Name: proteomic analysis of human macrophage polarization under a low oxygen environment
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment at JoVE.com

AM युवा समूह के नेता कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित है (ातिप/Avenir Inserm-CNRS), ला Ligue राष्ट्रीयकृत contre le कैंसर और ला शौकीन चाप डालो ला सभ्य सुर le कैंसर द्वारा । हम मास स्पेक्ट्रोमेट्री फॉर बायोलॉजी प्लेटफार्म (UTECHS MSBIO, पाश्चर इंस्टीट्यूट, पेरिस) से Mariette Matondo का धन्यवाद करते हैं । हम उसे पांडुलिपि के पढ़ने के लिए लॉरेन एंडरसन धंयवाद ।

मानव रक्त के नमूनों (LRSC) से स्वस्थ, de-पहचान दाताओं EFS (फ्रेंच राष्ट्रीय रक्त सेवा) से एक अधिकृत प्रोटोकॉल के भाग के रूप में प्राप्त किए गए (CODECOH डीसी-2018-3114) । रक्तदाताओं ने रक्त के उपयोग के लिए हस्ताक्षरित सहमति ?...

<ol>
	<li>Okabe, Y., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+biology+perspective+on+macrophages.">Tissue biology perspective on macrophages.</a> Nature Immunology. 17 (1), 9-17 (2016).</li><li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+plasticity+and+polarization:+in+vivo+veritas.">Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).</li><li>Murray, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+Polarization.">Macrophage Polarization.</a> Annual Review of Physiology. 79, 541-566 (2017).</li><li>Chinetti-Gbaguidi, G., Staels, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+polarization+in+metabolic+disorders:+functions+and+regulation.">Macrophage polarization in metabolic disorders: functions and regulation.</a> Current Opinion in Lipidology. 22 (5), 365-372 (2011).</li><li>Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+mononuclear+phagocyte+system+in+the+molecular+age.">Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).</li><li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation.">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).</li><li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets.">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).</li><li>Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+multidimensional+concept+of+macrophage+ontogeny,+activation+and+function.">New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function.</a> Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).</li><li>Xue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-based+network+analysis+reveals+a+spectrum+model+of+human+macrophage+activation.">Transcriptome-based network analysis reveals a spectrum model of human macrophage activation.</a> Immunity. 40 (2), 274-288 (2014).</li><li>Csete, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+in+the+cultivation+of+stem+cells.">Oxygen in the cultivation of stem cells.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1049, 1-8 (2005).</li><li>Johansson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional,+morphological,+and+phenotypical+differences+between+rat+alveolar+and+interstitial+macrophages.">Functional, morphological, and phenotypical differences between rat alveolar and interstitial macrophages.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 16 (5), 582-588 (1997).</li><li>Pfau, J. C., Schneider, J. C., Archer, A. J., Sentissi, J., Leyva, F. J., Cramton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+oxygen+tension+affects+phenotype+in+cultured+bone+marrow-derived+macrophages.">Environmental oxygen tension affects phenotype in cultured bone marrow-derived macrophages.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (2), L354-L362 (2004).</li><li>Grodzki, A. C. G., Giulivi, C., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+tension+modulates+differentiation+and+primary+macrophage+functions+in+the+human+monocytic+THP-1+cell+line.">Oxygen tension modulates differentiation and primary macrophage functions in the human monocytic THP-1 cell line.</a> PLoS One. 8 (1), e54926 (2013).</li><li>Court, M., Petre, G., Atifi, M. E., Millet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Signature+Reveals+Modulation+of+Human+Macrophage+Polarization+and+Functions+Under+Differing+Environmental+Oxygen+Conditions.">Proteomic Signature Reveals Modulation of Human Macrophage Polarization and Functions Under Differing Environmental Oxygen Conditions.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 16 (12), 2153-2168 (2017).</li><li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+proteome-wide+label-free+quantification+by+delayed+normalization+and+maximal+peptide+ratio+extraction,+termed+MaxLFQ.">Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).</li><li>Cox, J., Neuhauser, N., Michalski, A., Scheltema, R. A., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Andromeda:+a+peptide+search+engine+integrated+into+the+MaxQuant+environment.">Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment.</a> Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).</li><li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes.">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li><li>Court, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+standardized+urine+proteome+analysis+methodology.">Toward a standardized urine proteome analysis methodology.</a> Proteomics. 11 (6), 1160-1171 (2011).</li><li>Wi&#347;niewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).</li><li>Liebler, D. C., Ham, A. -. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spin+filter-based+sample+preparation+for+shotgun+proteomics.">Spin filter-based sample preparation for shotgun proteomics.</a> Nature Methods. 6 (11), 785-786 (2009).</li><li>Hubner, N. C., Ren, S., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+separation+with+immobilized+pI+strips+is+an+attractive+alternative+to+in-gel+protein+digestion+for+proteome+analysis.">Peptide separation with immobilized pI strips is an attractive alternative to in-gel protein digestion for proteome analysis.</a> Proteomics. 8 (23-24), 4862-4872 (2008).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Informed-Proteomics:+open-source+software+package+for+top-down+proteomics.">Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics.</a> Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).</li><li>Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+oxygen+and+culture+media+on+plating+efficiency+of+some+mammalian+tissue+cells.">Influence of oxygen and culture media on plating efficiency of some mammalian tissue cells.</a> Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).</li><li>Packer, L., Fuehr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+oxygen+concentration+extends+the+lifespan+of+cultured+human+diploid+cells.">Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells.</a> Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).</li><li>Lengner, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+pre-X+inactivation+human+embryonic+stem+cells+under+physiological+oxygen+concentrations.">Derivation of pre-X inactivation human embryonic stem cells under physiological oxygen concentrations.</a> Cell. 141 (5), 872-883 (2010).</li><li>Sidoli, S., Kulej, K., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+proteomics+is+not+the+new+genomics+and+the+future+of+mass+spectrometry+in+cell+biology.">Why proteomics is not the new genomics and the future of mass spectrometry in cell biology.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 21-24 (2017).</li></ol>

