Name: proteomic analysis of human macrophage polarization under a low oxygen environment
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment at JoVE.com

AM è finanziato dal programma Leader di gruppo di giovani (ATIP/Avenir Inserm-CNRS), la Ligue Nationale contre le Cancer e la ARC Fondation pour la recherche sur le Cancer. Ringraziamo Mariette Matondo dalla spettrometria di massa per la piattaforma di biologia (UTECHS MSBIO, Istituto Pasteur, Parigi). Ringraziamo Lauren Anderson per la sua lettura del manoscritto.

Campioni di sangue umano (LRSC) da donatori sani, de-identificati sono stati ottenuti da EFS (servizio nazionale di sangue francese) come parte di un protocollo autorizzato (CODECOH DC-2018 – 3114). I donatori hanno dato il consenso firmato per l'uso di sangue.
1. Media e preparazione di Buffer
<ol><li>Preparare il supporto di macrofago [glutamax RPMI + 10 mM HEPES + 1 x aminoacidi non essenziali (NEAA)] e riscaldarla a 37 ° C.</li>
	<li>Preparare il macrofago medium + 10% di siero umano ...

<ol>
	<li>Okabe, Y., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+biology+perspective+on+macrophages.">Tissue biology perspective on macrophages.</a> Nature Immunology. 17 (1), 9-17 (2016).</li><li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+plasticity+and+polarization:+in+vivo+veritas.">Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).</li><li>Murray, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+Polarization.">Macrophage Polarization.</a> Annual Review of Physiology. 79, 541-566 (2017).</li><li>Chinetti-Gbaguidi, G., Staels, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+polarization+in+metabolic+disorders:+functions+and+regulation.">Macrophage polarization in metabolic disorders: functions and regulation.</a> Current Opinion in Lipidology. 22 (5), 365-372 (2011).</li><li>Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+mononuclear+phagocyte+system+in+the+molecular+age.">Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).</li><li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation.">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).</li><li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets.">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).</li><li>Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+multidimensional+concept+of+macrophage+ontogeny,+activation+and+function.">New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function.</a> Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).</li><li>Xue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-based+network+analysis+reveals+a+spectrum+model+of+human+macrophage+activation.">Transcriptome-based network analysis reveals a spectrum model of human macrophage activation.</a> Immunity. 40 (2), 274-288 (2014).</li><li>Csete, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+in+the+cultivation+of+stem+cells.">Oxygen in the cultivation of stem cells.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1049, 1-8 (2005).</li><li>Johansson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional,+morphological,+and+phenotypical+differences+between+rat+alveolar+and+interstitial+macrophages.">Functional, morphological, and phenotypical differences between rat alveolar and interstitial macrophages.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 16 (5), 582-588 (1997).</li><li>Pfau, J. C., Schneider, J. C., Archer, A. J., Sentissi, J., Leyva, F. J., Cramton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+oxygen+tension+affects+phenotype+in+cultured+bone+marrow-derived+macrophages.">Environmental oxygen tension affects phenotype in cultured bone marrow-derived macrophages.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (2), L354-L362 (2004).</li><li>Grodzki, A. C. G., Giulivi, C., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+tension+modulates+differentiation+and+primary+macrophage+functions+in+the+human+monocytic+THP-1+cell+line.">Oxygen tension modulates differentiation and primary macrophage functions in the human monocytic THP-1 cell line.</a> PLoS One. 8 (1), e54926 (2013).</li><li>Court, M., Petre, G., Atifi, M. E., Millet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Signature+Reveals+Modulation+of+Human+Macrophage+Polarization+and+Functions+Under+Differing+Environmental+Oxygen+Conditions.">Proteomic Signature Reveals Modulation of Human Macrophage Polarization and Functions Under Differing Environmental Oxygen Conditions.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 16 (12), 2153-2168 (2017).</li><li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+proteome-wide+label-free+quantification+by+delayed+normalization+and+maximal+peptide+ratio+extraction,+termed+MaxLFQ.">Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).</li><li>Cox, J., Neuhauser, N., Michalski, A., Scheltema, R. A., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Andromeda:+a+peptide+search+engine+integrated+into+the+MaxQuant+environment.">Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment.</a> Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).</li><li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes.">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li><li>Court, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+standardized+urine+proteome+analysis+methodology.">Toward a standardized urine proteome analysis methodology.</a> Proteomics. 11 (6), 1160-1171 (2011).</li><li>Wi&#347;niewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).</li><li>Liebler, D. C., Ham, A. -. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spin+filter-based+sample+preparation+for+shotgun+proteomics.">Spin filter-based sample preparation for shotgun proteomics.</a> Nature Methods. 6 (11), 785-786 (2009).</li><li>Hubner, N. C., Ren, S., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+separation+with+immobilized+pI+strips+is+an+attractive+alternative+to+in-gel+protein+digestion+for+proteome+analysis.">Peptide separation with immobilized pI strips is an attractive alternative to in-gel protein digestion for proteome analysis.</a> Proteomics. 8 (23-24), 4862-4872 (2008).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Informed-Proteomics:+open-source+software+package+for+top-down+proteomics.">Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics.</a> Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).</li><li>Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+oxygen+and+culture+media+on+plating+efficiency+of+some+mammalian+tissue+cells.">Influence of oxygen and culture media on plating efficiency of some mammalian tissue cells.</a> Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).</li><li>Packer, L., Fuehr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+oxygen+concentration+extends+the+lifespan+of+cultured+human+diploid+cells.">Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells.</a> Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).</li><li>Lengner, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+pre-X+inactivation+human+embryonic+stem+cells+under+physiological+oxygen+concentrations.">Derivation of pre-X inactivation human embryonic stem cells under physiological oxygen concentrations.</a> Cell. 141 (5), 872-883 (2010).</li><li>Sidoli, S., Kulej, K., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+proteomics+is+not+the+new+genomics+and+the+future+of+mass+spectrometry+in+cell+biology.">Why proteomics is not the new genomics and the future of mass spectrometry in cell biology.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 21-24 (2017).</li></ol>

