Name: proteomic analysis of human macrophage polarization under a low oxygen environment
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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오전 국가 리그 죄수 르 암과 라 Fondation 아크 부 라 검색 쉬르 르 암 라 하 여 젊은 그룹 지도자 프로그램 (ATIP/미래 Inserm-CNRS)에 의해 자금이 다. 우리는 생물학 플랫폼 (UTECHS MSBIO, 파스퇴르 연구소, 파리)에 대 한 질량 분석에서 Mariette Matondo 감사합니다. 우리는 원고의 그녀의 독서에 대 한 로렌 앤더슨을 감사합니다.

건강 하 고, 취소 확인 된 기증자 로부터 인간의 혈액 샘플 (LRSC) 인증된 프로토콜 (CODECOH DC-2018-3114)의 일환으로 EFS (프랑스 국가 혈액 서비스)에서 얻은 했다. 기증자는 혈액의 사용에 대 한 서명된 동의 했다.
1. 미디어와 버퍼 준비
<ol><li>대 식 세포 매체 [RPMI glutamax + 10 mM HEPES + 1 x 비 본질적인 아미노산 (NEAA)]를 준비 하 고 37 ° c.에 따뜻한</li>
	<li>대 식 세포 매체 + AB 플라즈마...

<ol>
	<li>Okabe, Y., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+biology+perspective+on+macrophages.">Tissue biology perspective on macrophages.</a> Nature Immunology. 17 (1), 9-17 (2016).</li><li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+plasticity+and+polarization:+in+vivo+veritas.">Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).</li><li>Murray, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+Polarization.">Macrophage Polarization.</a> Annual Review of Physiology. 79, 541-566 (2017).</li><li>Chinetti-Gbaguidi, G., Staels, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+polarization+in+metabolic+disorders:+functions+and+regulation.">Macrophage polarization in metabolic disorders: functions and regulation.</a> Current Opinion in Lipidology. 22 (5), 365-372 (2011).</li><li>Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+mononuclear+phagocyte+system+in+the+molecular+age.">Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).</li><li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation.">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).</li><li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets.">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).</li><li>Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+multidimensional+concept+of+macrophage+ontogeny,+activation+and+function.">New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function.</a> Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).</li><li>Xue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-based+network+analysis+reveals+a+spectrum+model+of+human+macrophage+activation.">Transcriptome-based network analysis reveals a spectrum model of human macrophage activation.</a> Immunity. 40 (2), 274-288 (2014).</li><li>Csete, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+in+the+cultivation+of+stem+cells.">Oxygen in the cultivation of stem cells.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1049, 1-8 (2005).</li><li>Johansson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional,+morphological,+and+phenotypical+differences+between+rat+alveolar+and+interstitial+macrophages.">Functional, morphological, and phenotypical differences between rat alveolar and interstitial macrophages.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 16 (5), 582-588 (1997).</li><li>Pfau, J. C., Schneider, J. C., Archer, A. J., Sentissi, J., Leyva, F. J., Cramton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+oxygen+tension+affects+phenotype+in+cultured+bone+marrow-derived+macrophages.">Environmental oxygen tension affects phenotype in cultured bone marrow-derived macrophages.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (2), L354-L362 (2004).</li><li>Grodzki, A. C. G., Giulivi, C., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+tension+modulates+differentiation+and+primary+macrophage+functions+in+the+human+monocytic+THP-1+cell+line.">Oxygen tension modulates differentiation and primary macrophage functions in the human monocytic THP-1 cell line.