Name: proteomic analysis of human macrophage polarization under a low oxygen environment
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment at JoVE.com

AM финансируется по программе лидер группы молодых (ATIP/Avenir Inserm-CNRS), la le Национальная лига против рака и la Fondation дуги pour la recherche sur le рака. Мы благодарим Mariette Матондо от масс-спектрометрии для биологии платформы (UTECHS MSBIO, Институт Пастера, Париж). Мы благодарим Лорен Андерсон за ее чтение рукописи.

Образцы крови человека (LRSC) от здоровых, обезличенных доноров были получены из EFS (Французская Национальная служба крови) как часть протокола уполномоченным (CODECOH DC-2018 – 3114). Доноры дали подписанного согласия для использования крови.
1. средства массовой информации и подгот?...

<ol>
	<li>Okabe, Y., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+biology+perspective+on+macrophages.">Tissue biology perspective on macrophages.</a> Nature Immunology. 17 (1), 9-17 (2016).</li><li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+plasticity+and+polarization:+in+vivo+veritas.">Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).</li><li>Murray, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+Polarization.">Macrophage Polarization.</a> Annual Review of Physiology. 79, 541-566 (2017).</li><li>Chinetti-Gbaguidi, G., Staels, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+polarization+in+metabolic+disorders:+functions+and+regulation.">Macrophage polarization in metabolic disorders: functions and regulation.</a> Current Opinion in Lipidology. 22 (5), 365-372 (2011).</li><li>Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+mononuclear+phagocyte+system+in+the+molecular+age.">Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).</li><li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation.">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).</li><li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets.">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).</li><li>Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+multidimensional+concept+of+macrophage+ontogeny,+activation+and+function.">New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function.</a> Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).</li><li>Xue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-based+network+analysis+reveals+a+spectrum+model+of+human+macrophage+activation.">Transcriptome-based network analysis reveals a spectrum model of human macrophage activation.</a> Immunity. 40 (2), 274-288 (2014).</li><li>Csete, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+in+the+cultivation+of+stem+cells.">Oxygen in the cultivation of stem cells.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1049, 1-8 (2005).</li><li>Johansson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional,+morphological,+and+phenotypical+differences+between+rat+alveolar+and+interstitial+macrophages.">Functional, morphological, and phenotypical differences between rat alveolar and interstitial macrophages.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 16 (5), 582-588 (1997).</li><li>Pfau, J. C., Schneider, J. C., Archer, A. J., Sentissi, J., Leyva, F. J., Cramton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+oxygen+tension+affects+phenotype+in+cultured+bone+marrow-derived+macrophages.">Environmental oxygen tension affects phenotype in cultured bone marrow-derived macrophages.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (2), L354-L362 (2004).</li><li>Grodzki, A. C. G., Giulivi, C., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+tension+modulates+differentiation+and+primary+macrophage+functions+in+the+human+monocytic+THP-1+cell+line.">Oxygen tension modulates differentiation and primary macrophage functions in the human monocytic THP-1 cell line.</a> PLoS One. 8 (1), e54926 (2013).</li><li>Court, M., Petre, G., Atifi, M. E., Millet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Signature+Reveals+Modulation+of+Human+Macrophage+Polarization+and+Functions+Under+Differing+Environmental+Oxygen+Conditions.">Proteomic Signature Reveals Modulation of Human Macrophage Polarization and Functions Under Differing Environmental Oxygen Conditions.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 16 (12), 2153-2168 (2017).</li><li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+proteome-wide+label-free+quantification+by+delayed+normalization+and+maximal+peptide+ratio+extraction,+termed+MaxLFQ.">Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).</li><li>Cox, J., Neuhauser, N., Michalski, A., Scheltema, R. A., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Andromeda:+a+peptide+search+engine+integrated+into+the+MaxQuant+environment.">Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment.</a> Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).</li><li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes.">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li><li>Court, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+standardized+urine+proteome+analysis+methodology.">Toward a standardized urine proteome analysis methodology.</a> Proteomics. 11 (6), 1160-1171 (2011).</li><li>Wi&#347;niewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).</li><li>Liebler, D. C., Ham, A. -. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spin+filter-based+sample+preparation+for+shotgun+proteomics.">Spin filter-based sample preparation for shotgun proteomics.</a> Nature Methods. 6 (11), 785-786 (2009).</li><li>Hubner, N. C., Ren, S., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+separation+with+immobilized+pI+strips+is+an+attractive+alternative+to+in-gel+protein+digestion+for+proteome+analysis.">Peptide separation with immobilized pI strips is an attractive alternative to in-gel protein digestion for proteome analysis.</a> Proteomics. 8 (23-24), 4862-4872 (2008).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Informed-Proteomics:+open-source+software+package+for+top-down+proteomics.">Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics.</a> Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).</li><li>Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+oxygen+and+culture+media+on+plating+efficiency+of+some+mammalian+tissue+cells.">Influence of oxygen and culture media on plating efficiency of some mammalian tissue cells.</a> Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).</li><li>Packer, L., Fuehr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+oxygen+concentration+extends+the+lifespan+of+cultured+human+diploid+cells.">Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells.</a> Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).</li><li>Lengner, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+pre-X+inactivation+human+embryonic+stem+cells+under+physiological+oxygen+concentrations.">Derivation of pre-X inactivation human embryonic stem cells under physiological oxygen concentrations.</a> Cell. 141 (5), 872-883 (2010).</li><li>Sidoli, S., Kulej, K., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+proteomics+is+not+the+new+genomics+and+the+future+of+mass+spectrometry+in+cell+biology.">Why proteomics is not the new genomics and the future of mass spectrometry in cell biology.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 21-24 (2017).</li></ol>