Perché la proteomica è un potente strumento per studiare l'espressione di proteine differenti da una cellula intera o compartimenti subcellulari, ottimizzazione del protocollo lisi cellulare e digestione delle proteine è stati affrontati da una serie di studi. Ci sono tre classi principali di metodi, che includono la digestione in-gel (digestione delle proteine nella matrice del gel di poliacrilammide)17, digestione in soluzione18 e filtro-aided campione preparazione<sup...

I macrofagi sono cellule dell'immunità innata coinvolti in una serie di funzioni fisiologiche che vanno dalle risposte agli agenti patogeni infettivi all'omeostasi del tessuto, compresa la rimozione delle cellule apoptotiche e rimodellamento della matrice extracellulare1. Queste cellule sono caratterizzate da una forte plasticità fenotipica2 che si traduce in un molti Stati di attivazione possibili, che sono anche chiamati polarizzazioni. La precisa descrizione molecolare di queste varie polarizzazioni è una priorità nel campo della biologia di macrofago3. È stato proposto di classificare queste polarizzazioni utilizzando la cosiddetta dicotomia M1/M2, in cui M1 rappresenta pro-infiammatorie e M2 rappresenta i macrofagi infiammatori. Questo modello si adatta bene in varie situazioni patologiche, come le infezioni acute, l'allergia e l'obesità4. Tuttavia, in tessuti cronicamente infiammati e cancro, è stato dimostrato che questa classificazione è in grado di cogliere il vasto repertorio fenotipico che i macrofagi presentano in determinati ambienti cellulari5,6, 7. il consenso corrente è che la polarizzazione del macrofago è meglio descritto utilizzando un modello multidimensionale di integrare segnali specifici microambientali8. Questa conclusione è stata confermata attraverso l'analisi trascrittomica dei macrofagi umani, mostrando che il modello M1/M2 è inefficiente nel descrivere le polarizzazioni ottenuti9.
Lo studio presentato si propone di fornire un protocollo per ottenere le firme di proteomica di varie polarizzazioni in macrofagi umani. Descriviamo come differenziare i macrofagi umani negli ambienti dei vari livelli di ossigeno e ottenere peptidi dal macrofago intero proteoma per eseguire una quantificazione privo di etichetta. Questa quantificazione permette il confronto dei livelli di espressione di varie proteine. Come la ricerca sulle cellule staminali ha rivelato l'importanza di ossigeno come un parametro chiave ambientale10, cerchiamo di capire come questo parametro di tessuto può influenzare la polarizzazione del macrofago in esseri umani. La pressione parziale di ossigeno è stata trovata per gamma da 3 a 20% (del totale pressione atmosferica) nel corpo umano, dove il 20% corrisponde approssimativamente a quello comunemente usato in un'incubatrice di coltura cellulare (il valore esatto è di circa 18,6% durante l'assunzione di presenza di acqua in considerazione).
Il lavoro precedente ha indicato che alveolare differiscono dai macrofagi interstiziali da funzionale e morfologica punto di vista11 e che queste differenze sono probabilmente parzialmente dovuto i livelli di ossigeno differente a cui sono esposte12. Inoltre, derivate da midollo osseo macrofagi mostrano una maggiore capacità di phagocytize batteri quando esposti ad un ambiente di ossigeno basso12. L'effetto opposto è stato trovato per macrofagi umani differenziati THP113, ma questi risultati sostengono l'idea che l'ossigeno è un regolatore della biologia del macrofago e che è necessario chiarire questo ruolo a livello molecolare in macrofagi umani. In uno studio precedente, abbiamo applicato un approccio di proteomica per risolvere questi problemi. Misurando i livelli di espressione di migliaia di proteine contemporaneamente, abbiamo messo in evidenza l'impatto di ossigeno sulla polarizzazione e fornito un elenco di nuovi marcatori molecolari. Siamo stati anche in grado di correlare questi risultati per alcune funzioni di macrofagi. In particolare, abbiamo trovato che il tasso di fagocitosi delle cellule apoptotiche aumentava nei macrofagi IL4/IL13-polarizzato, che era legato al upregulation di ALOX15, come rivela l' analisi proteomica14. Nello studio presente, descriviamo come effettuare tale analisi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hypoxia Working Station</td>
			<td>Oxford Optronix</td>
			<td>Hypoxylab</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C6 Flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>Accuri C6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5188-6435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (FA)</td>
			<td>ARISTAR</td>
			<td>450122M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-250 Coomassie blue</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1,610,436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide, E.Coli (LPS)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>437627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2D clean-up kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>80-6484-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium, glutamax supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1 M</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) Solution 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harvard Apparatus column Reverse C18 micro spin column</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>74-4601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5 M, pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Bis-Tris 4-12%</td>
			<td>Life Technologies SAS</td>
			<td>NP0321 BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 Microbeads human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS separation column LS</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 4 (IL4)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 13 (IL13)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-112-410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interferon gamma (INF&#947;)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14-FITC (clone T&#220;K4)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-080-701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSmix Tube Rotator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic Acid (TFA)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>28904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/Lys-C Mix</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>V5073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Mini, EDTA-free Protease Inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density Gradient Solution (Histopaque 1077)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10771-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accumax</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7089-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum from human male AB plasma (SAB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4522-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) solution 30%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9576-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisma-base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>49767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>114405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 20%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>57670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiourea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C9426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL sterile plastic pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer C Eppendorf</td>
			<td>VWR</td>
			<td>460-0223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak tC18 reverse phase cartridges, 100 mg</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT036820</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proteomic analysis of human macrophage polarization under a low oxygen environment