क्योंकि प्रोटियोमिक् एक पूरे सेल या सेलुलर डिब्बों से अलग प्रोटीन की अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है, कोशिका lysis प्रोटोकॉल और प्रोटीन के पाचन का अनुकूलन अध्ययन के एक नंबर से संबो?...

मैक्रोफेज जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं को संक्रामक रोगजनकों के लिए प्रतिक्रियाओं से ऊतक homeostasis को लेकर शारीरिक कार्यों की एक संख्या में शामिल हैं, अपोप्तोटिक कोशिकाओं को हटाने और extracellular मैट्रिक्स1के पुननिर्माण सहित । इन कोशिकाओं को एक मजबूत phenotypic प्लास्टिक2 कि एक बहुत संभव सक्रियण राज्यों, जो भी ध्रुवीकरण कहा जाता है में तब्दील द्वारा विशेषता है । इन विभिंन ध्रुवीकरण का सटीक आणविक वर्णन मैक्रोफेज जीव विज्ञान के क्षेत्र में एक प्राथमिकता है3। यह तथाकथित m1/m2 विरोधाभास का उपयोग कर इन ध्रुवीकरण को वर्गीकृत करने का प्रस्ताव किया गया है, जिसमें m1 समर्थक भड़काऊ का प्रतिनिधित्व करता है और m2 विरोधी भड़काऊ मैक्रोफेज का प्रतिनिधित्व करता है । यह मॉडल तीव्र संक्रमण, एलर्जी, और मोटापा4जैसे विभिन्न रोग स्थितियों में अच्छी तरह से फिट बैठता है । हालांकि, जीर्ण सूजन के ऊतकों और कैंसर में, यह प्रदर्शित किया गया है कि इस वर्गीकरण के लिए व्यापक phenotypic प्रदर्शनों कि मैक्रोफेज कुछ सेलुलर वातावरण में मौजूद5,6समझ में असमर्थ है, 7. वर्तमान आम सहमति है कि मैक्रोफेज ध्रुवीकरण बेहतर एक बहुआयामी मॉडल का उपयोग करने के लिए एकीकृत विशिष्ट microenvironmental संकेतों8वर्णित है । इस निष्कर्ष में मानव मैक्रोफेज के transcriptomic विश्लेषण के माध्यम से पुष्टि की गई है कि एम1/M2 मॉडल प्राप्त ध्रुवीकरण9का वर्णन करने में असक्षम है ।
प्रस्तुत अध्ययन में मानव मैक्रोफेज में विभिन्न ध्रुवीकरण के proteomic हस्ताक्षर प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करना है । हम विभिंन ऑक्सीजन के स्तर के वातावरण में मानव मैक्रोफेज अंतर करने के लिए और एक लेबल मुक्त ठहराव प्रदर्शन करने के लिए पूरे मैक्रोफेज proteome से पेप्टाइड्स प्राप्त करने के लिए कैसे का वर्णन । यह ठहराव विभिन्न प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर की तुलना की अनुमति देता है । के रूप में स्टेम सेल पर अनुसंधान एक पर्यावरणीय कुंजी पैरामीटर10के रूप में ऑक्सीजन के महत्व से पता चला है, हम समझ कैसे इस ऊतक पैरामीटर मानव में मैक्रोफेज ध्रुवीकरण को प्रभावित कर सकते है की तलाश । ऑक्सीजन का आंशिक दबाव मानव शरीर में 3 से 20% (कुल वायुमंडलीय दबाव) की सीमा को पाया गया है, जहां 20% मोटे तौर पर क्या आमतौर पर एक सेल संस्कृति मशीन में इस्तेमाल किया जाता है (सटीक मूल्य के आसपास है १८.६% जबकि पानी की उपस्थिति लेने खाते में) ।
पिछले काम से पता चला है कि वायुकोशीय मध्य मैक्रोफेज से कार्यात्मक और दृष्टिकोण11 के रूपात्मक बिंदु से अलग है और यह कि इन मतभेदों को शायद आंशिक रूप से विभिंन ऑक्सीजन का स्तर है जो वे12उजागर कर रहे है के कारण हैं । इसके अलावा, अस्थि मज्जा-व्युत्पंन मैक्रोफेज बैक्टीरिया phagocytize करने के लिए एक वृद्धि की क्षमता दिखाने के लिए जब एक कम ऑक्सीजन पर्यावरण12से अवगत कराया । THP1-विभेदित मानव मैक्रोफेज१३के लिए विपरीत प्रभाव पाया गया है, लेकिन ये परिणाम इस विचार का समर्थन करते हैं कि ऑक्सीजन मैक्रोफेज बायोलॉजी का एक नियामक है और यह मानव मैक्रोफेज में आणविक स्तर पर इस भूमिका को स्पष्ट करने के लिए आवश्यक है. पिछले एक अध्ययन में, हम इन मुद्दों को हल करने के लिए एक प्रोटियोमिक् दृष्टिकोण लागू किया है । एक साथ प्रोटीन के हजारों के लिए अभिव्यक्ति के स्तर को मापने के द्वारा, हम ध्रुवीकरण पर ऑक्सीजन के प्रभाव पर प्रकाश डाला और नए आणविक मार्करों की एक सूची प्रदान की । हम भी कुछ मैक्रोफेज कार्यों के लिए इन निष्कर्षों से संबंधित करने में सक्षम थे । विशेष रूप से, हमने पाया है कि अपोप्तोटिक कोशिकाओं के phagocytosis की दर IL4 में वृद्धि हुई थी/IL13-ध्रुवीकरण मैक्रोफेज, जो ALOX15 के विनियमन से जुड़ा हुआ था के रूप में proteomic विश्लेषण14द्वारा प्रगट । वर्तमान अध्ययन में, हम इस तरह के एक विश्लेषण करने के लिए कैसे का वर्णन ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hypoxia Working Station</td>
			<td>Oxford Optronix</td>
			<td>Hypoxylab</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C6 Flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>Accuri C6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5188-6435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (FA)</td>
			<td>ARISTAR</td>
			<td>450122M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-250 Coomassie blue</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1,610,436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide, E.Coli (LPS)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>437627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2D clean-up kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>80-6484-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium, glutamax supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1 M</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) Solution 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harvard Apparatus column Reverse C18 micro spin column</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>74-4601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5 M, pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Bis-Tris 4-12%</td>
			<td>Life Technologies SAS</td>
			<td>NP0321 BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 Microbeads human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS separation column LS</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 4 (IL4)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 13 (IL13)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-112-410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interferon gamma (INF&#947;)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14-FITC (clone T&#220;K4)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-080-701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSmix Tube Rotator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic Acid (TFA)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>28904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/Lys-C Mix</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>V5073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Mini, EDTA-free Protease Inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density Gradient Solution (Histopaque 1077)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10771-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accumax</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7089-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum from human male AB plasma (SAB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4522-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) solution 30%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9576-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisma-base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>49767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>114405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 20%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>57670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiourea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C9426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL sterile plastic pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer C Eppendorf</td>
			<td>VWR</td>
			<td>460-0223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak tC18 reverse phase cartridges, 100 mg</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT036820</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proteomic analysis of human macrophage polarization under a low oxygen environment

