Name: proteomic analysis of human macrophage polarization under a low oxygen environment
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment at JoVE.com

AM er finansiert av unge gruppen leder Program (ATIP/Avenir Inserm-CNRS), av la Ligue Nationale contre le kreft og la ARC Fondation pour la recherche sur le kreft. Vi takker Mariette Matondo fra massespektrometri for biologi plattformen (UTECHS MSBIO, Pasteur Institute, Paris). Vi takker Lauren Anderson for hennes av manuskriptet.

Menneskelig blodprøver (LRSC) fra sunne, de identifiserte givere var oppnådd fra EFS (fransk nasjonale blod Service) som en del av en autorisert protokoll (CODECOH DC-2018-3114). Givere ga signert samtykke for bruk av blod.
1. Media og Buffer forberedelse
<ol><li>Forberede macrophage mediet [RPMI glutamax + 10 mM HEPES + 1 x ikke-essensielle aminosyrer (NEAA)] og varme den til 37 ° C.</li>
	<li>Forberede macrophage medium + 10% humant serum fra AB plasma (SAB), filtrere den (0.22 µm filt...

<ol>
	<li>Okabe, Y., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+biology+perspective+on+macrophages.">Tissue biology perspective on macrophages.</a> Nature Immunology. 17 (1), 9-17 (2016).</li><li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+plasticity+and+polarization:+in+vivo+veritas.">Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).</li><li>Murray, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+Polarization.">Macrophage Polarization.</a> Annual Review of Physiology. 79, 541-566 (2017).</li><li>Chinetti-Gbaguidi, G., Staels, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+polarization+in+metabolic+disorders:+functions+and+regulation.">Macrophage polarization in metabolic disorders: functions and regulation.</a> Current Opinion in Lipidology. 22 (5), 365-372 (2011).</li><li>Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+mononuclear+phagocyte+system+in+the+molecular+age.">Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).</li><li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation.">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).</li><li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets.">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).</li><li>Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+multidimensional+concept+of+macrophage+ontogeny,+activation+and+function.">New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function.</a> Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).</li><li>Xue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-based+network+analysis+reveals+a+spectrum+model+of+human+macrophage+activation.">Transcriptome-based network analysis reveals a spectrum model of human macrophage activation.</a> Immunity. 40 (2), 274-288 (2014).</li><li>Csete, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+in+the+cultivation+of+stem+cells.">Oxygen in the cultivation of stem cells.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1049, 1-8 (2005).</li><li>Johansson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional,+morphological,+and+phenotypical+differences+between+rat+alveolar+and+interstitial+macrophages.">Functional, morphological, and phenotypical differences between rat alveolar and interstitial macrophages.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 16 (5), 582-588 (1997).</li><li>Pfau, J. C., Schneider, J. C., Archer, A. J., Sentissi, J., Leyva, F. J., Cramton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+oxygen+tension+affects+phenotype+in+cultured+bone+marrow-derived+macrophages.">Environmental oxygen tension affects phenotype in cultured bone marrow-derived macrophages.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (2), L354-L362 (2004).</li><li>Grodzki, A. C. G., Giulivi, C., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+tension+modulates+differentiation+and+primary+macrophage+functions+in+the+human+monocytic+THP-1+cell+line.">Oxygen tension modulates differentiation and primary macrophage functions in the human monocytic THP-1 cell line.</a> PLoS One. 8 (1), e54926 (2013).</li><li>Court, M., Petre, G., Atifi, M. E., Millet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Signature+Reveals+Modulation+of+Human+Macrophage+Polarization+and+Functions+Under+Differing+Environmental+Oxygen+Conditions.">Proteomic Signature Reveals Modulation of Human Macrophage Polarization and Functions Under Differing Environmental Oxygen Conditions.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 16 (12), 2153-2168 (2017).</li><li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+proteome-wide+label-free+quantification+by+delayed+normalization+and+maximal+peptide+ratio+extraction,+termed+MaxLFQ.">Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).</li><li>Cox, J., Neuhauser, N., Michalski, A., Scheltema, R. A., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Andromeda:+a+peptide+search+engine+integrated+into+the+MaxQuant+environment.">Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment.</a> Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).</li><li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes.">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li><li>Court, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+standardized+urine+proteome+analysis+methodology.">Toward a standardized urine proteome analysis methodology.</a> Proteomics. 11 (6), 1160-1171 (2011).</li><li>Wi&#347;niewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).</li><li>Liebler, D. C., Ham, A. -. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spin+filter-based+sample+preparation+for+shotgun+proteomics.">Spin filter-based sample preparation for shotgun proteomics.</a> Nature Methods. 6 (11), 785-786 (2009).</li><li>Hubner, N. C., Ren, S., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+separation+with+immobilized+pI+strips+is+an+attractive+alternative+to+in-gel+protein+digestion+for+proteome+analysis.">Peptide separation with immobilized pI strips is an attractive alternative to in-gel protein digestion for proteome analysis.</a> Proteomics. 8 (23-24), 4862-4872 (2008).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Informed-Proteomics:+open-source+software+package+for+top-down+proteomics.">Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics.</a> Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).</li><li>Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+oxygen+and+culture+media+on+plating+efficiency+of+some+mammalian+tissue+cells.">Influence of oxygen and culture media on plating efficiency of some mammalian tissue cells.</a> Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).</li><li>Packer, L., Fuehr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+oxygen+concentration+extends+the+lifespan+of+cultured+human+diploid+cells.">Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells.</a> Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).</li><li>Lengner, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+pre-X+inactivation+human+embryonic+stem+cells+under+physiological+oxygen+concentrations.">Derivation of pre-X inactivation human embryonic stem cells under physiological oxygen concentrations.</a> Cell. 141 (5), 872-883 (2010).</li><li>Sidoli, S., Kulej, K., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+proteomics+is+not+the+new+genomics+and+the+future+of+mass+spectrometry+in+cell+biology.">Why proteomics is not the new genomics and the future of mass spectrometry in cell biology.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 21-24 (2017).</li></ol>