I macrofagi sono cellule dell'immunità innata coinvolti in una serie di funzioni fisiologiche che vanno dalle risposte agli agenti patogeni infettivi all'omeostasi del tessuto. Le varie funzioni di queste cellule sono legate alla loro Stati di attivazione, che è anche chiamato polarizzazione. La precisa descrizione molecolare di queste varie polarizzazioni è una priorità nel campo della biologia del macrofago. È attualmente riconosciuto che un approccio multidimensionale è necessario descrivere come polarizzazione è controllata da segnali ambientali. In questo rapporto, descriviamo un protocollo progettato per ottenere la firma di proteomica di varie polarizzazioni in macrofagi umani. Questo protocollo è basato su una quantificazione dell'espressione della proteina del macrofago ottenuto da Lys C/tripsina-digerito lisi cellulare contenuti e frazionati in gel privo di etichetta. Forniamo anche un protocollo basato sulla soluzione in digestione e frazionamento da utilizzare come alternativa di messa a fuoco isoelettrico. Perché la concentrazione di ossigeno è un parametro ambientale rilevante nei tessuti, utilizziamo questo protocollo per esplorare composizione come atmosferica o un ambiente di ossigeno basso colpisce la classificazione di polarizzazione del macrofago.

A partire da cellule mononucleari di sangue periferico (PBMCs) ottenute per centrifugazione differenziale, il protocollo consente l'ottenimento di una popolazione di CD14+ monociti con un valutati purezza superiore al 98% da citometria a flusso (Figura 1). Questi monociti sono secondariamente differenziati verso varie polarizzazioni (Figura 2). Quando viene scelto un frazionamento su gel, la migrazione su gel di SDS-pa...

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Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Vi presentiamo un protocollo per ottenere le firme di proteomica dei macrofagi umani e da applicare per determinare l'impatto di un ambiente di ossigeno basso sulla polarizzazione del macrofago.

