Name: proteomic analysis of human macrophage polarization under a low oxygen environment
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment at JoVE.com

午前リーグ国立 contre le がんとラ財団アーク注ぐラ凝ったシュル ルがんラで若いグループ リーダー プログラム (ATIP/アベニール Inserm CNRS)、によって資金を供給します。生物学のプラットフォーム (UTECHS MSBIO、パスツール研究所、パリ) の質量分析からマリエット Matondo に感謝いたします。我々 はローレン ・ アンダーソン原稿の彼女の読書をありがちましょう。

ド識別、健康なドナーから血液サンプル (LRSC) は、承認されたプロトコル (CODECOH DC-2018-3114) の一部として EFS (フランス語国民の血サービス) から得られました。ドナーは、血液を使用するため署名された同意書を与えた。
1. メディアとバッファーの準備
<ol><li>[RPMI glutamax + 10 mM HEPES + 1 x 非必須アミノ酸 (NEAA)] マクロファージ媒体を準備し、37 ° C に温める</li>
	<li>マクロ?...

<ol>
	<li>Okabe, Y., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+biology+perspective+on+macrophages.">Tissue biology perspective on macrophages.</a> Nature Immunology. 17 (1), 9-17 (2016).</li><li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+plasticity+and+polarization:+in+vivo+veritas.">Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).</li><li>Murray, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+Polarization.">Macrophage Polarization.</a> Annual Review of Physiology. 79, 541-566 (2017).</li><li>Chinetti-Gbaguidi, G., Staels, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+polarization+in+metabolic+disorders:+functions+and+regulation.">Macrophage polarization in metabolic disorders: functions and regulation.</a> Current Opinion in Lipidology. 22 (5), 365-372 (2011).</li><li>Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+mononuclear+phagocyte+system+in+the+molecular+age.">Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).</li><li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation.">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).</li><li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets.">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).</li><li>Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+multidimensional+concept+of+macrophage+ontogeny,+activation+and+function.">New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function.</a> Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).</li><li>Xue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-based+network+analysis+reveals+a+spectrum+model+of+human+macrophage+activation.">Transcriptome-based network analysis reveals a spectrum model of human macrophage activation.</a> Immunity. 40 (2), 274-288 (2014).</li><li>Csete, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+in+the+cultivation+of+stem+cells.">Oxygen in the cultivation of stem cells.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1049, 1-8 (2005).</li><li>Johansson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional,+morphological,+and+phenotypical+differences+between+rat+alveolar+and+interstitial+macrophages.">Functional, morphological, and phenotypical differences between rat alveolar and interstitial macrophages.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 16 (5), 582-588 (1997).</li><li>Pfau, J. C., Schneider, J. C., Archer, A. J., Sentissi, J., Leyva, F. J., Cramton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+oxygen+tension+affects+phenotype+in+cultured+bone+marrow-derived+macrophages.">Environmental oxygen tension affects phenotype in cultured bone marrow-derived macrophages.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (2), L354-L362 (2004).</li><li>Grodzki, A. C. G., Giulivi, C., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+tension+modulates+differentiation+and+primary+macrophage+functions+in+the+human+monocytic+THP-1+cell+line.">Oxygen tension modulates differentiation and primary macrophage functions in the human monocytic THP-1 cell line.</a> PLoS One. 8 (1), e54926 (2013).</li><li>Court, M., Petre, G., Atifi, M. E., Millet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Signature+Reveals+Modulation+of+Human+Macrophage+Polarization+and+Functions+Under+Differing+Environmental+Oxygen+Conditions.">Proteomic Signature Reveals Modulation of Human Macrophage Polarization and Functions Under Differing Environmental Oxygen Conditions.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 16 (12), 2153-2168 (2017).</li><li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+proteome-wide+label-free+quantification+by+delayed+normalization+and+maximal+peptide+ratio+extraction,+termed+MaxLFQ.">Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).</li><li>Cox, J., Neuhauser, N., Michalski, A., Scheltema, R. A., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Andromeda:+a+peptide+search+engine+integrated+into+the+MaxQuant+environment.">Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment.</a> Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).</li><li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes.">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li><li>Court, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+standardized+urine+proteome+analysis+methodology.">Toward a standardized urine proteome analysis methodology.</a> Proteomics. 11 (6), 1160-1171 (2011).</li><li>Wi&#347;niewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).</li><li>Liebler, D. C., Ham, A. -. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spin+filter-based+sample+preparation+for+shotgun+proteomics.">Spin filter-based sample preparation for shotgun proteomics.</a> Nature Methods. 6 (11), 785-786 (2009).</li><li>Hubner, N. C., Ren, S., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+separation+with+immobilized+pI+strips+is+an+attractive+alternative+to+in-gel+protein+digestion+for+proteome+analysis.">Peptide separation with immobilized pI strips is an attractive alternative to in-gel protein digestion for proteome analysis.</a> Proteomics. 8 (23-24), 4862-4872 (2008).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Informed-Proteomics:+open-source+software+package+for+top-down+proteomics.">Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics.</a> Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).</li><li>Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+oxygen+and+culture+media+on+plating+efficiency+of+some+mammalian+tissue+cells.">Influence of oxygen and culture media on plating efficiency of some mammalian tissue cells.</a> Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).</li><li>Packer, L., Fuehr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+oxygen+concentration+extends+the+lifespan+of+cultured+human+diploid+cells.">Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells.</a> Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).</li><li>Lengner, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+pre-X+inactivation+human+embryonic+stem+cells+under+physiological+oxygen+concentrations.">Derivation of pre-X inactivation human embryonic stem cells under physiological oxygen concentrations.</a> Cell. 141 (5), 872-883 (2010).</li><li>Sidoli, S., Kulej, K., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+proteomics+is+not+the+new+genomics+and+the+future+of+mass+spectrometry+in+cell+biology.">Why proteomics is not the new genomics and the future of mass spectrometry in cell biology.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 21-24 (2017).</li></ol>