Proteomikk er et kraftig verktøy for å studere uttrykk for ulike proteiner fra en hel celle eller subcellular rom, er optimalisering av cellen lysis protokollen og fordøyelse av proteiner rettet av en rekke studier. Det er tre hovedgrupper av metoder, inkluderer i-gel fordøyelse (fordøyelsen av proteiner i polyakrylamid gel matrix)17, fordøyelsen løsning18 og filter-hjulpet eksempel forberedelse19. Denne siste metoden, først beskrevet som uni...

Makrofager er medfødte immunceller involvert i en rekke fysiologiske funksjoner mellom Svar å smittsomme patogener vev homeostase, inkludert fjerning av apoptotisk celler og ombygging av ekstracellulær matrix1. Disse cellene er preget av en sterk fenotypiske plastisitet2 som oversetter til en mange mulig aktivering stater, også kalt polarisasjonene. Den presise molekylære beskrivelsen av disse ulike polarisasjonene prioriteres innen macrophage biologi3. Det har blitt foreslått å klassifisere disse polarisasjonene bruker den såkalte M1/M2 motsetningen, der M1 representerer pro-inflammatoriske og M2 representerer anti-inflammatorisk makrofager. Denne modellen passer godt i ulike patologisk situasjoner som akutte infeksjoner, allergi og fedme4. Men i kronisk betent vev og kreft, har det vært vist at klassifiseringen er i stand til å forstå bred fenotypiske repertoaret makrofager presenterer i visse mobilnettet miljøer5,6, 7. den gjeldende konsensus er at macrophage polarisering er bedre beskrevet med en flerdimensjonal modell for å integrere microenvironmental sender8. Denne konklusjonen er bekreftet gjennom transcriptomic analyse av menneskelig makrofager viser at M1/M2 modellen er ineffektive i beskriver innhentet polarisasjonene9.
Studien presentert mål å gi en protokoll for å få proteomic signaturer av ulike polarisasjonene i menneskelig makrofager. Vi beskriver hvordan å skille menneskelig makrofager i miljøer med ulike oksygennivået og få peptider fra hele macrophage proteom til å utføre en etikett-fri kvantifisering. Denne kvantifisering tillater sammenligning av uttrykket nivåer av. Som forskning på stamceller har avdekket betydningen av oksygen som en miljømessig Nøkkelparameteren10, søker vi å forstå hvordan denne vev-parameteren kan påvirke macrophage polarisering i mennesker. Delvis trykket av oksygen har funnet å rekkevidde fra 3 til 20% (av totale lufttrykk) i menneskekroppen, der 20% tilsvarer omtrent til hva er vanligvis brukes i en celle kultur inkubator (den nøyaktige verdien er rundt 18.6% mens du tar er tilstedeværelsen av vann i betraktning).
Tidligere arbeid har vist at alveolar avvike fra interstitiell makrofager fra funksjonelle og morfologiske hensikten utsikt11 og som disse forskjellene er trolig delvis på grunn av ulike oksygen nivåer som de er utsatt12. Videre viser Ben margtransplantasjon-avledet makrofager en økt evne til å phagocytize bakterier utsettes for en oksygen miljø12. Motsatte er funnet for THP1-differensiert menneskelige makrofager13, men disse resultatene støtter ideen om at oksygen er en regulator macrophage biologi og at det er nødvendig å avklare denne rollen på molekylært nivå i menneskelig makrofager. I en tidligere studie, har vi brukt en Proteomikk tilnærming for å løse disse problemene. Ved å måle uttrykk nivåer for tusenvis av proteiner samtidig, vi fremhevet virkningen av oksygen på polarisering og laget en liste over nye molekylære markører. Vi var også i stand til å relatere disse funnene til noen makrofager funksjoner. Spesielt fant vi at frekvensen av fagocytose apoptotisk celler ble økt i IL4/IL13-polarisert makrofager, som var knyttet til oppregulering av ALOX15 som åpenbart av proteomic analyse14. I studien beskriver vi hvordan du utfører slik analyse.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hypoxia Working Station</td>
			<td>Oxford Optronix</td>
			<td>Hypoxylab</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C6 Flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>Accuri C6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5188-6435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (FA)</td>
			<td>ARISTAR</td>
			<td>450122M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-250 Coomassie blue</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1,610,436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide, E.Coli (LPS)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>437627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2D clean-up kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>80-6484-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium, glutamax supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1 M</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) Solution 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harvard Apparatus column Reverse C18 micro spin column</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>74-4601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5 M, pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Bis-Tris 4-12%</td>
			<td>Life Technologies SAS</td>
			<td>NP0321 BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 Microbeads human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS separation column LS</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 4 (IL4)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 13 (IL13)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-112-410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interferon gamma (INF&#947;)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14-FITC (clone T&#220;K4)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-080-701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSmix Tube Rotator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic Acid (TFA)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>28904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/Lys-C Mix</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>V5073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Mini, EDTA-free Protease Inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density Gradient Solution (Histopaque 1077)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10771-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accumax</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7089-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum from human male AB plasma (SAB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4522-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) solution 30%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9576-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisma-base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>49767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>114405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 20%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>57670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiourea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C9426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL sterile plastic pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer C Eppendorf</td>
			<td>VWR</td>
			<td>460-0223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak tC18 reverse phase cartridges, 100 mg</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT036820</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proteomic analysis of human macrophage polarization under a low oxygen environment

