Name: proteomic analysis of human macrophage polarization under a low oxygen environment
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment at JoVE.com

AM es financiado por el programa de líder del grupo de jóvenes (ATIP/Avenir Inserm-CNRS), de la Ligue Nationale contre le cáncer y la Fundación arco pour la recherche sur le Cancer. Agradecemos a Mariette Matondo de la espectrometría de masas para plataforma de Biología (UTECHS MSBIO, Instituto Pasteur, París). Agradecemos a Lauren Anderson por su lectura del manuscrito.

Se obtuvieron muestras de sangre humana (LRSC) de donantes sanos, anónima de EFS (servicio nacional de sangre francesa) como parte de un protocolo autorizado (CODECOH CC-2018-3114). Los donantes dieron consentimiento firmado para el uso de sangre.
1. los medios y preparación del tampón
<ol><li>Preparar el medio de macrófagos [RPMI glutamax + 10 mM HEPES 1 x aminoácidos no esenciales (AANE)] y caliente a 37 ° C.</li>
	<li>Preparar el medio de macrófagos + 10% de suero humano de plasma ...

<ol>
	<li>Okabe, Y., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+biology+perspective+on+macrophages.">Tissue biology perspective on macrophages.</a> Nature Immunology. 17 (1), 9-17 (2016).</li><li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+plasticity+and+polarization:+in+vivo+veritas.">Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).</li><li>Murray, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+Polarization.">Macrophage Polarization.</a> Annual Review of Physiology. 79, 541-566 (2017).</li><li>Chinetti-Gbaguidi, G., Staels, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+polarization+in+metabolic+disorders:+functions+and+regulation.">Macrophage polarization in metabolic disorders: functions and regulation.</a> Current Opinion in Lipidology. 22 (5), 365-372 (2011).</li><li>Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+mononuclear+phagocyte+system+in+the+molecular+age.">Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).</li><li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation.">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).</li><li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets.">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).</li><li>Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+multidimensional+concept+of+macrophage+ontogeny,+activation+and+function.">New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function.</a> Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).</li><li>Xue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-based+network+analysis+reveals+a+spectrum+model+of+human+macrophage+activation.">Transcriptome-based network analysis reveals a spectrum model of human macrophage activation.</a> Immunity. 40 (2), 274-288 (2014).</li><li>Csete, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+in+the+cultivation+of+stem+cells.">Oxygen in the cultivation of stem cells.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1049, 1-8 (2005).</li><li>Johansson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional,+morphological,+and+phenotypical+differences+between+rat+alveolar+and+interstitial+macrophages.">Functional, morphological, and phenotypical differences between rat alveolar and interstitial macrophages.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 16 (5), 582-588 (1997).</li><li>Pfau, J. C., Schneider, J. C., Archer, A. J., Sentissi, J., Leyva, F. J., Cramton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+oxygen+tension+affects+phenotype+in+cultured+bone+marrow-derived+macrophages.">Environmental oxygen tension affects phenotype in cultured bone marrow-derived macrophages.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (2), L354-L362 (2004).</li><li>Grodzki, A. C. G., Giulivi, C., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+tension+modulates+differentiation+and+primary+macrophage+functions+in+the+human+monocytic+THP-1+cell+line.">Oxygen tension modulates differentiation and primary macrophage functions in the human monocytic THP-1 cell line.</a> PLoS One. 8 (1), e54926 (2013).</li><li>Court, M., Petre, G., Atifi, M. E., Millet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Signature+Reveals+Modulation+of+Human+Macrophage+Polarization+and+Functions+Under+Differing+Environmental+Oxygen+Conditions.">Proteomic Signature Reveals Modulation of Human Macrophage Polarization and Functions Under Differing Environmental Oxygen Conditions.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 16 (12), 2153-2168 (2017).</li><li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+proteome-wide+label-free+quantification+by+delayed+normalization+and+maximal+peptide+ratio+extraction,+termed+MaxLFQ.">Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).</li><li>Cox, J., Neuhauser, N., Michalski, A., Scheltema, R. A., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Andromeda:+a+peptide+search+engine+integrated+into+the+MaxQuant+environment.">Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment.</a> Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).</li><li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes.">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li><li>Court, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+standardized+urine+proteome+analysis+methodology.">Toward a standardized urine proteome analysis methodology.</a> Proteomics. 11 (6), 1160-1171 (2011).</li><li>Wi&#347;niewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).</li><li>Liebler, D. C., Ham, A. -. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spin+filter-based+sample+preparation+for+shotgun+proteomics.">Spin filter-based sample preparation for shotgun proteomics.</a> Nature Methods. 6 (11), 785-786 (2009).</li><li>Hubner, N. C., Ren, S., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+separation+with+immobilized+pI+strips+is+an+attractive+alternative+to+in-gel+protein+digestion+for+proteome+analysis.">Peptide separation with immobilized pI strips is an attractive alternative to in-gel protein digestion for proteome analysis.</a> Proteomics. 8 (23-24), 4862-4872 (2008).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Informed-Proteomics:+open-source+software+package+for+top-down+proteomics.">Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics.</a> Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).</li><li>Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+oxygen+and+culture+media+on+plating+efficiency+of+some+mammalian+tissue+cells.">Influence of oxygen and culture media on plating efficiency of some mammalian tissue cells.</a> Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).</li><li>Packer, L., Fuehr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+oxygen+concentration+extends+the+lifespan+of+cultured+human+diploid+cells.">Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells.</a> Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).</li><li>Lengner, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+pre-X+inactivation+human+embryonic+stem+cells+under+physiological+oxygen+concentrations.">Derivation of pre-X inactivation human embryonic stem cells under physiological oxygen concentrations.</a> Cell. 141 (5), 872-883 (2010).</li><li>Sidoli, S., Kulej, K., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+proteomics+is+not+the+new+genomics+and+the+future+of+mass+spectrometry+in+cell+biology.">Why proteomics is not the new genomics and the future of mass spectrometry in cell biology.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 21-24 (2017).</li></ol>

