Name: proteomic analysis of human macrophage polarization under a low oxygen environment
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment at JoVE.com

AM finansieras av programmet ung grupp ledare (ATIP/Avenir Inserm-CNRS), av la Ligue Nationale contre le Cancer och la Fondation ARC pour la recherche sur le Cancer. Vi tackar Mariette Matondo från den Mass Spectrometry för biologi plattform (UTECHS MSBIO, Pasteurinstitutet, Paris). Vi tackar Lauren Anderson för hennes läsning av manuskriptet.

Humant blodprover (LRSC) från friska, avidentifierad givare erhölls från EFS (franska National Blood Service) som en del av en auktoriserad protokoll (CODECOH DC-2018 – 3114). Givare gav undertecknat samtycke för användning av blod.
1. Media och buffert förberedelse
<ol><li>Förbereda makrofag medium [RPMI glutamax + 10 mM HEPES + 1 x icke-essentiella aminosyror (NEAA)] och Värm till 37 ° C.</li>
	<li>Förbereda den makrofag medium + 10% humant serum från AB plasma (SAB), filtrera...

<ol>
	<li>Okabe, Y., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+biology+perspective+on+macrophages.">Tissue biology perspective on macrophages.</a> Nature Immunology. 17 (1), 9-17 (2016).</li><li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+plasticity+and+polarization:+in+vivo+veritas.">Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).</li><li>Murray, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+Polarization.">Macrophage Polarization.</a> Annual Review of Physiology. 79, 541-566 (2017).</li><li>Chinetti-Gbaguidi, G., Staels, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+polarization+in+metabolic+disorders:+functions+and+regulation.">Macrophage polarization in metabolic disorders: functions and regulation.</a> Current Opinion in Lipidology. 22 (5), 365-372 (2011).</li><li>Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+mononuclear+phagocyte+system+in+the+molecular+age.">Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).</li><li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation.">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).</li><li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets.">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).</li><li>Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+multidimensional+concept+of+macrophage+ontogeny,+activation+and+function.">New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function.</a> Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).</li><li>Xue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-based+network+analysis+reveals+a+spectrum+model+of+human+macrophage+activation.">Transcriptome-based network analysis reveals a spectrum model of human macrophage activation.</a> Immunity. 40 (2), 274-288 (2014).</li><li>Csete, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+in+the+cultivation+of+stem+cells.">Oxygen in the cultivation of stem cells.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1049, 1-8 (2005).</li><li>Johansson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional,+morphological,+and+phenotypical+differences+between+rat+alveolar+and+interstitial+macrophages.">Functional, morphological, and phenotypical differences between rat alveolar and interstitial macrophages.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 16 (5), 582-588 (1997).</li><li>Pfau, J. C., Schneider, J. C., Archer, A. J., Sentissi, J., Leyva, F. J., Cramton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+oxygen+tension+affects+phenotype+in+cultured+bone+marrow-derived+macrophages.">Environmental oxygen tension affects phenotype in cultured bone marrow-derived macrophages.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (2), L354-L362 (2004).</li><li>Grodzki, A. C. G., Giulivi, C., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+tension+modulates+differentiation+and+primary+macrophage+functions+in+the+human+monocytic+THP-1+cell+line.">Oxygen tension modulates differentiation and primary macrophage functions in the human monocytic THP-1 cell line.</a> PLoS One. 8 (1), e54926 (2013).</li><li>Court, M., Petre, G., Atifi, M. E., Millet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Signature+Reveals+Modulation+of+Human+Macrophage+Polarization+and+Functions+Under+Differing+Environmental+Oxygen+Conditions.">Proteomic Signature Reveals Modulation of Human Macrophage Polarization and Functions Under Differing Environmental Oxygen Conditions.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 16 (12), 2153-2168 (2017).</li><li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+proteome-wide+label-free+quantification+by+delayed+normalization+and+maximal+peptide+ratio+extraction,+termed+MaxLFQ.">Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).</li><li>Cox, J., Neuhauser, N., Michalski, A., Scheltema, R. A., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Andromeda:+a+peptide+search+engine+integrated+into+the+MaxQuant+environment.">Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment.</a> Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).</li><li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes.">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li><li>Court, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+standardized+urine+proteome+analysis+methodology.">Toward a standardized urine proteome analysis methodology.</a> Proteomics. 11 (6), 1160-1171 (2011).</li><li>Wi&#347;niewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).</li><li>Liebler, D. C., Ham, A. -. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spin+filter-based+sample+preparation+for+shotgun+proteomics.">Spin filter-based sample preparation for shotgun proteomics.</a> Nature Methods. 6 (11), 785-786 (2009).</li><li>Hubner, N. C., Ren, S., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+separation+with+immobilized+pI+strips+is+an+attractive+alternative+to+in-gel+protein+digestion+for+proteome+analysis.">Peptide separation with immobilized pI strips is an attractive alternative to in-gel protein digestion for proteome analysis.</a> Proteomics. 8 (23-24), 4862-4872 (2008).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Informed-Proteomics:+open-source+software+package+for+top-down+proteomics.">Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics.</a> Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).</li><li>Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+oxygen+and+culture+media+on+plating+efficiency+of+some+mammalian+tissue+cells.">Influence of oxygen and culture media on plating efficiency of some mammalian tissue cells.</a> Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).</li><li>Packer, L., Fuehr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+oxygen+concentration+extends+the+lifespan+of+cultured+human+diploid+cells.">Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells.</a> Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).</li><li>Lengner, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+pre-X+inactivation+human+embryonic+stem+cells+under+physiological+oxygen+concentrations.">Derivation of pre-X inactivation human embryonic stem cells under physiological oxygen concentrations.</a> Cell. 141 (5), 872-883 (2010).</li><li>Sidoli, S., Kulej, K., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+proteomics+is+not+the+new+genomics+and+the+future+of+mass+spectrometry+in+cell+biology.">Why proteomics is not the new genomics and the future of mass spectrometry in cell biology.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 21-24 (2017).</li></ol>