Потому что протеомики является мощным инструментом для изучения выражение различных белков от всей ячейки или субцеллюлярные отсеков, Оптимизация протокола лизис клеток и переваривание белков рассматривался ряд исследований. Существует три основных класса методов, которые включают...

Макрофаги являются врожденные иммунные клетки участвуют в осуществлении ряда физиологических функций, начиная от ответов на инфекционных возбудителей ткани гомеостаза, включая вывоз apoptotic клеток и реорганизацию внеклеточная матрица1. Эти клетки характеризуются сильной фенотипические пластичности2 , который переводит на многие государства возможности активации, которые также называются поляризаций. Молекулярные точное описание этих различных поляризациях является одной из приоритетных задач в области биологии макрофагов3. Было предложено классифицировать эти поляризаций, используя так называемые дихотомия М1/м2, в котором M1 представляет провоспалительных и м2 представляет противовоспалительное макрофагов. Эта модель хорошо вписывается в различных патологических ситуациях как острые инфекции, аллергии и ожирение4. Однако в хронически воспаленных тканей и рака, было продемонстрировано, что эта классификация не в состоянии понять широкий репертуар фенотипические, что макрофаги в некоторых сотовых средах5,6, 7. Нынешний консенсус является что макрофагов поляризации лучше описывается использование многомерной модели для интеграции конкретных сигналов microenvironmental8. Этот вывод был подтвержден путем анализа транскриптомики человека макрофагов, показывая, что модель М1/м2 является неэффективным в описании полученные поляризаций9.
Это исследование представлено призвана обеспечить протокол для получения proteomic подписи различных поляризациях в человека макрофагов. Мы опишем, как отличить человека макрофагов в средах различных уровней кислорода и получать пептиды от всей макрофагов протеома выполнить количественную оценку лейбл бесплатно. Эта количественная оценка позволяет сравнивать уровни выражения различных белков. Как исследование стволовых клеток показал важность кислорода в качестве экологического параметра key10, мы стремимся понять, как этот параметр ткани может повлиять макрофагов поляризации в организме человека. Парциальное давление кислорода было установлено в диапазоне от 3 до 20% (общее атмосферное давление) в человеческом теле, где 20% примерно соответствует то, что обычно используется в инкубатор культуры клеток (точное значение составляет 18,6% принимая присутствие воды во внимание).
Предыдущие работы показал, что альвеолярные отличаются от интерстициальных макрофаги от функциональных и морфологической точки просмотров11 и что эти различия, вероятно, частично из-за различных кислорода, которым они подвергаются12. Кроме того костного мозга, полученных макрофаги показывают увеличение способность фагоцитируют бактерий при контакте с низким содержанием кислорода среды12. Противоположный эффект было найдено для THP1-продифференцировано человека макрофаги13, но эти результаты поддерживают идею, что кислород является регулятор макрофагов биологии и что это необходимо уточнить эту роль на молекулярном уровне в человека макрофагов. В предыдущем исследовании мы применили протеомики подход к решению этих вопросов. Путем измерения уровня выражения для тысяч белков одновременно, мы подчеркнул влияние кислорода на поляризации и представила список новых молекулярных маркеров. Мы также смогли увязать эти результаты некоторых функций макрофагов. В частности мы обнаружили, что уровень фагоцитоз apoptotic клеток был увеличен в IL4/IL13-поляризованных макрофагов, который был связан с upregulation ALOX15, как свидетельствуют протеомного анализа14. В настоящем исследовании мы опишем, как для выполнения такого анализа.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hypoxia Working Station</td>
			<td>Oxford Optronix</td>
			<td>Hypoxylab</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C6 Flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>Accuri C6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5188-6435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (FA)</td>
			<td>ARISTAR</td>
			<td>450122M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-250 Coomassie blue</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1,610,436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide, E.Coli (LPS)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>437627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2D clean-up kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>80-6484-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium, glutamax supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1 M</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) Solution 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harvard Apparatus column Reverse C18 micro spin column</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>74-4601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5 M, pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Bis-Tris 4-12%</td>
			<td>Life Technologies SAS</td>
			<td>NP0321 BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 Microbeads human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS separation column LS</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 4 (IL4)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 13 (IL13)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-112-410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interferon gamma (INF&#947;)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14-FITC (clone T&#220;K4)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-080-701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSmix Tube Rotator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic Acid (TFA)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>28904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/Lys-C Mix</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>V5073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Mini, EDTA-free Protease Inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density Gradient Solution (Histopaque 1077)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10771-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accumax</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7089-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum from human male AB plasma (SAB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4522-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) solution 30%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9576-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisma-base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>49767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>114405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 20%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>57670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiourea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C9426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL sterile plastic pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer C Eppendorf</td>
			<td>VWR</td>
			<td>460-0223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak tC18 reverse phase cartridges, 100 mg</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT036820</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proteomic analysis of human macrophage polarization under a low oxygen environment