Porque la proteómica es una poderosa herramienta para estudiar la expresión de diferentes proteínas de una célula entera o compartimentos subcelulares, optimización del Protocolo de lisis celular y la digestión de las proteínas ha sido abordados por diversos estudios. Hay tres clases principales de métodos, que son en gel de la digestión (digestión de proteínas en geles de poliacrilamida matriz)17, digestión en solución18 y asistido por el filtro muestra prepar...

Los macrófagos son las células inmunes innatas involucrados en una serie de funciones fisiológicas que van desde las respuestas a patógenos infecciosos a la homeostasis del tejido, incluyendo la remoción de células apoptóticas y la remodelación de la matriz extracelular1. Estas células se caracterizan por una fuerte plasticidad fenotípica2 que se traduce en unas muchos Estados posible activación, que también se llaman polarizaciones. La descripción molecular precisa de estas polarizaciones diferentes es una prioridad en el campo de la biología de macrófagos3. Se ha propuesto clasificar estas polarizaciones utilizando la llamada dicotomía M1/M2, M1 representa pro-inflamatoria y M2 representa macrófagos antiinflamatorios. Este modelo se ajusta bien en diferentes situaciones patológicas como infecciones agudas, alergias y obesidad4. Sin embargo, en los tejidos crónicamente inflamados y cáncer, se ha demostrado que esta clasificación es incapaz de captar el amplio repertorio fenotípico que los macrófagos presentan en determinados ambientes celulares5,6, 7. el consenso actual es que polarización macrófago se describe mejor usando un modelo multidimensional para integrar señales microambiental específicas8. Esta conclusión ha sido confirmada mediante análisis transcriptómico de macrófagos humanos que muestra que el modelo M1/M2 es ineficiente en la descripción de las polarizaciones obtuvo9.
El estudio presentado tiene como objetivo ofrecer un protocolo para obtener firmas de Proteómica de diferentes polarizaciones en macrófagos humanos. Describimos cómo diferenciar los macrófagos humanos en entornos de varios niveles de oxígeno y obtener péptidos de proteoma todo macrófagos para llevar a cabo una cuantificación de etiqueta-libre. Esta cuantificación permite la comparación de los niveles de expresión de diversas proteínas. Como investigación en células madre ha puesto de manifiesto la importancia del oxígeno como un parámetro clave ambiental10, buscamos entender cómo este parámetro de tejido puede influir polarización de macrófagos en los seres humanos. La presión parcial de oxígeno se ha encontrado al rango de 3 a 20% (de la presión atmosférica total) en el cuerpo humano, donde el 20% corresponde aproximadamente a lo que comúnmente se utiliza en una incubadora de cultivo celular (el valor exacto es alrededor 18.6% mientras que la presencia de agua en cuenta).
Trabajo previo ha demostrado que difieren alveolar de macrófagos intersticiales de funcional y morfológico punto de vista11 y estas diferencias son probablemente parcialmente debido a los niveles de oxígeno diferentes a los que están expuestos12. Además, macrófagos derivados de médula ósea muestran una mayor capacidad que fagocitan bacterias cuando están expuestos a un bajo nivel de oxígeno medio ambiente12. El efecto contrario se ha encontrado para macrófagos humanos THP1 distinguido13, pero estos resultados apoyan la idea de que el oxígeno es un regulador de la biología del macrófago y que es necesario aclarar esta función a nivel molecular en macrófagos humanos. En un estudio anterior, hemos aplicado un enfoque de la proteómica para tratar estos temas. Al medir los niveles de expresión de miles de proteínas al mismo tiempo, destacó el impacto del oxigeno sobre polarización y proporciona una lista de nuevos marcadores moleculares. También fuimos capaces de relacionar estos resultados para algunas funciones de los macrófagos. En particular, encontramos que la tasa de fagocitosis de células apoptóticas se incrementó en macrófagos IL4/IL13-polarizado, que estuvo vinculado a la regulación al alza de ALOX15 según lo revelado por el análisis proteómico del14. En el presente estudio, describimos cómo realizar tal análisis.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hypoxia Working Station</td>
			<td>Oxford Optronix</td>
			<td>Hypoxylab</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C6 Flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>Accuri C6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5188-6435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (FA)</td>
			<td>ARISTAR</td>