Makrofager er medfødte immunceller involvert i en rekke fysiologiske funksjoner mellom Svar å smittsomme patogener vev homeostase. De forskjellige funksjonene i disse cellene er knyttet til deres aktivisering stater, som også kalles polarisering. Den presise molekylære beskrivelsen av disse ulike polarisasjonene prioriteres innen macrophage biologi. Det er nå anerkjent som en flerdimensjonal tilnærming er nødvendig å beskrive hvordan polarisering er kontrollert av Miljøsignaler. I denne rapporten beskriver vi utviklet å få proteomic signaturen av ulike polarisasjonene i menneskelig makrofager. Denne protokollen er basert på en etikett-fri kvantifisering av macrophage protein uttrykk innhentet fra in-gel fraksjonert og Lys C/trypsin-fordøyd mobilnettet lysis innhold. Vi tilbyr også en protokoll basert på-løsning fordøyelsen og isoelectric fokuserer fraksjoneres å bruke som et alternativ. Oksygen konsentrasjon er relevante miljømessige parameter i vev, vi bruk denne protokollen til å utforske hvordan atmosfærens sammensetning eller et lavt oksygeninnhold miljø påvirker klassifiseringen av macrophage polarisering.

Utgangspunkt i perifert blod mononukleære celler (PBMCs) ved differensial sentrifugering, protokollen tillater å oppnå en befolkning på CD14+ monocytter med en vurdert renhet på mer enn 98% av flowcytometri (figur 1). Disse monocytter skilles sekundært mot ulike polarisasjonene (figur 2). Når en fraksjoneres på gel er valgt, overføringen på SDS side gels er tilpasset å få antall ønskede felt, og feltene er...

Watch this Scientific Journal Video about Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment at JoVE.com

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Vi presenterer en protokoll for å skaffe proteomic signaturer av menneskelig makrofager og dette gjelder fastsettelse av virkningen av et lavt oksygeninnhold miljø macrophage polarisering.