プロテオミクスは全細胞または細胞レベル下コンパートメントからの異なった蛋白質の表現を勉強する強力なツールで、セル換散のプロトコルの最適化とタンパク質の消化は、多くの研究によって対処されています。ゲルの消化力 (ポリアクリルアミド ゲルのマトリックス蛋白の消化)17、ソリューション18とフィルター支援サンプル準備19...

大食細胞は自然免疫系細胞の数組織の恒常性は、細胞外マトリックス1の改造とアポトーシス細胞の除去を含む感染病原体に応答に至る生理機能に関与します。これらの細胞は、多くの可能なアクティベーション状態、偏波とも呼ばれますに変換する強力な表現型可塑性2によって特徴付けられます。これらの各種偏波の精密分子説明が大食細胞生物学3の分野で優先されます。それはいわゆる M1 ・ M2 の二分法、M1 プロ炎症性を表し M2 マクロファージ炎症を使用してこれらの分極を分類するために提案されている.このモデルは、急性感染症、アレルギー、肥満4など様々 な病理学的状況で適合します。しかし、慢性的な炎症を起こしている組織やがん、それ実証されていますこの分類は特定セルラ環境5,6,に存在するマクロファージ幅広い表現レパートリーを把握することができます。7します。 現在のコンセンサスは、多次元モデルを使用して、特定のアイソレータケージ信号8を統合するマクロファージの偏波がよりよく記述されています。この結論は、M1 ・ M2 モデルが得られた偏波9の記述で効率的であることを示す人間の大食細胞のトランスクリプトーム解析により確認されています。
研究は、ヒトのマクロファージで各種偏波のプロテオームの署名を取得するためのプロトコルを提供することを目的を発表しました。我々 は様々 な酸素濃度の環境下でヒトのマクロファージを区別し、ラベル無料定量化を実行する全体のマクロファージ プロテオームからペプチドを取得する方法について説明します。この数量は、様々 なタンパク質の発現レベルの比較をできます。幹細胞の研究は、環境キー パラメーター10として酸素の重要性を明らかにしたと私たちはこの組織パラメーターができるヒトのマクロファージ偏波にどのように影響を与えるかを理解ましょう。酸素の分圧は、20% がおよそ (正確な値は約 18.6% 水の存在をしながら細胞文化のインキュベーターでよく使用されるものに、人間の体で 3 (合計の大気圧) の 20% からの範囲に発見されています。考慮)。
前作は、肺胞間質性マクロファージ機能とは異なる、これらの違いが部分的に露出12が異なる酸素濃度のためおそらくビュー11の形態のポイントを示しています。さらに、骨髄由来マクロファージは、細菌12低酸素環境にさらされたときを phagocytize する能力の増大を示します。THP1 区別ヒトマクロファージ13、反対の効果が発見されているが、これらの結果は、大食細胞生物学のレギュレータを酸素には、人間の大食細胞の分子レベルでこの役割を明らかにする必要の考えを支持します。以前の研究では、これらの問題に対処するためのプロテオミクス手法を用いています。たくさんの蛋白質の発現量を同時に測定することにより我々 は偏波上の酸素の影響を強調表示され、新しい分子マーカーのリストを提供します。また、いくつかのマクロファージ機能にこれらの結果を関連することができた。特に、IL4 IL13 偏極マクロファージ、プロテオーム解析14によって明らかにされた ALOX15 のアップレギュレーションにリンクされていた」アポトーシス細胞の貪食能の率は増加したが分かった。本研究で我々 はこのような分析を実行する方法をについて説明します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hypoxia Working Station</td>
			<td>Oxford Optronix</td>
			<td>Hypoxylab</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C6 Flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>Accuri C6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5188-6435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (FA)</td>
			<td>ARISTAR</td>
			<td>450122M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-250 Coomassie blue</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1,610,436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide, E.Coli (LPS)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>437627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2D clean-up kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>80-6484-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium, glutamax supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1 M</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) Solution 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harvard Apparatus column Reverse C18 micro spin column</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>74-4601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5 M, pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Bis-Tris 4-12%</td>
			<td>Life Technologies SAS</td>