Eftersom proteomik är ett kraftfullt verktyg att studera uttrycket av olika proteiner från en hel cell eller subcellulär fack, har optimering av protokollet cell lysis och nedbrytning av proteiner tagits upp av ett antal studier. Det finns tre klasser av metoder, bland annat i-gel matsmältningen (matsmältningen av proteiner i polyakrylamid gelmatrisen)17, matsmältningen i lösning18 och filter-aided prov förberedelse19. Denna sista metod, för...

Makrofager är innate immuna celler involverade i ett antal fysiologiska funktioner alltifrån Svaren till smittsamma patogener till vävnad homeostas, inklusive borttagning av apoptotiska celler och ombyggnationer av extracellulär matrix1. Dessa celler kännetecknas av en stark fenotypisk plasticitet2 som översätter till en många möjliga aktiveringen stater, som också kallas polarisationer. Den exakta molekylära beskrivningen av dessa olika polarizations är en prioritering i fältet av makrofag biologi3. Det har föreslagits att klassificera dessa polarizations som använder så kallade M1/M2 dikotomin, där M1 representerar proinflammatoriska och M2 representerar antiinflammatoriska makrofager. Denna modell passar bra i olika patologiska situationer som akuta infektioner, allergi och fetma4. Dock i kroniskt inflammerade vävnader och cancer, har det visats att denna klassificering är oförmögna att förstå den bred fenotypiska repertoar som makrofager presenterar i vissa cellulära miljöer5,6, 7. den nuvarande uppfattningen är att makrofag polarisering bättre beskrivs med en flerdimensionell modell för att integrera specifika microenvironmental signaler8. Denna slutsats har bekräftats genom transcriptomic analys av mänskliga makrofager visar att modellen M1/M2 är ineffektiva i att beskriva den erhållna polarizations9.
Studien presenteras syftar till att ge ett protokoll för att hämta proteomiska signaturer av olika polarizations i mänskliga makrofager. Vi beskriver hur att skilja mänskliga makrofager i miljöer av olika syrenivåer och erhålla peptider från det hela makrofag proteomet att utföra en etikett-fri kvantifiering. Denna kvantifiering tillåter jämförelse av uttrycksnivåerna för olika proteiner. Som forskning på stamceller har visat betydelsen av syre som en miljö viktig parameter10, försöker vi förstå hur denna vävnad parameter kan påverka makrofag polarisering i människor. Partialtrycket för syre har hittats till utbud från 3 till 20% (av totalt atmosfärstryck) i den mänskliga kroppen, där 20% motsvarar ungefär vad används ofta i en cell kultur inkubator (det exakta värdet är cirka 18,6% samtidigt som förekomsten av vatten i beräkningen).
Tidigare arbete har visat att alveolära skiljer sig från interstitiell makrofager från funktionella och morfologisk synpunkt visningar11 och att dessa skillnader är förmodligen delvis på grund av olika syrehalten som de är exponerade12. Benmärg-derived makrofager visar dessutom en ökad förmåga att fagocytera bakterier när de utsätts för en låg syrehalt miljö12. Motsatt effekt har hittats för THP1-differentierade mänskliga makrofager13, men dessa resultat stöder idén att syre är en regulator av makrofag biologi och att det är nödvändigt att klargöra denna roll på molekylär nivå i mänskliga makrofager. I en tidigare studie, har vi tillämpat en proteomik strategi för att hantera dessa frågor. Genom att mäta uttrycksnivåerna för tusentals proteiner samtidigt, vi belyst effekten av syre på polarisering och en lista över nya molekylära markörer. Vi var också kunna relatera dessa fynd till vissa makrofager funktioner. Vi hittade noterbart att graden av fagocytos av apoptotiska celler höjdes i IL4/IL13-polariserade makrofager, som var kopplad till uppreglering av ALOX15 som framkommit vid proteomiska analys14. I föreliggande studie beskriver vi hur du utför en sådan analys.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hypoxia Working Station</td>
			<td>Oxford Optronix</td>
			<td>Hypoxylab</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C6 Flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>Accuri C6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5188-6435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (FA)</td>
			<td>ARISTAR</td>