Макрофаги являются врожденные иммунные клетки, участвует в ряде физиологических функций, начиная от ответов на инфекционных возбудителей ткани гомеостаза. Различные функции этих клеток связаны с их активации государств, которая также называется поляризации. Молекулярные точное описание этих различных поляризациях является одной из приоритетных задач в области биологии макрофагов. В настоящее время признается, что многоаспектный подход необходимо описать как поляризации контролируется экологические сигналы. В настоящем докладе мы описываем протокол, разработанный для получения proteomic подписания различных поляризациях в человека макрофагов. Этот протокол основан на лейбл свободный количественной оценки экспрессии белков макрофагов, полученные из геля фракционированный и Lys C/трипсина переваривается лизис клеточных содержание. Мы также предоставляем протокол, основанный на пищеварение-решение и изоэлектрического, сосредоточив внимание фракционирование для использования в качестве альтернативы. Поскольку концентрация кислорода соответствующих экологических параметров в тканях, мы используем этот протокол для изучения состава как атмосферы или среде с низким содержанием кислорода влияет на классификации макрофагов поляризации.

Начиная от мононуклеарных клеток периферической крови (получения) получено дифференциального центрифугирования, Протокол допускает получение населением CD14+ моноциты с начисленных чистоты более чем 98% проточной цитометрии (рис. 1). Вторично эти м...

Watch this Scientific Journal Video about Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment at JoVE.com

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Мы представляем протокол для получения подписи proteomic человека макрофагов и применить это к определению влияния среды низким содержанием кислорода на макрофагов поляризации.