			<td>NP0321 BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 Microbeads human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS separation column LS</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 4 (IL4)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 13 (IL13)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-112-410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interferon gamma (INF&#947;)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14-FITC (clone T&#220;K4)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-080-701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSmix Tube Rotator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic Acid (TFA)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>28904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/Lys-C Mix</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>V5073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Mini, EDTA-free Protease Inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density Gradient Solution (Histopaque 1077)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10771-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accumax</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7089-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum from human male AB plasma (SAB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4522-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) solution 30%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9576-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisma-base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>49767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>114405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 20%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>57670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiourea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C9426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL sterile plastic pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer C Eppendorf</td>
			<td>VWR</td>
			<td>460-0223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak tC18 reverse phase cartridges, 100 mg</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT036820</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proteomic analysis of human macrophage polarization under a low oxygen environment

大食細胞は自然免疫系細胞数感染病原体に応答から組織恒常性に至るまでの生理機能に関与します。これらの細胞の様々 な機能のアクティブ化の状態、また偏光と呼ばれる関連しています。これらの各種偏波の精密分子説明が大食細胞生物学の分野で優先されます。それは現在環境信号により偏光を制御する方法を説明する必要がある、多次元的なアプローチを認められています。本報告では、ヒトのマクロファージで各種偏波のプロテオームの署名を取得するためのプロトコルについて述べる.このプロトコルは、ゲル分別と Lys C/トリプシン消化細胞換散コンテンツから得られる大食細胞タンパク質発現のラベル無料数量に基づいています。またプロトコルに基づいてソリューションの消化との代替として使用する分画を中心に等電点を提供します。酸素濃度は、組織に関連する環境パラメーターは、このプロトコルを使用してどのように大気組成を探索するまたは低酸素環境マクロファージ偏波の分類に影響を与えます。

差動遠心分離によって得られた末梢血単核球 (PBMCs) から始まって、プロトコルにより、CD14 の人口の取得+単球フローサイトメトリー (図 1) で 98% 以上の純度の評価。これらの単球は第二各種偏波 (図 2) に区別されます。ゲルの分別を選択、SDS ページのゲルの移行が目的のバンド数を取得する適応とバンドを切除 (<st...

