשך 15 דקות בצינורות בעלי ספיגה נמוכה. לאחר הוספת 50 microliters של 5% חומצה פורמית במשך 15 דקות, להוסיף 50 microliters של 100% אצטוניטריל במשך 15 דקות. משוך וייבש כל שבר בצינורות ספיגה נמוכה כדי להגביל את ספיגת הפפטידים ואובדן הדגימה.אחסן את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס עד לניתוח נוסף כמפורט בפרוטוקול הטקסט. מוצג כאן הוא טוהר מייצג מוערך על ידי cytometry זרימה בעקבות בחירת חרוזים מגנטיים של CD14 מונוציטים חיוביים. הדמיית ניגודיות פאזה של מקרופאגים אנושיים מובחנים מראה הטרוגניות של מורפולוגיות שהושגו עבור שני קיטובים שונים לאחר תשעה ימים של תרבות.דוגמה לעיכול מחוץ לג'ל באמצעות ג'לים דף SDS מוכתמים כסף מוצג. הערכה של חלבון מתזה התא ולאחר עיכול בתסיסה מראה את היעדר השפלה במהלך תזה ואת היעילות של העיכול. מוצג כאן דוגמה של ספקטרום דיסוציאציה הנגרמת על ידי התנגשות של פפטיד נמצא ביחס מסה לטעינה של 597.29 על הספקטרום MS עם מטען חשמלי של חיובי שני.מתוך ספקטרום זה, הרצף המתאים נקבע. התוצאה הסופית לאחר הניתוח היא מפת חום המייצגת את הקיבוץ ההיררכי של כל מצבי הקיטוב באמצעות חלבונים המובעים באופן דיפרנציאלי. ניתוח מגלה מקבץ של חלבונים יתר על כן לידי ביטוי בכל הקיטובים במצב 3%חמצן.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי אתה צריך להחליט תחילה איזה סוג של שבר תבצע על דגימות חדשות כדי להתאים את הפרוטוקול שלך בהתאם. הגישה הפרוטומית המשתמשת בעבודה זו משלימה גישות גנומיות ששימשו בשנים האחרונות בתחום מחקרי הקיטוב בביולוגיה מקרופאגים. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקר בתחום האימונולוגיה לחקור את מצבי ההפעלה השונים של תאי החיסון בבני אדם וגם ביונקים אחרים.אל תשכח כי עבודה עם DTT יכול להיות מסוכן אז אתה צריך לעבוד תחת מכסה המנוע מותאם לעשות את ההליך הזה.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

דיסקציה של הרשתית האנושית ואת RPE-Choroid לניתוח פרוטיאומיה מבנית

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

פיצול-BioID — ניתוח פרוטיאומיה מבנית של חלבון ספציפי ההקשר מתחמי הסלולר בסביבתם הטבעית

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

דגימה רעלני של זגוגית השן פחמתי פחמן יציב וניתוח איזוטופ החמצן

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

פרוטיאומיה מבנית ודינמיקה miRNA ניתוח של Polysomes מן הלב העכבר מבודדים לאחר זלוף Langendorff

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

ללא כיול במבחנה כימות של חלבון ההומו-oligomerization באמצעות מכשור מסחרי ותוכנות אנליזה של בהירות חינם, קוד פתוח

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

חלבון אנאירובית טיהור וניתוח קינטי באמצעות אלקטרודה חמצן ללמוד DesB Dioxygenase פעילות וניגוד

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

מדידת ופרשנות חמצן קצב הצריכה כולה לטוס הראש מקטעים

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

מחקר על חילוף החומרים של שישה קוטלי חרקים מערכתית החדש הוקמה התא תרבות ההשעיה נגזר תה (Camellia Sinensis L.) עלים

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...