			<td>450122M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-250 Coomassie blue</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1,610,436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide, E.Coli (LPS)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>437627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2D clean-up kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>80-6484-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium, glutamax supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1 M</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) Solution 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harvard Apparatus column Reverse C18 micro spin column</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>74-4601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5 M, pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Bis-Tris 4-12%</td>
			<td>Life Technologies SAS</td>
			<td>NP0321 BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 Microbeads human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS separation column LS</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 4 (IL4)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 13 (IL13)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-112-410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interferon gamma (INF&#947;)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14-FITC (clone T&#220;K4)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-080-701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSmix Tube Rotator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic Acid (TFA)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>28904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/Lys-C Mix</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>V5073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Mini, EDTA-free Protease Inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density Gradient Solution (Histopaque 1077)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10771-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accumax</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7089-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum from human male AB plasma (SAB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4522-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) solution 30%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9576-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisma-base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>49767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>114405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 20%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>57670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiourea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C9426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL sterile plastic pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer C Eppendorf</td>
			<td>VWR</td>
			<td>460-0223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak tC18 reverse phase cartridges, 100 mg</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT036820</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proteomic analysis of human macrophage polarization under a low oxygen environment

Los macrófagos son las células inmunes innatas involucrados en una serie de funciones fisiológicas que van desde las respuestas a patógenos infecciosos a la homeostasis del tejido. Las diferentes funciones de estas células están relacionadas con sus Estados de activación, que también se llama polarización. La descripción molecular precisa de estas polarizaciones diferentes es una prioridad en el campo de la biología del macrófago. Actualmente se reconoce que un enfoque multidimensional es necesario describir cómo la polarización es controlada por señales ambientales. En este informe, describimos un protocolo diseñado para obtener la firma proteómica de diferentes polarizaciones en macrófagos humanos. Este protocolo se basa en una cuantificación de etiqueta-libre de expresión de la proteína del macrófago obtenida de in-gel fraccionado y Lys C/tripsina-digerido contenido de lisis celular. También proporcionamos un protocolo basado en la solución en digestión y fraccionamiento para usar como una alternativa de enfoque isoeléctrico. Debido a la concentración de oxígeno es un parámetro ambiental relevante en los tejidos, utilizamos este protocolo para explorar la composición de la atmósfera o un ambiente de poco oxígeno afecta a la clasificación de la polarización del macrófago.

A partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) obtenidas por centrifugación diferencial, el protocolo permite la obtención de una población de CD14+ monocitos con una pureza cuota de más del 98% mediante citometría de flujo (figura 1). Estos monocitos se diferencian secundariamente hacia polarizaciones diferentes (figura 2). Cuando se elige un fraccionamiento en gel, la migración en geles de SDS...

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Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Presentamos un protocolo para obtener firmas de Proteómica de macrófagos humanos y aplicar esto a la determinación del impacto de un ambiente de poco oxígeno en polarización de macrófagos.