</a> PLoS One. 8 (1), e54926 (2013).</li><li>Court, M., Petre, G., Atifi, M. E., Millet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Signature+Reveals+Modulation+of+Human+Macrophage+Polarization+and+Functions+Under+Differing+Environmental+Oxygen+Conditions.">Proteomic Signature Reveals Modulation of Human Macrophage Polarization and Functions Under Differing Environmental Oxygen Conditions.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 16 (12), 2153-2168 (2017).</li><li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+proteome-wide+label-free+quantification+by+delayed+normalization+and+maximal+peptide+ratio+extraction,+termed+MaxLFQ.">Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).</li><li>Cox, J., Neuhauser, N., Michalski, A., Scheltema, R. A., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Andromeda:+a+peptide+search+engine+integrated+into+the+MaxQuant+environment.">Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment.</a> Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).</li><li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes.">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li><li>Court, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+standardized+urine+proteome+analysis+methodology.">Toward a standardized urine proteome analysis methodology.</a> Proteomics. 11 (6), 1160-1171 (2011).</li><li>Wi&#347;niewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).</li><li>Liebler, D. C., Ham, A. -. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spin+filter-based+sample+preparation+for+shotgun+proteomics.">Spin filter-based sample preparation for shotgun proteomics.</a> Nature Methods. 6 (11), 785-786 (2009).</li><li>Hubner, N. C., Ren, S., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+separation+with+immobilized+pI+strips+is+an+attractive+alternative+to+in-gel+protein+digestion+for+proteome+analysis.">Peptide separation with immobilized pI strips is an attractive alternative to in-gel protein digestion for proteome analysis.</a> Proteomics. 8 (23-24), 4862-4872 (2008).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Informed-Proteomics:+open-source+software+package+for+top-down+proteomics.">Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics.</a> Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).</li><li>Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+oxygen+and+culture+media+on+plating+efficiency+of+some+mammalian+tissue+cells.">Influence of oxygen and culture media on plating efficiency of some mammalian tissue cells.</a> Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).</li><li>Packer, L., Fuehr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+oxygen+concentration+extends+the+lifespan+of+cultured+human+diploid+cells.">Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells.</a> Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).</li><li>Lengner, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+pre-X+inactivation+human+embryonic+stem+cells+under+physiological+oxygen+concentrations.">Derivation of pre-X inactivation human embryonic stem cells under physiological oxygen concentrations.</a> Cell. 141 (5), 872-883 (2010).</li><li>Sidoli, S., Kulej, K., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+proteomics+is+not+the+new+genomics+and+the+future+of+mass+spectrometry+in+cell+biology.">Why proteomics is not the new genomics and the future of mass spectrometry in cell biology.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 21-24 (2017).</li></ol>