Протеомного анализа человека макрофагов поляризации в среде с низким содержанием кислорода

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Таким образом, этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии макрофагов, например, как охарактеризовать состояние активации в различных средах на уровне белка. Основным преимуществом этого метода является то, что он дает возможность получить различное выражение многих белков в макрофагах человека с помощью метода количественной оценки без этикетки. Демонстрация процедуры будет Мари Малиер и Магали суд из моей лаборатории.Для начала добавьте 15 миллилитров раствора разделения градиентных клеток плотности в каждую из двух 50 миллилитровых центрифугированных трубок, чтобы раствор можно было прогреть до комнатной температуры перед получением LRSC. Это важно, так как плотность зависит от температуры. Опустите LRSC в 50 миллилитров центрифугации трубки.Добавить 1x PBS до 50 миллилитров и перемешать. Затем, очень медленно, добавьте 25 миллилитров смеси поверх 15 миллилитров эквивалентного градиентного раствора плотности. Будьте осторожны, чтобы не смешивать фазы во время этого шага.Кровь должна быть добавлена на плотность градиентного раствора без каких-либо нарушений этой фазы. Центрифуга обеих центрифугации труб в течение 25 минут при 700 G без перерывов. В конце градиентной центрифугации плотности слоями снизу вверх являются эритроциты и гранулоциты, образующие гранулы, фазу градиентного раствора плотности, слой ПХМВ и разбавленную плазму.С пипеткой, пройти через плазменную фазу, не аспирируя его. Затем соберите слой PBMC в новую 50-миллилитровую центрифугированную трубку. Добавить до 50 миллилитров 1x PBS для ПКМК в качестве стиральной установки и центрифуги в течение 10 минут при 300 Г.Аспират супернатанта и повторно приостановить гранулы в 40 миллилитров макрофагов среды.После установки ПМГ в малазезской камере перенесите количество ПМГ, необходимое для проведения эксперимента, в центрифугированную трубку. Центрифуга клетки в течение 10 минут при 300 Г.Аспирировать супернатант и повторно приостановить гранулы в 80 микролитров сортировки буфера на 10 миллионов ПКМК. Затем добавьте 20 микролитров микропивоварни CD14 microbeads на 10 миллионов ПКМК.Хорошо перемешать и инкубировать в течение 15 минут при 4 градусах Цельсия при постоянном возбуждении. После инкубации добавьте один миллилитр буфера сортировки на 10 миллионов ПМГ в качестве шага для мытья и центрифуги, как раньше. Затем аспирировать супернатант и повторно приостановить гранулы в 500 микролитров сортировки буфера на 100 миллионов ПКМК.Теперь поместите столбец в магнитное поле сепаратора. Подготовь столбец, опоясыв его тремя миллилитров буфера сортировки. Нанесите подвеску ячейки на столбец.Затем соберите поток через содержащие неоцеличные клетки для последующего окрашивания, если это необходимо. Вымойте столбец три раза тремя миллилитров буфера сортировки. Будьте осторожны, чтобы не высушить колонку.Затем поместите трубку сбора под колонку и удалите ее из сепаратора. После мытья, пипетка пять миллилитров сортировки буфера в колонку. Немедленно промыть магнитно помеченные клетки, твердо толкая поршень в колонку.Наконец, повторите эти шаги с помощью новой колонки, прежде чем помыть моноциты и выработать макрофаг поляризации, как описано в текстовом протоколе. Поддерживайте моноциты и макрофаги в контролируемой кислородом среде для проведения гипоксического анализа состояния. Используйте гипоксию рабочей станции для поддержания клеток под желаемым кислородом частичное давление во время эксперимента.При работе под низким давлением кислорода, важно подготовить все средства массовой информации и стиральные буферы под станцией, и ждать достаточно, чтобы получить правильное частичное давление в жидкости. Выполните лиз ячейки в буфере под адаптированным капюшоном. Загрузите белковый эквивалент 300 000 клеток для каждого образца на 4-12%bis-tris акриламидных гелей.Контролйте продолжительность электрофоретической миграции, чтобы позволить каждому образцу белка разделиться на шесть полос геля, как показано здесь. После фиксации и окрашивания, как описано в текстовом протоколе, акциз белковых полос с чистым скальпелем. Нарезать кубиками каждую вырезанную полосу перед размещением их в 500 микролитровых трубок.Теперь, мыть гель ломтиками три раза в 200 микролитров 25 миллимолярный бикарбонат аммония в течение 20 минут при 37 градусов по Цельсию, отбрасывая бикарбонат аммония между каждым шагом. Следуйте этому с одной стирки в 25 миллимолярия бикарбоната и ацетонитрила. Затем обезвоживать кусочки геля 200 микролитров 100%ацетонитрила в течение 10 минут.