Análisis proteómico de polarización macrófago humano bajo un ambiente de poco oxígeno

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Por lo tanto, este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología de macrófagos, como cómo caracterizar el estado de activación bajo diversos ambientes a nivel proteico. La principal ventaja de esta técnica es que ofrece la oportunidad de obtener la diferencia de expresión de muchas proteínas en macrófagos humanos utilizando el método de cuantificación sin etiquetas. Demostrar el procedimiento serán Marie Malier y Magali Court de mi laboratorio.Para comenzar, añada 15 mililitros de solución de separación de células de gradiente de densidad en cada uno de dos tubos de centrifugación de 50 mililitros para que la solución pueda calentarse a temperatura ambiente antes de recibir el LRSC. Esto es esencial ya que la densidad depende de la temperatura. Vacíe el LRSC en un tubo de centrifugación de 50 mililitros.Añadir 1x PBS hasta 50 mililitros y mezclar. A continuación, muy lentamente, añadir 25 mililitros de la mezcla en la parte superior de 15 mililitros de solución de gradiente de densidad equilibrada. Tenga cuidado de no mezclar las fases durante este paso.Se debe añadir sangre en la solución de gradiente de densidad sin ninguna alteración de esta fase. Centrifugar ambos tubos de centrifugación durante 25 minutos a 700 G sin roturas. Al final de la centrifugación de gradiente de densidad, las capas de abajo a arriba son los eritrocitos y granulocitos, formando el pellet, la fase de solución de gradiente de densidad, una capa de PBMC y el plasma diluido.Con una pipeta, pasar a través de la fase de plasma sin aspirarlo. A continuación, recoja la capa PBMC en un nuevo tubo de centrifugación de 50 mililitros. Añadir hasta 50 mililitros de 1x PBS a los PBMC como una configuración de lavado y centrífuga durante 10 minutos a 300 G.Aspirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en 40 mililitros de medios de macrófagos.Después de hacer seda los PBMC en una cámara De Malassez, transfiera la cantidad de PBMC necesaria para llevar a cabo el experimento a un tubo de centrifugación. Centrifugar las células durante 10 minutos a 300 G.Aspirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en 80 microlitros del búfer de clasificación por cada 10 millones de PBMC. A continuación, agregue 20 microlitros de microperlas CD14 por cada 10 millones de PBMC.Mezclar bien e incubar durante 15 minutos a 4 grados centígrados bajo agitación constante. Después de la incubación, agregue un mililitro de tampón de clasificación por cada 10 millones de PBMC como paso de lavado, y centrifugar como antes. A continuación, aspirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en 500 microlitros de tampón de clasificación por cada 100 millones de PBMC.Ahora, coloque una columna en el campo magnético del separador. Prepare la columna enjuagando con tres mililitros de búfer de clasificación. Aplique la suspensión de celda en la columna.A continuación, recoja el flujo a través de las celdas sin etiquetar para su posterior tinción, si es necesario. Lave la columna tres veces con tres mililitros de búfer de clasificación. Tenga cuidado de no secar la columna.A continuación, coloque un tubo de recogida debajo de la columna y retírelo del separador. Después del lavado, pipetee cinco mililitros de tampón de clasificación en la columna. Enjuague inmediatamente las células etiquetadas magnéticamente empujando firmemente el émbolo hacia la columna.Por último, repita estos pasos con una nueva columna antes de encolar los monocitos y realizar la polarización de macrófagos como se describe en el protocolo de texto. Mantener los monocitos y los macrófagos en un ambiente controlado por oxígeno para realizar análisis de condición hipoxica. Utilice una estación de trabajo de hipoxia para mantener las células bajo la presión parcial de oxígeno deseada durante el experimento.Cuando se trabaja bajo baja presión de oxígeno, es importante preparar todos los medios y tampones de lavado debajo de la estación, y esperar lo suficiente para obtener la presión parcial correcta en el líquido. Realice la lysis celular en un búfer bajo una capucha adaptada. Cargue el equivalente proteico de 300.000 células por cada muestra en geles de acrilamida 4-12%bis-tris.Controlar la duración de la migración electroforética para permitir que cada muestra de proteína se divida en seis bandas de gel como se muestra aquí. Después de la fijación y tinción como se describe en el protocolo de texto, excúles las bandas de proteínas con un bisturí limpio. En dados cada banda extirpada antes de colocarlos en tubos de 500 microlitros.Ahora, lave las rodajas de gel tres veces en 200 microlitros de bicarbonato de amonio milimolar durante 20 minutos a 37 grados centígrados, descartando el bicarbonato de amonio entre cada paso. Siga esto con un lavado en bicarbonato de amonio de 25 milimolares y acetonitrilo. A continuación, deshidratar las piezas de gel con 200 microlitros de 100% acetonitrilo durante 