Proteomics 전체 셀 또는 subcellular 구획에서 다른 단백질의 표현을 공부 하는 강력한 도구 이므로 세포 세포의 용 해 프로토콜의 최적화 및 단백질의 소화 연구의 숫자에 의해 수정 되었습니다. 젤 소화 (polyacrylamide 젤 매트릭스에 단백질의 소화)17, 솔루션18 및 필터 지원 샘플 준비19에서 소화를 포함 하는 방법의 세 가지 주요 클래스 있다. 이 마지...

대 식 세포는 여러 전염 성 병원 균에 대 한 응답에서 조직의 항상성, apoptotic 세포의 제거를 포함 하 여, 세포 외 기질1의 리 모델링에 이르기까지 생리 기능에 타고 난 면역 세포. 이 세포는 강한 phenotypic가 소성2 분극 라고도 하는 많은 가능한 활성화 상태를 변환 하는 특징. 이러한 다양 한 분극의 정확한 분자 설명 대 식 세포 생물학3의 분야에서 우선 순위입니다. 그것은 소위 M1/M2 이분법, 있는 m 1 프로-염증 성 나타내고 M2 염증 세포를 사용 하 여 이러한 분극 분류 제안 되었습니다. 이 모델은 급성 감염, 알레르기, 비만4같은 다양 한 병 적인 상황에 잘 맞는. 그러나, 만성 염증된 조직 및 암, 그것은 증명 되었습니다이 분류는 대 식 세포 특정 세포 환경5,6, 에서 제공 하는 광범위 한 phenotypic 레 퍼 토리를 파악 수 없습니다. 7. 현재 일치는 대 식 세포 양극 화 더 나은 설명 다차원 모델을 사용 하 여 특정 microenvironmental 신호8을 통합 하는. 이 결론은 M1/M2 모델은 획득된 분극9에 비효율적 보여주는 인간 대 식 세포의 transcriptomic 분석을 통해 확인 됐다.
연구를 인간의 세포에 다양 한 분극의 proteomic 서명 프로토콜을 제공 하는 것을 목표로 제시. 우리는 다양 한 산소 레벨의 환경에 인간의 세포를 분화 하 고 레이블 없는 정량화를 수행 하기 위해 전체 대 식 세포 프로테옴에서 펩 티 드를 얻을 하는 방법을 설명 합니다. 이 정량화 다양 한 단백질의 표현 레벨의 비교를 허용 한다. 줄기 세포에 대 한 연구 환경 키 매개 변수10으로 산소의 중요성을 계시 했다, 우리는이 조직 매개 변수 인 간에 있는 대 식 세포 분극 영향을 미칠 수 어떻게 이해를 추구 합니다. 산소의 부분 압력에서에서 발견 되었습니다 범위 3 (총 대기 압력)의 20% ~ 20% (정확한 값은 약 18.6% 물의 존재 하면서 세포 문화 인큐베이터에서 일반적으로 사용 되는 약 해당 인체 에 계정).
이전 작품과 형태학의 조회11 지점과 이러한 차이 아마 부분적으로는 그들은 노출된12다른 산소 수준 때문에 치경 다 기능에서 중간 세포를 보이고 있다. 또한, 골 수 유래 세포 박테리아12낮은 산소 환경 노출 되 면 phagocytize를 증가 능력을 보여줍니다. 인간의 세포 THP1 차별화 된13, 반대의 효과가 발견 되었습니다 있지만 이러한 결과 산소 대 식 세포 생물학의 레 귤 레이 터는 고 인간의 세포에 분자 수준에서이 역할을 명확히 하는 데 필요한 아이디어를 지 원하는. 이전 연구에서 우리는 이러한 문제를 해결 하는 proteomics 접근 방식을 적용 했습니다. 단백질의 수천에 대 한 식 레벨을 동시에 측정 하 여 우리는 분극에 산소의 영향을 강조 하 고 새로운 분자 마커의 목록을 제공. 우리는 또한 일부 세포 기능에 이러한 연구 결과 관련 된 수 있습니다. 특히, 우리는 apoptotic 세포의 식 균 작용의 속도 증가 되었다 IL4/IL13-편광 세포에서 밝혀 proteomic 분석14ALOX15의 upregulation에 연결 했다 발견. 현재 연구에서 우리는 이러한 분석을 수행 하는 방법을 설명 합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hypoxia Working Station</td>
			<td>Oxford Optronix</td>
			<td>Hypoxylab</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C6 Flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>Accuri C6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5188-6435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (FA)</td>
			<td>ARISTAR</td>
			<td>450122M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-250 Coomassie blue</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1,610,436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide, E.Coli (LPS)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>437627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2D clean-up kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>80-6484-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium, glutamax supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1 M</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) Solution 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harvard Apparatus column Reverse C18 micro spin column</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>74-4601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5 M, pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Bis-Tris 4-12%</td>
			<td>Life Technologies SAS</td>
			<td>NP0321 BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 Microbeads human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS separation column LS</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 4 (IL4)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 13 (IL13)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-112-410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interferon gamma (INF&#947;)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14-FITC (clone T&#220;K4)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-080-701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSmix Tube Rotator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic Acid (TFA)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>28904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/Lys-C Mix</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>V5073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Mini, EDTA-free Protease Inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density Gradient Solution (Histopaque 1077)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10771-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accumax</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7089-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum from human male AB plasma (SAB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4522-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) solution 30%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9576-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisma-base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>49767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>114405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 20%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>57670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiourea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C9426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL sterile plastic pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer C Eppendorf</td>
			<td>VWR</td>
			<td>460-0223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak tC18 reverse phase cartridges, 100 mg</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT036820</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proteomic analysis of human macrophage polarization under a low oxygen environment