मैक्रोफेज जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं को ऊतक homeostasis के लिए संक्रामक रोगजनकों प्रतिक्रियाओं से लेकर शारीरिक कार्यों की एक संख्या में शामिल हैं । इन कोशिकाओं के विभिंन कार्यों उनके सक्रियण राज्यों से संबंधित हैं, जो भी ध्रुवीकरण कहा जाता है । इन विभिन्न ध्रुवीकरण का सटीक आणविक वर्णन मैक्रोफेज जीव विज्ञान के क्षेत्र में एक प्राथमिकता है । यह वर्तमान में स्वीकार किया है कि एक बहुआयामी दृष्टिकोण का वर्णन कैसे ध्रुवीकरण पर्यावरण संकेतों से नियंत्रित है आवश्यक है । इस रिपोर्ट में, हम मानव मैक्रोफेज में विभिन्न ध्रुवीकरण के proteomic हस्ताक्षर प्राप्त करने के लिए डिज़ाइन किए गए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं । इस प्रोटोकॉल में जेल fractionated और Lys सी/trypsin-डाइजेस्ट सेलुलर lysis सामग्री से प्राप्त मैक्रोफेज प्रोटीन अभिव्यक्ति की एक लेबल मुक्त ठहराव पर आधारित है । हम भी एक विकल्प के रूप में उपयोग करने के लिए में समाधान पाचन और isoelectric ध्यान केंद्रित भिन्नीकरण पर आधारित एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । क्योंकि ऑक्सीजन एकाग्रता ऊतकों में एक प्रासंगिक पर्यावरण पैरामीटर है, हम इस प्रोटोकॉल का उपयोग कैसे वायुमंडलीय संरचना या एक कम ऑक्सीजन पर्यावरण मैक्रोफेज ध्रुवीकरण के वर्गीकरण को प्रभावित करता है का पता लगाने के लिए ।

परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं से शुरू (PBMCs) विभेदक केंद्रापसारक द्वारा प्राप्त की, प्रोटोकॉल CD14 की आबादी के प्राप्त करने परमिट+ monocytes से अधिक ९८% की एक आकलन शुद्धता के साथ प्रवाह cytometry (चित?...

Watch this Scientific Journal Video about Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment at JoVE.com

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

हम मानव मैक्रोफेज के proteomic हस्ताक्षर प्राप्त करने और मैक्रोफेज ध्रुवीकरण पर एक कम ऑक्सीजन पर्यावरण के प्रभाव के निर्धारण के लिए इस लागू करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं ।