			<td>450122M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-250 Coomassie blue</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1,610,436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide, E.Coli (LPS)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>437627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2D clean-up kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>80-6484-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium, glutamax supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1 M</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) Solution 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harvard Apparatus column Reverse C18 micro spin column</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>74-4601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5 M, pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Bis-Tris 4-12%</td>
			<td>Life Technologies SAS</td>
			<td>NP0321 BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 Microbeads human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS separation column LS</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 4 (IL4)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 13 (IL13)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-112-410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interferon gamma (INF&#947;)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14-FITC (clone T&#220;K4)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-080-701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSmix Tube Rotator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic Acid (TFA)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>28904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/Lys-C Mix</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>V5073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Mini, EDTA-free Protease Inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density Gradient Solution (Histopaque 1077)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10771-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accumax</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7089-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum from human male AB plasma (SAB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4522-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) solution 30%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9576-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisma-base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>49767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>114405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 20%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>57670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiourea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C9426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL sterile plastic pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer C Eppendorf</td>
			<td>VWR</td>
			<td>460-0223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak tC18 reverse phase cartridges, 100 mg</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT036820</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proteomic analysis of human macrophage polarization under a low oxygen environment

Makrofager är innate immuna celler involverade i ett antal fysiologiska funktioner alltifrån Svaren till smittsamma patogener till vävnad homeostas. De olika funktionerna i dessa celler är relaterade till deras aktivering stater, som också kallas polarisering. Den exakta molekylära beskrivningen av dessa olika polarizations är en prioritering i fältet av makrofag biologi. Det erkänns för närvarande att en flerdimensionell strategi är nödvändigt att beskriva hur polarisering styrs av Miljösignaler. I den här rapporten beskriver vi ett protokoll som syftar till att erhålla proteomiska undertecknandet av olika polarizations i mänskliga makrofager. Detta protokoll baseras på en etikett-fri kvantifiering av makrofag proteinuttryck framställs i-gel fractionated och Lys C/trypsin-rötas Lys innehåll. Vi ger också ett protokoll baserat på i-lösning matsmältningen och isoelektrisk fokusering fraktionering att använda som ett alternativ. Eftersom syrehalten är en relevanta miljömässiga parameter i vävnader, vi använder detta protokoll för att utforska hur atmosfärens sammansättning eller en låg syrehalt miljö påverkar klassificeringen av makrofag polarisering.