대 식 세포는 타고 난 면역 세포 조직의 항상성 전염 성 병원 균에 대 한 응답에서 배열 하는 생리 기능 수에 관련 된. 이러한 셀의 다양 한 기능 활성화 상태로 또한 양극 화 라는 관련이 있습니다. 이러한 다양 한 분극의 정확한 분자 설명 대 식 세포 생물학의 분야에서 우선 순위입니다. 그것은 현재 다차원 접근은 분극 환경 신호에 의해 제어 되는 방법을 설명 하는 데 필요한 인정 했다. 이 보고서에서 우리는 인간의 세포에 다양 한 분극의 proteomic 서명을 얻기 위해 설계 된 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 대 식 세포 단백질 표정에-젤 분류 한 내용과 리스 C/트립 신-소화 세포 세포의 용 해에서 얻은의 레이블 없는 정량화를 기반으로 합니다. 우리는 또한 프로토콜 기반 솔루션에서 소화 하 고 전자 안으로 사용 하는 분류를 초점을 제공 합니다. 산소 농도 조직에 관련 된 환경 매개 변수, 때문에 우리는 어떻게 대기 구성 탐험이 프로토콜을 사용 또는 저 산소 환경에 영향을 미치는 macrophage 분극의 분류.

주변 혈액 단 세포 (PBMCs) 차등 원심 분리 하 여 얻은에서 시작, 프로토콜 허용 CD14의 인구를 얻는+ monocytes cytometry (그림 1)에 의해 98% 이상의 평가 순도 함께. 이러한 monocytes secondarily 다양 한 분극 (그림 2)으로 구분 됩니다. 젤에 분류 선택, SDS 페이지 젤에 마이그레이션 원하는 밴드의 번호에 맞게 이며 밴드 excised 됩니다 ...

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Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

우리는 인간의 세포의 proteomic 서명을 macrophage 분극에 낮은 산소 환경 영향의 결정에이 적용 하는 프로토콜을 제시.