एक कम ऑक्सीजन पर्यावरण के तहत मानव मैक्रोफेज ध्रुवीकरण का Proteomic विश्लेषण

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

इसलिए यह विधि मैक्रोफेज जीव विज्ञान क्षेत्र में महत्वपूर्ण प्रश्नों का उत्तर देने में मदद कर सकती है, जैसे कि प्रोटीन स्तर पर विभिन्न पर्यावरण के तहत सक्रियण की स्थिति की विशेषता कैसे हो। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह लेबल-मुक्त मात्राकरण विधि का उपयोग करके मानव मैक्रोफेज में कई प्रोटीन की अलग अभिव्यक्ति प्राप्त करने का अवसर प्रदान करता है। प्रक्रिया का प्रदर्शन मेरी प्रयोगशाला से मैरी मालियर और मगली कोर्ट होगा।शुरू करने के लिए, दो 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों में से प्रत्येक में घनत्व ढाल सेल सेपरेशन समाधान के 15 मिलीलीटर जोड़ें ताकि समाधान एलआरएससी प्राप्त करने से पहले कमरे के तापमान तक गर्म हो सके। यह आवश्यक है क्योंकि घनत्व तापमान पर निर्भर करता है। एलआरएससी को 50 मिलीलीटर सेंट्रलाइजिंग ट्यूब में खाली करें।50 मिलीलीटर तक 1x पीबीएस जोड़ें और मिलाएं। फिर, बहुत धीरे-धीरे, 15 मिलीलीटर समकांपित घनत्व ढाल समाधान के शीर्ष पर मिश्रण के 25 मिलीलीटर जोड़ें। इस चरण के दौरान चरणों को न मिलाएं।रक्त को इस चरण की किसी भी गड़बड़ी के बिना घनत्व ढाल समाधान पर जोड़ा जाना चाहिए। अपकेंद्रित्र दोनों अपकेंद्रित्र ट्यूब 25 मिनट के लिए ७०० जी पर टूट के बिना । घनत्व ढाल अपकेंद्रित्र के अंत में, नीचे से ऊपर तक की परतें एरिथ्रोसाइट्स और ग्रेनुलोसाइट्स हैं, जो गोली, घनत्व ढाल समाधान चरण, पीबीएमसी की एक परत और पतला प्लाज्मा बनाती हैं।एक पिपेट के साथ, प्लाज्मा चरण से गुजरें, इसे बिना किसी रूप में देखे। फिर, पीबीएमसी परत को एक नई 50 मिलीलीटर सेंट्रलाइजिंग ट्यूब में इकट्ठा करें। 300 जी पर 10 मिनट के लिए एक वाशिंग सेटअप और अपकेंद्रित्र के रूप में पीबीएमसी में 1x पीबीएस के 50 मिलीलीटर तक जोड़ें और मैक्रोफेज माध्यम के 40 मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें।एक मलासेज कक्ष में पीबीएमसी का काउचिंग करने के बाद, प्रयोग को अपकेंद्रित्र ट्यूब में आयोजित करने के लिए आवश्यक पीबीएमएमसी की राशि स्थानांतरित करें। 300 जी पर 10 मिनट के लिए कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें और 10 मिलियन पीबीएमसी प्रति छंटाई बफर के 80 माइक्रोलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें। फिर, प्रति 10 मिलियन पीबीएमसी सीडी 14 माइक्रोमोतियों के 20 माइक्रोलीटर जोड़ें।अच्छी तरह से मिलाएं, और लगातार आंदोलन के तहत 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, एक वाशिंग चरण के रूप में प्रति 10 मिलियन पीबीएमसी छंटाई बफर का एक मिलीलीटर जोड़ें, और पहले की तरह अपकेंद्रित्र करें। फिर, सुपरनेट को एस्पिरेट करें और प्रति 100 मिलियन पीबीएमसी बफर छंटाई के 500 माइक्रोलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें।अब सेपरेटर के चुंबकीय क्षेत्र में एक कॉलम रखें। इसे तीन मिलीलीटर छंटाई बफर के साथ कुल्ला करके कॉलम तैयार करें। कॉलम पर सेल निलंबन लागू करें।फिर यदि आवश्यक हो तो बाद में धुंधला करने के लिए अवेलेबल कोशिकाओं वाले माध्यम से प्रवाह एकत्र करें। कॉलम को तीन बार छंटाई बफर के तीन मिलीलीटर के साथ धोएं। अपने कॉलम को सुखाएं नहीं, इसका ध्यान रखें।इसके बाद कॉलम के नीचे कलेक्शन ट्यूब रखें और सेपरेटर से निकाल दें। धोने के बाद, कॉलम में बफर छंटाई के पांच मिलीलीटर पिपेट। तुरंत स्तंभ में प्लंजर को मजबूती से धकेलकर चुंबकीय रूप से लेबल वाली कोशिकाओं को बाहर निकालें।अंत में, मोनोसाइट्स चढ़ाना और पाठ प्रोटोकॉल में वर्णित मैक्रोफेज ध्रुवीकरण प्रदर्शन करने से पहले एक नए कॉलम के साथ इन चरणों को दोहराएं। हाइपोक्सिक स्थिति विश्लेषण करने के लिए ऑक्सीजन नियंत्रित वातावरण में मोनोसाइट्स और मैक्रोफेज को बनाए रखें। प्रयोग के दौरान वांछित ऑक्सीजन आंशिक दबाव के तहत कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए एक हाइपोक्सिया वर्किंग स्टेशन का उपयोग करें।कम ऑक्सीजन दबाव के तहत काम करते समय, स्टेशन के नीचे सभी मीडिया और वाशिंग बफ़र्स तैयार करना महत्वपूर्ण है, और तरल में सही आंशिक दबाव प्राप्त करने के लिए पर्याप्त प्रतीक्षा करें। एक अनुकूलित हुड के तहत एक बफर में सेल लाइसिस करें। 4-12% बीआईएस-ट्राइस एक्रिलामाइड जैल पर प्रत्येक नमूने के लिए 300, 000 कोशिकाओं के बराबर प्रोटीन लोड करें।प्रत्येक प्रोटीन नमूने को छह जेल बैंड में विभाजित करने की अनुमति देने के लिए इलेक्ट्रोफोरेटिक माइग्रेशन की अवधि को नियंत्रित करें जैसा कि यहां दिखाया गया है। पाठ प्रोटोकॉल में वर्णित फिक्सिंग और धुंधला होने के बाद, प्रोटीन बैंड को साफ स्केलपेल के साथ उत्पादित करें। उन्हें 500 माइक्रोलीटर ट्यूबों में रखने से पहले प्रत्येक उत्पादित बैंड पासा।अब, 25 मिलीमोलर अमोनियम बाइकार्बोनेट के 200 माइक्रोलीटर में जेल स्लाइस को 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए धोएं, प्रत्येक चरण के बीच अमोनियम बाइकार्बोनेट को त्याग दें। 25 मिलीमोलर अमोनियम बाइकार्बोनेट और एसीटोनिट्रिल में एक वॉश के साथ इसका पालन करें। फिर, 10 मिनट के लिए 100% एसीटोनिट्रिल के 200 माइक्रोलीटर के साथ जेल के टुकड़ों को निर्जलित करें।प्रत्येक जेल टुकड़े को 10 मिलीमोलर डीटीटी और 25 मिलीमोलर अमोनियम बाइकार्बोनेट के साथ 56 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। फिर, डीटीटी को त्यागें और कमरे के तापमान पर अंधेरे में 35 मिनट के लिए 25 मिलीमोलर अमोनियम बाइकार्बोनेट में 55 मिलीमोलर आयोडोसेमाइड के साथ जेल के टुकड़े को इनक्यूबेट करें। एल्किलेशन को रोकने के लिए, उपयोग किए गए समाधान को त्यागें और प्रत्येक जेल टुकड़े को कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 25 मिलीमोलर अमोनियम बाइकार्बोनेट में 10 मिलीमोलर डीटीटी के 200 माइक्रोलीटर के साथ इनक्यूबेट करें।