Proteomic analyse av menneskelig Macrophage polarisering Under et lavt oksygeninnhold miljø

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Så denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i makrofagbiologifeltet, for eksempel hvordan man karakteriserer aktiveringstilstanden under ulike miljøer på proteinnivå. Den største fordelen med denne teknikken er at den gir mulighet til å oppnå forskjellig uttrykk for mange proteiner i menneskelige makrofager ved hjelp av etikettfri kvantifiseringsmetode. Å demonstrere prosedyren vil være Marie Malier og Magali Court fra laboratoriet mitt.Til å begynne med legger du til 15 milliliter med tetthetsgradientcelleseparasjonsløsning i hver av to 50 milliliter sentrifugeringsrør, slik at løsningen kan varmes opp til romtemperatur før du mottar LRSC. Dette er viktig som tetthet avhenger av temperatur. Tøm LRSC i et 50 milliliter sentrifugeringsrør.Tilsett 1x PBS opptil 50 milliliter og bland. Deretter, veldig sakte, tilsett 25 milliliter av blandingen på toppen av 15 milliliter med likevektstetthetsgradientløsning. Vær forsiktig så du ikke blander fasene i løpet av dette trinnet.Blodet må tilsettes på tetthetsgradientløsningen uten forstyrrelser i denne fasen. Sentrifuge begge sentrifugeringsrørene i 25 minutter ved 700 G uten pauser. På slutten av tetthet gradient sentrifugering, lagene fra bunnen til toppen er erytrocytter og granulocytter, danner pellet, tetthet gradient løsning fase, et lag av PBMCer, og fortynnet plasma.Med en pipette, passere gjennom plasmafasen uten å aspirere den. Deretter samler du PBMC-laget i et nytt 50 milliliter sentrifugeringsrør. Legg til opptil 50 milliliter 1x PBS til PBMCene som vaskeoppsett og sentrifuge i 10 minutter ved 300 G.Aspirer den overnaturlige og re-suspendere pellet i 40 milliliter makrofag medium.Etter å ha sofaet PBMCene i et Malassez-kammer, overføre mengden PBMCer som er nødvendige for å gjennomføre eksperimentet til et sentrifugeringsrør. Sentrifuger cellene i 10 minutter ved 300 G.Aspirer supernatanten og re-suspendere pellet i 80 mikroliter av sorteringsbufferen per 10 millioner PBMCer. Deretter legger du til 20 mikroliter cd14 mikroperler per 10 millioner PBMCer.Bland godt, og inkuber i 15 minutter ved 4 grader Celsius under konstant agitasjon. Etter inkubasjon legger du til én milliliter sorteringsbuffer per 10 millioner PBMCer som vasketrinn, og sentrifuge som før. Deretter aspirerer du overnaturanten og re-suspendere pellet i 500 mikroliter sorteringsbuffer per 100 millioner PBMCer.Plasser nå en kolonne i skilletegnets magnetfelt. Forbered kolonnen ved å skylle den med tre milliliter sorteringsbuffer. Bruk cellesuspensjonen på kolonnen.Deretter samler strømmen gjennom inneholder umerkede celler for etterfølgende farging, om nødvendig. Vask kolonnen tre ganger med tre milliliter sorteringsbuffer. Vær forsiktig så du ikke tørker kolonnen.Deretter plasserer du et oppsamlingsrør under kolonnen og fjerner det fra separatoren. Etter vasken, pipette fem milliliter sorteringsbuffer inn i kolonnen. Skyll umiddelbart ut de magnetisk merkede cellene ved å skyve stempelet godt inn i kolonnen.Til slutt gjentar du disse trinnene med en ny kolonne før du plating monocytter og utfører makrofagpolarisering som beskrevet i tekstprotokollen. Vedlikehold monocytter og makrofager i et oksygenkontrollert miljø for å utføre hypoksisk tilstandsanalyse. Bruk en hypoksi arbeidsstasjon for å opprettholde celler under ønsket oksygen delvis trykk under forsøket.Når du arbeider under lavt oksygentrykk, er det viktig å forberede alle medier og vaskebuffere under stasjonen, og vente tilstrekkelig for å oppnå riktig delvis trykk i væsken. Utfør cellelys i en buffer under en tilpasset hette. Last proteinekvivalenten til 300 000 celler for hver prøve på 4-12% bis-tris akrylamidgeler.Kontroller varigheten av den elektroforetiske migrasjonen slik at hver proteinprøve kan deles inn i seks gelbånd som vist her. Etter å ha fikset og farging som beskrevet i tekstprotokollen, avgiftsdirektoratet proteinbåndene med en ren skalpell. Terninger hvert utskåret bånd før du plasserer dem i 500 mikroliters rør.Vask nå gelskivene tre ganger i 200 mikroliter på 25 millimolar ammoniumbikarbonat i 20 minutter ved 37 grader Celsius, og kast ammoniumbikarbonatet mellom hvert trinn. Følg dette med en vask i 25 millimolar ammoniumbikarbonat og acetonitril. Deretter