Watch this Scientific Journal Video about Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment at JoVE.com

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

人間の大食細胞のプロテオーム署名を取得し、これをマクロファージ偏波に低酸素環境の影響の定量に適用するためのプロトコルを提案します。

低酸素環境下におけるヒトのマクロファージ偏光のプロテオーム解析

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

したがって、この方法は、タンパク質レベルで様々な環境下での活性化の状態を特徴付ける方法など、マクロファージ生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、標識のない定量法を用いてヒトマクロファージにおける多くのタンパク質の発現を異なる方法で得る機会を提供することです。手順を実証することは、私の研究室からマリー・マリアーとマガリ裁判所になります。まず、15ミリリットルの密度勾配細胞分離溶液を2つの50ミリリットル遠心分離チューブのそれぞれに加え、LRSCを受ける前に溶液を室温まで温めることができます。密度は温度に依存するので、これは不可欠です。LRSCを50ミリリットルの遠心チューブに空にします。1x PBSを50ミリリットルまで加え、混ぜます。次に、非常にゆっくりと、平衡密度勾配溶液の15ミリリットルの上にミックスの25ミリリットルを追加します。この手順では、フェーズを混在させないように注意してください。血液は、この段階の妨害なしに密度勾配溶液に追加する必要があります。遠心分離チューブは、25分間、700Gで破断なし。密度勾配遠心分離の終わりに、下から上までの層は赤血球および顆粒球であり、ペレット、密度勾配溶液相、PBMCsの層、および希釈プラズマを形成する。ピペットを使用して、プラズマ相を吸引せずに通過します。次いで、PBMC層を新しい50ミリリットルの遠心チューブに集める。300 G.吸上機で10分間、PBMCに最大50ミリリットルの1x PBSを加え、上清を吸引し、40ミリリットルのマクロファージ培地でペレットを再中断します。マラセズチャンバーでPBMCsをカウチした後、実験を行うために必要な量のPBMCsを遠心チューブに移します。300 G.吸蔵で細胞を10分間遠心し、1000万PBMCsあたり80マイクロリットルの選別バッファーでペレットを再懸濁する。次に、1,000万PBCsあたり20マイクロリットルのCD14マイクロビーズを加えます。よく混ぜ、一定の攪拌の下で摂氏4度で15分間インキュベートします。インキュベーションに続いて、洗浄工程として1000万PBMCsにつき1ミリリットルの仕分けバッファーを加え、遠心分離機を以前のように加えます。その後、上清を吸引し、1億PBMCsあたり500マイクロリットルの仕分バッファーでペレットを再懸濁する。次に、セパレータの磁場に列を配置します。3ミリリットルの仕分けバッファーで列をすすいで準備します。セルのサスペンションを列に適用します。次に、必要に応じて、その後の染色のためにラベルなし細胞を含む流れを収集します。3ミリリットルの仕分けバッファーでカラムを3回洗います。柱を乾かさないで注意してください。次に、列の下にコレクション チューブを配置し、セパレータから取り外します。洗浄後、5ミリリットルの選別バッファーをカラムにピペットします。プランジャーをしっかりと柱に押し込み、磁気標識されたセルを直ちに洗い流します。最後に、単球をめっきし、テキストプロトコルに記載されているようにマクロファージ偏光を実行する前に、新しい列でこれらの手順を繰り返します。酸素制御環境で単球とマクロファージを維持し、低酸素状態解析を行います。実験中に所望の酸素分圧下の細胞を維持するために低酸素ワーキングステーションを使用してください。低酸素圧下で作業する場合、ステーションの下にすべての媒体と洗浄バッファーを準備し、液体中の正しい分圧を得るために十分に待つことが重要です。適合フードの下のバッファーで細胞のライシスを行います。4-12%ビストリスアクリルアミドゲルに各サンプルに300,000細胞の同等のタンパク質をロードします。電気泳動の持続時間を制御して、各タンパク質サンプルを6つのゲルバンドに分割できるようにします。テキストプロトコルに記載されているように固定して染色した後、きれいなメスでタンパク質バンドを切除します。500マイクロリットルチューブに入れる前に、切除されたバンドをダイスします。今度は、25ミリモルの重炭酸アンモニウム200マイクロリットルで3回、摂氏37度で20分間ゲルスライスを洗浄し、各ステップの間に重炭酸アンモニウムを捨てます。25ミリモル炭酸アンモニウムとアセトニトリルで1回の洗浄でこれに従ってください。