25 मिलीमोलर अमोनियम बाइकार्बोनेट के 200 माइक्रोलीटर में जेल के टुकड़ों को धोएं। फिर, 10 मिनट के लिए 100% एसीटोनीट्रिल के 200 माइक्रोलीटर के साथ निर्जलित करें। निर्माता के निर्देशों के अनुसार ट्रिप्सिन/Lys-सी मिक्स के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्रोटीन को पचा लें ।कम अवशोषण ट्यूबों में 15 मिनट के लिए 50% एसीटोनिट्रिल के 50 माइक्रोलीटर जोड़कर जेल के टुकड़ों से परिणामी पेप्टाइड्स निकालें। 15 मिनट के लिए 5% फोर्मिक एसिड के 50 माइक्रोलीटर जोड़ने के बाद, 15 मिनट के लिए 100% एसीटोनिट्रिल के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें। पेप्टाइड्स और नमूना हानि के अवशोषण को सीमित करने के लिए कम अवशोषण ट्यूबों में प्रत्येक अंश को खींचें और सुखाएं।पाठ प्रोटोकॉल में विस्तृत के रूप में आगे के विश्लेषण तक 80 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को स्टोर करें। यहां दिखाया गया है कि सीडी 14 सकारात्मक मोनोसाइट्स के चुंबकीय मनका चयन के बाद प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा मूल्यांकन प्रतिनिधि शुद्धता है। विभेदित मानव मैक्रोफेज के चरण विपरीत इमेजिंग संस्कृति के नौ दिनों के बाद दो अलग ध्रुवीकरण के लिए प्राप्त मॉर्फोलोजी की विषमता दिखाते हैं।चांदी से सना हुआ एसडीएस पेज जैल का उपयोग करके ऑफ-जेल पाचन का एक उदाहरण दिखाया गया है। कोशिका लाइसिस से प्रोटीन का मूल्यांकन और समाधान के बाद पाचन में लाइसिस के दौरान गिरावट की अनुपस्थिति और पाचन की दक्षता को दर्शाता है। यहां दिखाया गया है कि सकारात्मक दो के इलेक्ट्रिक चार्ज के साथ एमएस स्पेक्ट्रम पर ५९७.२९ के बड़े पैमाने पर चार्ज अनुपात में पाए जाने वाले पेप्टाइड के टकराव-प्रेरित वियोजन स्पेक्ट्रम का एक उदाहरण है ।इस स्पेक्ट्रम से, इसी अनुक्रम का निर्धारण किया गया था। विश्लेषण के बाद अंतिम परिणाम एक गर्मी नक्शा है जो अंतर-व्यक्त प्रोटीन का उपयोग करके सभी ध्रुवीकरण राज्यों के पदानुक्रमित क्लस्टरिंग का प्रतिनिधित्व करता है। विश्लेषण से पता चलता है प्रोटीन के एक समूह पर 3% ऑक्सीजन की स्थिति में सभी ध्रुवीकरण में व्यक्त की ।इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि आपको पहले यह तय करना होगा कि आप अपने प्रोटोकॉल को तदनुसार अनुकूलित करने के लिए नए नमूनों पर किस तरह का आंशिक प्रदर्शन करेंगे। इस कार्य का उपयोग करने वाला प्रोटेओमिक दृष्टिकोण जीनोमिक दृष्टिकोणों के पूरक है जिनका उपयोग पिछले वर्षों के दौरान मैक्रोफेज जीवविज्ञान ध्रुवीकरण अध्ययन के क्षेत्र में किया गया है। इसके विकास के बाद, यह तकनीक इम्यूनोलॉजी के क्षेत्र में शोधकर्ता के लिए मनुष्यों में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की सक्रियता के विभिन्न राज्यों का पता लगाने और अन्य स्तनधारियों में भी मार्ग प्रशस्त करती है।यह न भूलें कि डीटीटी के साथ काम करना खतरनाक हो सकता है ताकि आपको इस प्रक्रिया को करने के लिए एक अनुकूलित हुड के तहत काम करने की आवश्यकता हो।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