Analisi proteomica di polarizzazione di macrofago umano in un ambiente a basso tenore di ossigeno

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Quindi questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia dei macrofagi, come come caratterizzare lo stato di attivazione in vari giacimento a livello proteico. Il principale vantaggio di questa tecnica è che fornisce l'opportunità di ottenere una diversa espressione di molte proteine nei macrofagi umani utilizzando un metodo di quantificazione privo di etichette. A dimostrare la procedura saranno Marie Malier e Magali Court del mio laboratorio.Per iniziare, aggiungere 15 millilitri di soluzione di separazione cellulare gradiente di densità in ciascuno dei due tubi di centrifugazione da 50 millilitri in modo che la soluzione possa riscaldarsi a temperatura ambiente prima di ricevere l'LRSC. Questo è essenziale in quanto la densità dipende dalla temperatura. Svuotare l'LRSC in un tubo di centrifugazione da 50 millilitri.Aggiungere 1x PBS fino a 50 millilitri e mescolare. Quindi, molto lentamente, aggiungere 25 millilitri della miscela sopra 15 millilitri di soluzione gradiente di densità equilibrata. Fare attenzione a non mescolare le fasi durante questo passaggio.Il sangue deve essere aggiunto sulla soluzione di gradiente di densità senza alcun disturbo di questa fase. Centrifugare entrambi i tubi di centrifugazione per 25 minuti a 700 G senza pause. Alla fine della centrifugazione del gradiente di densità, gli strati dal basso verso l'alto sono gli eriociti e i granulociti, formando il pellet, la fase di soluzione del gradiente di densità, uno strato di PBPC e il plasma diluito.Con una pipetta, passare attraverso la fase plasmatica senza aspirarla. Quindi, raccogliere lo strato PBMC in un nuovo tubo di centrifugazione da 50 millilitri. Aggiungere fino a 50 millilitri di 1x PBS ai PBBC come configurazione di lavaggio e centrifuga per 10 minuti a 300 G.Aspirare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet in 40 millilitri di mezzo macrofago.Dopo aver formulato i PBBC in una camera Malassez, trasferire la quantità di PBBC necessaria per condurre l'esperimento in un tubo di centrifugazione. Centrifugare le cellule per 10 minuti a 300 G.Aspirare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet in 80 microlitri del tampone di cernita per 10 milioni di PBBC. Quindi, aggiungere 20 microlitri di microperline CD14 per 10 milioni di PBBC.Mescolare bene e incubare per 15 minuti a 4 gradi Celsius sotto agitazione costante. Dopo l'incubazione, aggiungere un millilitro di tampone di cernita per 10 milioni di PBPC come fase di lavaggio e centrifugare come prima. Quindi, aspirare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet in 500 microlitri di tampone di cernita per 100 milioni di PBBC.Ora, posizionare una colonna nel campo magnetico del separatore. Preparare la colonna risciacquarla con tre millilitri di tampone di smistamento. Applicare la sospensione cellulare sulla colonna.Quindi raccogliere il flusso attraverso contenente celle senza etichetta per la colorazione successiva, se necessario. Lavare la colonna tre volte con tre millilitri di tampone di smistamento. Fai attenzione a non asciugare la colonna.Quindi, posizionare un tubo di raccolta sotto la colonna e rimuoverlo dal separatore. Dopo il lavaggio, pipettare cinque millilitri di tampone di smistamento nella colonna. Sciacquare immediatamente le cellule con etichetta magnetica spingendo saldamente lo stantuffo nella colonna.Infine, ripetere questi passaggi con una nuova colonna prima di placcare i monociti ed eseguire la polarizzazione del macrofago come descritto nel protocollo di testo. Mantenere i monociti e i macrofagi in un ambiente controllato dall'ossigeno per eseguire analisi delle condizioni ipossiche. Utilizzare una stazione di lavoro ipossia per mantenere le cellule sotto la pressione parziale di ossigeno desiderata durante l'esperimento.Quando si lavora sotto bassa pressione di ossigeno, è importante preparare tutti i mezzi e i tamponi di lavaggio sotto la stazione e attendere a sufficienza per ottenere la corretta pressione parziale nel liquido. Eseguire la llisi cellulare in un tampone sotto una cappa adattata. Caricare l'equivalente proteico di 300.000 cellule per ogni campione su gel di acrilammide 4-12%bis-tris.Controlla la durata della migrazione elettroforetica per consentire a ogni campione proteico di dividersi in sei bande di gel come mostrato qui. Dopo aver riparato e macchiato come descritto nel protocollo di testo, asportare le bande proteiche con un bisturi pulito. Tagliare a dadini ogni banda asportata prima di metterli in tubi da 500 microliter.Ora, lavare le fette di gel tre volte in 200 microlitri di bicarbonato di ammonio millimolare per 20 minuti a 37 gradi Celsius, scartando il bicarbonato di ammonio tra ogni passaggio. Seguire questo con un lavaggio in bicarbonato di ammonio millimolare