Инкубировать каждый кусок геля с 10 миллимолярд DTT и 25 миллимолярия бикарбоната в течение 45 минут при 56 градусов по Цельсию. Затем отбросьте DTT и инкубировать гель кусок с 55 миллимолярной иодоацетамида в 25 миллимолярия бикарбоната аммония в течение 35 минут в темноте при комнатной температуре. Чтобы остановить алкиляцию, отбросьте использованный раствор и инкубировать каждый кусок геля с 200 микролитров 10 миллимолярный DTT в 25 миллимолярный бикарбонат аммония в течение 10 минут при комнатной температуре.Вымойте кусочки геля в 200 микролитров 25 миллимолярный бикарбонат аммония. Затем обезвоживают 200 микролитров 100%ацетонитрила в течение 10 минут. Перемешайте белки на ночь при 37 градусах по Цельсию с помощью trypsin/Lys-C Mix в соответствии с инструкциями производителя.Извлекайте полученные пептиды из кусочков геля, добавляя 50 микролитров 50%ацетонитрила в течение 15 минут в трубках с низким поглощением. После добавления 50 микролитров 5% кремовой кислоты в течение 15 минут, добавить 50 микролитров 100%ацетонитрил в течение 15 минут. Вытяните и высушите каждую фракцию в низкопоглощенных трубках, чтобы ограничить поглощение пептидов и потерю образца.Храните образцы при 80 градусах по Цельсию до дальнейшего анализа, подробно описанного в текстовом протоколе. Здесь показана репрезентативная чистота, оцениваемая цитометрией потока после выбора магнитной шариком положительных моноцитов CD14. Фазовая контрастная визуализация дифференцированных человеческих макрофагов показывает неоднородность полученных морфологий для двух различных поляризаций после девяти дней культуры.Показан пример переваривания вне геля с использованием окрашенных в серебро гелей SDS-страниц. Оценка белка из клеточного лиза и после пищеварения в растворе показывает отсутствие деградации во время лиза и эффективность пищеварения. Здесь показан пример столкновения индуцированного спектра диссоциации пептида, найденного при соотношении массы к заряду 597,29 на спектре MS с электрическим зарядом положительных двух.Из этого спектра была определена соответствующая последовательность. Окончательный результат после анализа представляет собой тепловую карту, представляющую иерархическую кластеризацию всех состояний поляризации с использованием дифференцированно выраженных белков. Анализ показывает кластер белков, чрезмерно выраженных во всех поляризациях в состоянии 3%кислорода.При попытке этой процедуры, важно помнить, что вы должны решить, сначала какой фракции вы будете выполнять на новых образцах, чтобы адаптировать протокол соответствующим образом. Протеомный подход, использующий эту работу, дополняет геномные подходы, которые использовались в последние годы в области исследований поляризации макрофагов биологии. После своего развития, этот метод прокладывает путь для исследователя в области иммунологии, чтобы исследовать различные состояния активации иммунных клеток у людей, а также у других млекопитающих.Не забывайте, что работа с DTT может быть опасной, поэтому вам нужно работать под адаптированным капотом, чтобы сделать эту процедуру.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Разрешающая Affinity Очищенная Белковые комплексы от Синей Native ПААГ и белка корреляции профилирование

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

Диссекции человека сетчатки и ПЭС Хориоидея протеомного анализа

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Сплит BioID — Протеомного анализа контекстно зависимых белковых комплексов в их родной среде сотовой

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

Выборки и предварительной обработки эмали зубов карбонат для стабильной углерода и кислорода изотопный анализ

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Динамический протеомных и Мирна анализ Polysomes от изолированных мыши сердца после Langendorff перфузии

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Калибровка бесплатно в Vitro количественная оценка белка гомо олигомеризации с использованием коммерческих приборов и свободным, открытым исходным кодом программное обеспечение для анализа яркости

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Очищение протеина анаэробных и кинетический анализ через электрод кислорода для изучения DesB Dioxygenase деятельность и ингибирование

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Измерение и интерпретации показателей потребления кислорода в целом летать головы сегментов

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Изучение метаболизма шести системных инсектицидов в недавно созданной культуре подвески клеток, полученных из чая(Камелия Sinensis L.) Листья

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...