dehydrerer gelbitene med 200 mikroliter på 100% acetonitril i 10 minutter.Inkuber hvert gelstykke med 10 millimolar DTT og 25 millimolar ammoniumbikarbonat i 45 minutter ved 56 grader Celsius. Deretter kast DTT og inkuber gelstykket med 55 millimolar iodoacetamid i 25 millimolar ammoniumbikarbonat i 35 minutter i mørket ved romtemperatur. For å stoppe alkylering, kast den brukte oppløsningen og inkuber hvert gelstykke med 200 mikroliter på 10 millimolar DTT i 25 millimolar ammoniumbikarbonat i 10 minutter ved romtemperatur.Vask gelbitene i 200 mikroliter på 25 millimolar ammoniumbikarbonat. Deretter dehydrerer med 200 mikroliter på 100% acetonitril i 10 minutter. Fordøy proteinene over natten ved 37 grader Celsius med Trypsin /Lys-C Mix i henhold til produsentens instruksjoner.Trekk ut de resulterende peptidene fra gelbiter ved å legge til 50 mikroliter på 50% acetonitril i 15 minutter i lavabsorpsjonsrør. Etter å ha lagt til 50 mikroliter med 5% maursyre i 15 minutter, legg til 50 mikroliter på 100% acetonitril i 15 minutter. Trekk og tørk hver brøkdel i lavabsorpsjonsrør for å begrense absorpsjonen av peptider og prøvetap.Oppbevar prøvene ved 80 grader Celsius inntil videre analyse som beskrevet i tekstprotokollen. Vist her er den representative renheten vurdert av strømningscytometri etter magnetisk perlevalg av CD14 positive monocytter. Fasekontrastavbildning av differensierte menneskelige makrofager viser heterogenitet av oppnådde morfologier for to forskjellige polariseringer etter ni dager med kultur.Et eksempel på en off-gel fordøyelse ved hjelp av sølv-farget SDS side geler er vist. Evaluering av protein fra cellelysis og etter fordøyelsen i løsningen viser fraværet av nedbrytning under lysis og effektiviteten av fordøyelsen. Vist her er et eksempel på en kollisjon-indusert dissosiasjon spekter av et peptid funnet på masse-til-lade ratio på 597,29 på MS spekteret med en elektrisk ladning av positive to.Fra dette spekteret ble den tilsvarende sekvensen bestemt. Det endelige resultatet etter analyse er et varmekart som representerer den hierarkiske klyngen av alle polariseringsstater ved hjelp av differensialt uttrykte proteiner. Analyse avslører en klynge av proteiner overut uttrykt i alle polariseringer i 3% oksygentilstand.Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske at du må først bestemme hva slags fraksjonering du vil utføre på nye prøver for å tilpasse protokollen tilsvarende. Den proteomiske tilnærmingen ved hjelp av dette arbeidet er komplementære til genomiske tilnærminger som har blitt brukt de siste årene innen makrofagbiologipolariseringsstudier. Etter utviklingen baner denne teknikken vei for forsker innen immunologi for å utforske de ulike tilstander av aktivering av immunceller hos mennesker og også hos andre pattedyr.Ikke glem at det å arbeide med DTT kan være farlig, så du må jobbe under en tilpasset hette for å gjøre denne prosedyren.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Løse affinitetsrenset protein komplekser av Blå Native PAGE og Protein korrelasjon Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

Disseksjon av Human netthinnen og RPE-akkord for Proteomic analyse

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID-Proteomic analyse av kontekstavhengige Protein komplekser i sitt opprinnelige mobilnettet miljø

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

Prøvetaking og forbehandling av tannemaljen karbonat stabil karbon-og oksygen isotop analyse

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Dynamisk Proteomic og miRNA analyse av Polysomes fra isolert musen hjertet etter Langendorff perfusjon

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrering-fri In Vitro kvantifisering av Protein Homo-oligomerization med kommersielle instrumentering og gratis, åpen kildekode lysstyrke analyseprogramvare

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Anaerob Protein rensing og kinetisk analyse via oksygen elektrode for å studere DesB Dioxygenase aktivitet og hemming

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Måling og tolke oksygen forbruk priser helt Fly hodet segmenter

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Studier på metabolismen av seks systemiske insektmidler i en nylig etablert Cell suspensjon kultur avledet fra Tea (Camellia Sinensis L.) Blader

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...