e acetonitrile. Quindi, disidratare i pezzi di gel con 200 microlitridi di acetonitrile al 100% per 10 minuti.Incubare ogni pezzo di gel con DTT da 10 millimolare e bicarbonato di ammonio millimolare per 45 minuti a 56 gradi Celsius. Quindi, scartare il DTT e incubare il pezzo di gel con 55 iodoacetamide millimolare in bicarbonato di ammonio millimolare per 35 minuti al buio a temperatura ambiente. Per fermare l'alchilazione, scartare la soluzione utilizzata e incubare ogni pezzo di gel con 200 microlitri di DTT da 10 millimolare in bicarbonato di ammonio millimolare per 10 minuti a temperatura ambiente.Lavare i pezzi di gel in 200 microlitri di bicarbonato di ammonio millimolare. Quindi, disidratare con 200 microlitri di acetonitrile al 100% per 10 minuti. Digerire le proteine durante la notte a 37 gradi Celsius con Trypsin / Lys-C Mix secondo le istruzioni del produttore.Estrarre i peptidi risultanti da pezzi di gel aggiungendo 50 microlitridi di acetonitrile al 50% per 15 minuti in tubi a basso assorbimento. Dopo aver aggiunto 50 microlitridi di acido formico al 5% per 15 minuti, aggiungere 50 microlitri di acetonitrile al 100% per 15 minuti. Tirare e asciugare ogni frazione in tubi a basso assorbimento per limitare l'assorbimento dei peptidi e la perdita del campione.Archiviare i campioni a 80 gradi Celsius fino a un'ulteriore analisi come descritto nel protocollo di testo. Di seguito è riportata la purezza rappresentativa valutata dalla citometria del flusso a seguito della selezione di perline magnetiche di monociti positivi cd14. L'imaging a contrasto di fase di macrofagi umani differenziati mostra eterogeneità delle morfologie ottenute per due diverse polarizzazioni dopo nove giorni di coltura.Viene mostrato un esempio di digestione off-gel utilizzando gel di pagina SDS macchiati d'argento. La valutazione delle proteine dallalisi cellulare e dopo la digestione in soluzione mostra l'assenza di degradazione durante lalisi e l'efficienza della digestione. Mostrato qui è un esempio di spettro di dissociazione indotto dalla collisione di un peptide trovato a rapporto massa-carica di 597,29 sullo spettro MS con una carica elettrica di due positivi.Da questo spettro, è stata determinata la sequenza corrispondente. Il risultato finale dopo l'analisi è una mappa termica che rappresenta il clustering gerarchico di tutti gli stati di polarizzazione usando proteine espresse in modo differenziato. L'analisi rivela un ammasso di proteine sovrascritte in tutte le polarizzazioni nella condizione del 3% di ossigeno.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che devi prima decidere quale tipo di frazionamento eseguirai su nuovi campioni per adattare il tuo protocollo di conseguenza. L'approccio proteomico che utilizza questo lavoro è complementare agli approcci genomici che sono stati utilizzati negli ultimi anni nel campo degli studi di polarizzazione della biologia dei macrofagi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica apre la strada al ricercatore nel campo dell'immunologia per esplorare i vari stati di attivazione delle cellule immunitarie nell'uomo e anche in altri mammiferi.Non dimenticare che lavorare con DTT potrebbe essere pericoloso, quindi è necessario lavorare sotto una cappa adattata per eseguire questa procedura.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Risoluzione purificato per affinità complessi proteici di Blue Native PAGE e proteine ​​correlazione Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Ricerca

Biochimica

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

Dissezione della Retina umana e RPE-coroide per analisi proteomica

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID — Analisi proteomica dei complessi della proteina contesto specifico in ambiente nativo di cellulare

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

Campionamento e pretrattamento dello smalto dei denti carbonato per carbonio stabile e analisi di isotopi di ossigeno

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

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Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

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Privo di calibrazione In Vitro quantificazione delle proteine omo-oligomerizzazione utilizzando Strumentazione commerciale e libero, Open Source Software di analisi di luminosità

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Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Misurare e interpretare i tassi di consumo di ossigeno in tutto Vola testa segmenti

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Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

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Studio sul metabolismo di sei insetticidi sistemici in una nuova coltura di sospensione cellulare derivata dal tè (Camellia Sinensis L.) plurale di "leaf"

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...