낮은 산소 환경에서 인간 대 식 세포 분극의 Proteomic 분석

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

따라서 이 방법은 단백질 수준에서 다양한 환경에서 활성화 상태를 특성화하는 방법과 같은 대식세포 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 라벨이 없는 정량화 방법을 사용하여 인간 대식세포에서 많은 단백질의 다른 발현을 얻을 수 있는 기회를 제공한다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 마리 말리어와 마갈리 법원이 될 것입니다.시작하려면 밀도 그라데이션 세포 분리 용액 15밀리리터를 각각 50밀리리터 원심분리 튜브에 추가하여 LRSC를 받기 전에 용액이 실온으로 따뜻해질 수 있도록 합니다. 밀도는 온도에 따라 달라지기 때문에 필수적입니다. LRSC를 50밀리리터 원심분리 튜브에 비웁힙시다.최대 50밀리리터까지 1배 의 PBS를 추가하고 섞습니다. 그런 다음, 매우 천천히, 평형 밀도 그라데이션 솔루션의 15 밀리리터 위에 믹스의 25 밀리리터를 추가합니다. 이 단계에서 위상을 혼합하지 않도록 주의하십시오.혈액은 이 단계의 방해 없이 밀도 그라데이션 용액에 추가되어야 합니다. 원심분리기는 700G에서 25분 동안 휴식을 취합니다. 밀도 그라데이션 원심분리의 끝에서, 바닥부터 상부까지의 층은 적혈구와 과립구이며, 펠릿, 밀도 그라데이션 솔루션 단계, PBMC 층 및 희석 된 플라즈마를 형성합니다.파이펫으로 플라즈마 상을 흡입하지 않고 통과합니다. 그런 다음 PBMC 층을 새로운 50 밀리리터 원심 분리 튜브로 수집합니다. 300G.에서 10분 동안 세척 설정 및 원심분리기로 PBMC에 최대 50밀리리터를 추가하고 대식세포 배지 40밀리리터로 펠릿을 다시 정지시합니다.말라세즈 챔버에 PBMC를 소파 후, 원심 분리 튜브에 실험을 수행하는 데 필요한 PBMC의 양을 전송. 300G.에서 10분 동안 세포를 원심분리하고 1,000만 PBMC당 선별 버퍼의 80마이크로리터에서 펠릿을 다시 중단한다. 그런 다음 1,000만 PBMC당 CD14 마이크로비드 20마이크로리터를 추가합니다.잘 섞고 일정한 동요 하에서 섭씨 4도에서 15분 동안 배양합니다. 인큐베이션에 따라 1,000만 PBMC당 1밀리리터의 정렬 버퍼를 세척 단계로 추가하고 원심분리기를 이전과 같이 추가합니다. 그런 다음, 1억 PBMC당 500마이크로리터의 선별 버퍼에서 상체를 흡인하고 다시 중단한다.이제 분리기의 자기장에 열을 배치합니다. 정렬 버퍼의 세 밀리리터로 컬럼을 헹구어 서 컬럼을 준비합니다. 셀 서스펜션을 열에 적용합니다.그런 다음 필요한 경우 후속 염색을 위해 레이블이 없는 셀을 포함하는 흐름을 수집합니다. 정렬 버퍼의 세 밀리리터로 컬럼을 세 번 세척합니다. 열을 말리지 않도록 주의하십시오.그런 다음 컬럼 아래에 수집 튜브를 놓고 분리기에서 제거합니다. 세척 후, 파이펫 5 밀리리터의 정렬 버퍼는 열로. 플런저를 컬럼으로 단단히 밀어 자석으로 표시된 세포를 즉시 플러시합니다.마지막으로 단핵구를 도금하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 대식세포 편광을 수행하기 전에 새 열로 이러한 단계를 반복합니다. 저산소 상태 분석을 수행하기 위해 산소 조절 환경에서 단핵구및 대식세포를 유지한다. 실험 중에 원하는 산소 부분 압력하에서 세포를 유지하기 위해 저산소작업스테이션을 사용한다.저산소압하에서 작업할 때는 역 아래의 모든 미디어 및 세척 버퍼를 준비하고 액체에서 올바른 부분 압력을 얻기에 충분히 기다리는 것이 중요합니다. 적응된 후드 아래 버퍼에서 셀 리시스를 수행합니다. 4-12%비스 트리스 아크릴아미드 젤에 각 샘플에 대해 300, 000 세포의 단백질을 적재한다.전기 전광 이동의 지속 시간을 제어하여 각 단백질 샘플이 여기에 표시된 대로 6개의 젤 밴드로 분할되도록 합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 고정 및 염색 한 후 깨끗한 메스로 단백질 밴드를 소비합니다. 500 마이크로 리터 튜브에 배치하기 전에 각 소비밴드를 주사위.이제 젤 슬라이스를 25밀리머암모늄 중탄산염 200마이크로리터에서 섭씨 37도에서 20분간 세 번 세척하여 각 단계 사이에 중탄산암보네이트를 폐기합니다. 25 밀리몰라 암모늄 중탄산염과 아세토닐릴에 한 번 씻고 이 것을 따르십시오. 그런 다음 10분 동안 100% 아세토나이트200 마이크로리터로 젤 조각을 탈수합니다.각 젤 조각을 10 밀리몰러 DTT와 25 밀리머 암모늄 중탄산염을 섭씨 56도에서 45분간 배양합니다. 