ब्लू मूल निवासी पृष्ठ और प्रोटीन सहसंबंध रूपरेखा द्वारा समानता शुद्ध प्रोटीन परिसरों का समाधान करना

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

मानव रेटिना और RPE के विच्छेदन-Proteomic विश्लेषण के लिए धमनियां

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

भाजित-BioID-Proteomic उनके देशी सेलुलर वातावरण में संदर्भ विशिष्ट प्रोटीन परिसरों का विश्लेषण

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

नमूना और स्थिर कार्बन और ऑक्सीजन आइसोटोप विश्लेषण के लिए दांत तामचीनी कार्बोनेट के उपचार

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

गतिशील Proteomic और Langendorff छिड़काव के बाद अलग माउस दिल से Polysomes के miRNA विश्लेषण

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

अंशांकन-मुक्त इन विट्रो ठहराव में प्रोटीन होमो-oligomerization का उपयोग कर वाणिज्यिक इंस्ट्रूमेंटेशन और नि: शुल्क, खुला स्रोत चमक विश्लेषण सॉफ्टवेयर

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Anaerobic प्रोटीन शुद्धि और काइनेटिक विश्लेषण DesB Dioxygenase गतिविधि और संकोच का अध्ययन करने के लिए ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड के माध्यम से

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

मापने और पूरे मक्खी प्रमुख क्षेत्रों में ऑक्सीजन की खपत दर की व्याख्या

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

चाय से व्युत्पन्न एक नव स्थापित सेल निलंबन संस्कृति में छह प्रणालीगत कीटनाशक के चयापचय पर अध्ययन(कैमेलिया Sinensis एल.) पत्ते

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...