10 minutos.Incubar cada pieza de gel con 10 TDT milimétrica y bicarbonato de amonio mili evolucionador durante 45 minutos a 56 grados centígrados. A continuación, deseche la TDT e incubar la pieza de gel con 55 yodoaceta milimétricas en bicarbonato de amonio de 25 milimolar durante 35 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. Para detener la alquilación, deseche la solución usada e incubar cada pieza de gel con 200 microlitros de TDT de 10 mililitrolares en bicarbonato de amonio milimolar durante 10 minutos a temperatura ambiente.Lavar las piezas de gel en 200 microlitros de bicarbonato de amonio de 25 milimolares. A continuación, deshidratar con 200 microlitros de 100% acetonitrilo durante 10 minutos. Digerir las proteínas durante la noche a 37 grados Celsius con Trypsin/Lys-C Mix de acuerdo con las instrucciones del fabricante.Extrae los péptidos resultantes de las piezas de gel añadiendo 50 microlitros de 50%acetonitrilo durante 15 minutos en tubos de baja absorción. Después de añadir 50 microlitros de 5% de ácido fórmico durante 15 minutos, añadir 50 microlitros de 100%acetonitrilo durante 15 minutos. Tire y seque cada fracción en tubos de baja absorción para limitar la absorción de péptidos y la pérdida de la muestra.Almacene las muestras a 80 grados centígrados hasta que se sigan analizando como se detalla en el protocolo de texto. Aquí se muestra la pureza representativa evaluada por la citometría de flujo después de la selección de cuentas magnéticas de monocitos positivos CD14. Las imágenes de contraste de fase de macrófagos humanos diferenciados muestran heterogeneidad de morfologías obtenidas para dos polarizaciones diferentes después de nueve días de cultivo.Se muestra un ejemplo de una digestión fuera de gel utilizando geles de página SDS manchados de plata. La evaluación de la proteína de la lelisis celular y después de la digestión en la solución muestra la ausencia de degradación durante la lelisis y la eficiencia de la digestión. Aquí se muestra un ejemplo de un espectro de disociación inducido por colisión de un péptido encontrado en la relación masa-carga de 597.29 en el espectro de la MS con una carga eléctrica de dos positivos.A partir de este espectro, se determinó la secuencia correspondiente. El resultado final después del análisis es un mapa de calor que representa la agrupación jerárquica de todos los estados de polarización utilizando proteínas expresadas diferencialmente. El análisis revela un grupo de proteínas sobre-expresadas en todas las polarizaciones en la condición de oxígeno del 3%.Al intentar este procedimiento, es importante recordar que primero tienes que decidir qué tipo de fraccionamiento realizarás en nuevas muestras para adaptar tu protocolo en consecuencia. El enfoque proteómico que utiliza este trabajo es complementario a los enfoques genómicos que se han utilizado durante los últimos años en el campo de los estudios de polarización de la biología de macrófagos. Después de su desarrollo, esta técnica allana el camino para que el investigador en el campo de la inmunología explore los diversos estados de activación de las células inmunitarias en los seres humanos y también en otros mamíferos.No olvide que trabajar con TDT podría ser peligroso, por lo que necesita trabajar bajo una capucha adaptada para realizar este procedimiento.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Resolver purificado por afinidad Complejos de Proteína de Blue nativo PAGE y de proteínas de perfiles de correlación

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Investigación

Bioquímica

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

Disección de la Retina humana y RPE-coroides para análisis proteómico

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID: Análisis proteómico de complejos de proteínas específicos de contexto en su entorno celular nativo

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

Muestreo y tratamiento previo del esmalte de los dientes carbonato de carbono estable e isótopos de oxígeno

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Proteómicos y miRNA análisis de polisomas de corazón de ratón aislados después de Langendorff la perfusión

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibración-libre In Vitro cuantificación de proteína Homo-Oligomerización utilizando instrumentación comercial y Software de análisis de brillo libre de código abierto

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Purificación de proteínas anaerobias y análisis cinético mediante electrodo de oxígeno para el estudio de la inhibición y la actividad de DesB dioxigenasa

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Medición e interpretación de las tasas de consumo de oxígeno en su totalidad operan segmentos de cabeza

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Estudio sobre el metabolismo de seis insecticidas sistémicos en un cultivo de suspensión celular recién establecido derivado del té (Camellia Sinensis L.) Hojas

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...