그런 다음 DTT를 버리고 실온에서 어둠 속에서 35 분 동안 25 밀리마일라 요오도 아세타미드로 젤 조각을 배양하십시오. 알킬루션을 중지하려면 사용된 용액을 폐기하고 각 젤 조각을 실온에서 10분 동안 25밀리알라 암모늄 중탄산염에 10밀리머 DTT200 마이크로리터로 배양합니다.25 밀리모어 암모늄 중탄산염의 200 마이크로 리터에 젤 조각을 씻어. 그런 다음 10 분 동안 100 % 아세토나이트의 200 마이크로 리터로 탈수하십시오. 제조업체의 지시에 따라 트립신/Lys-C 믹스로 하룻밤 사이에 단백질을 섭씨 37도에서 소화합니다.저흡수 튜브에서 15분 동안 50마이크로리터50마이크로리터를 첨가하여 젤 조각에서 펩티드를 추출합니다. 15분 동안 50마이크로리터5%의 마이크로리터를 15분 동안 첨가한 후 15분 동안 100% 아세토나이트50마이크로리터를 추가합니다. 펩티드와 시료 손실의 흡수를 제한하기 위해 저흡수 튜브에서 각 분획을 당기고 건조시하십시오.텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 추가 분석이 될 때까지 샘플을 섭씨 80도에 저장합니다. 여기에 표시된 대표적인 순도는 CD14 양성 단핵구의 자기 비드 선택에 따라 유동 세포측정에 의해 평가된다. 분화된 인간 대식세포의 위상 대비 화상 진찰은 문화의 9 일 후에 2개의 다른 편광을 위한 얻어진 변종의 이질성을 보여줍니다.은 염색 SDS 페이지 젤을 사용한 오프젤 소화의 예가 표시됩니다. 세포 용해 및 용액 소화 후단백질의 평가는 용해 시 분해가 없는 것을 나타내며 소화효율을 나타낸다. 여기에 도시된 펩타이드의 충돌 유도 해리 스펙트럼은 양수 2의 전하를 가진 MS 스펙트럼에서 597.29의 질량 대 전하 비율에서 발견되는 펩티드의 예입니다.이 스펙트럼으로부터, 해당 서열이 결정되었다. 분석 후 최종 결과는 차별화된 표현 단백질을 사용하여 모든 편광 상태의 계층적 군집을 나타내는 열맵이다. 분석은 3%의 산소 조건에서 모든 편광에서 과발현되는 단백질의 클러스터를 제시합니다.이 절차를 시도하는 동안 프로토콜을 조정하기 위해 새 샘플에서 수행할 분획종류를 먼저 결정해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 일을 사용하여 proteomic 접근은 대식세포 생물학 편광 연구 결과의 필드에 있는 마지막 년 도중 이용된 게놈 접근에 상호 보완입니다. 개발 후, 이 기술은 인간과 또한 그밖 포유동물에서 면역 세포의 활성화의 각종 상태를 탐구하는 면역학의 필드에 있는 연구원을 위한 쪽을 포장합니다.DTT와 함께 작업하는 것은 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하려면 적응된 후드 아래에서 작업해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

연구

생화학

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

Proteomic 분석에 대 한 인간의 망막과 맥락 막의 RPE의 해 부

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

그들의 네이티브 셀룰러 환경에서 상황에 맞는 단백질 복합물의 분할-BioID-Proteomic 분석

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

안정적인 탄소 및 산소 동위 원소 분석을 위한 샘플링 및 치아에 나 멜의 전처리 탄산염

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

동적 Proteomic 그리고 미르 Langendorff 관류 후 절연 마우스 마음에서에서 Polysomes의 분석

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

생체 외에서 교정 무료 단백질 호모-oligomerization 상업 계측 및 무료, 오픈 소스 밝기 분석 소프트웨어를 사용 하 여의 정량화

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

혐 기성 단백질 정화 및 DesB Dioxygenase 활동을 연구 하 고 억제를 위한 산소 전극을 통해 운동 분석

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

측정 및 해석의 전체 산소 소비 속도 비행 머리 세그먼트

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

차에서 파생된 새로 설립된 세포 현탁액 배양에서 6개의 전신 살충제의 물질대사에 관한 연구(동백나무시넨시스 L.) 잎

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...