次いで、100%アセトニトリル200マイクロリットルでゲル片を10分間脱水する。10ミリモルDTTと25ミリモル炭酸アンモニウムを56°Cで45分間インキュベートします。次に、DTTを廃棄し、室温で暗闇の中で25ミリモル重炭酸アンモニウム中55ミリモルヨウドアセトアミドでゲル片をインキュベートします。アルキル化を止めるには、使用した溶液を廃棄し、25ミリモル重炭酸アンモニウムで20ミリモルDTTの200マイクロリットルの各ゲル片を室温で10分間インキュベートします。25ミリモルの重炭酸アンモニウムの200マイクロリットルでゲル片を洗います。その後、100%アセトニトリルの200マイクロリットルで10分間脱水する。メーカーの指示に従ってトリプシン/Lys-Cミックスで摂氏37度で一晩タンパク質を消化します。得られたペプチドをゲル片から、低吸収チューブで50%アセトニトリル50マイクロリットルを15分間添加して抽出する。50マイクロリットルの5%のギ酸を15分間加えた後、100%アセトニトリルの50マイクロリットルを15分間加える。低吸収チューブで各画分を引っ張って乾燥させて、ペプチドの吸収とサンプル損失を制限します。テキスト プロトコルで詳しく説明されているように、さらに分析が行われるまで、サンプルを摂氏 80 度で保存します。ここに示されている代表的な純度は、CD14陽性単球の磁気ビーズ選択に続くフローサイトメトリーによって評価される。分化されたヒトマクロファージの位相コントラスト画像は、9日間培養した後の2つの異なる分極に対して得られた形態の不均一性を示す。銀染色SDSページゲルを用いたオフゲル消化の例を示す。細胞溶解および溶液内消化後のタンパク質の評価は、溶解中の分解の欠如と消化の効率を示す。ここに示す、正の2の電荷を有するMSスペクトル上の質量電荷比597.29で見られるペプチドの衝突誘発解離スペクトルの例を示す。このスペクトルから、対応する配列を決定した。解析後の最終結果は、微分発現タンパク質を使用するすべての偏光状態の階層的クラスタリングを表すヒートマップです。分析は、3%酸素状態のすべての分極で過剰発現するタンパク質のクラスターを明らかにします。この手順を試みる際には、プロトコルを適合させるために、新しいサンプルに対してどのような分数を実行するかを最初に決定する必要があることを覚えておく必要があります。この研究を用いたプロテオミクスアプローチは、マクロファージ生物学の偏光研究の分野で最後の年に使用されてきたゲノムアプローチと相補的である。その開発後、この技術は、免疫学の分野の研究者がヒトおよび他の哺乳類における免疫細胞の活性化のさまざまな状態を探求する道を開きます。DTTを使用することは危険である可能性があるので、この手順を行うには、適応されたフードの下で作業する必要があることを忘れないでください。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

ブルーネイティブPAGEおよびタンパク質相関プロファイリングによってアフィニティー精製タンパク質複合体の解決

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

プロテオーム解析のための人間の網膜と網膜色素上皮・脈絡膜の解剖

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

ネイティブな携帯電話環境におけるコンテキスト固有蛋白質複合体の分割-BioID-プロテオーム解析

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

安定炭素・酸素同位体分析の炭酸塩のサンプリングと歯のエナメル質の前処理

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

動的プロテオミクスおよび miRNA 蛍光灌流後分離されたマウス心臓ポリソームの分析

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

多量ホモ測定器と無料、フリー、オープン ソースの明るさ解析ソフトウェアを使用しての体外校正無料定量化

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

嫌気性蛋白質の浄化および DesB ジオキシゲナーゼ活性と抑制の勉強用酸素電極による速度論的解析

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

測定と酸素消費量全体の解釈飛ぶ頭セグメント

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

茶由来の新たに確立された細胞懸濁液培養における6種の全身殺虫剤の代謝に関する研究(カメリアシネンシスL.葉

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...