Start från perifera mononukleära blodceller (PBMC) erhålls genom differential centrifugering, protokollet medger erhållande av en befolkning på CD14+ monocyter med en bedömd renhetsgrad av mer än 98% av flödescytometri (figur 1). Dessa monocyter särskiljs sekundärt mot olika polarizations (figur 2). När en fraktionering på gel är valt, migreringen på SDS-page geler är anpassad att erhålla antalet önska...

Watch this Scientific Journal Video about Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment at JoVE.com

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Vi presenterar ett protokoll för att hämta proteomiska signaturer av mänskliga makrofager och tillämpa detta att fastställandet av verkningarna av en låg syrehalt miljö på makrofag polarisering.

Proteomiska analys av mänskliga makrofag polarisering Under en låg syrehalt miljö

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Så denna metod kan bidra till att besvara viktiga frågor i makrofag biologi området, till exempel hur man karakterisera tillståndet för aktivering under olika miljö på proteinnivå. Den största fördelen med denna teknik är att den ger möjlighet att få olika uttryck för många proteiner i humana makrofager med hjälp av etikettfri kvantifieringsmetod. Demonstrerar förfarandet kommer att Marie Malier och Magali domstolen från mitt laboratorium.Till att börja med, tillsätt 15 milliliter densitet gradient cell separationslösning i var och en av två 50 milliliter centrifugerrör så att lösningen kan värma till rumstemperatur innan du tar emot LRSC. Detta är viktigt eftersom densiteten beror på temperaturen. Töm LRSC i ett centrifugerrör på 50 milliliter.Tillsätt 1x PBS upp till 50 milliliter och blanda. Sedan, mycket långsamt, tillsätt 25 milliliter av blandningen ovanpå 15 milliliter av ekvilokanterad densitetsgradientlösning. Var försiktig så att faserna inte blandas under detta steg.Blodet måste tillsättas på densitetsgradientlösningen utan någon störning av denna fas. Centrifugera båda centrifugeringsrören i 25 minuter vid 700 G utan raster. I slutet av densitetsgradientcentrifugeringen är lagren från botten till toppen erytrocyterna och granulocyterna, som bildar pelleten, densitetsgradientlösningsfasen, ett lager PBMC och den utspädda plasman.Med en pipett, passera genom plasmafasen utan att aspirera den. Samla sedan pbmc-lagret i ett nytt centrifugerrör på 50 milliliter. Lägg till upp till 50 milliliter av 1x PBS till PBMCs som en tvättinställning och centrifug i 10 minuter vid 300 G.Aspirate supernatanten och åter upphäva pelleten i 40 milliliter makrofagmedium.Efter couching PBMCs i en Malassez kammare, överföra mängden PBMCs som krävs för att genomföra experimentet till en centrifugering röret. Centrifugera cellerna i 10 minuter vid 300 G.Aspirate supernatanten och åter upphäva pelleten i 80 mikroliter av sorteringsbufferten per 10 miljoner PBMCs. Lägg sedan till 20 mikroliter av CD14 mikropärlor per 10 miljoner PBMCs.Blanda väl, och inkubera i 15 minuter vid 4 grader Celsius under ständig agitation. Efter inkubation, tillsätt en milliliter sortering buffert per 10 miljoner PBMCs som en tvätt steg, och centrifug som tidigare. Sedan aspirera supernatanten och åter upphäva pelleten i 500 mikroliter sorteringsbuffert per 100 miljoner PBMCs.Nu, placera en kolumn i magnetfältet av separatorn. Förbered kolonnen genom att skölja den med tre milliliter sorteringsbuffert. Applicera cellupphängningen på kolonnen.Samla sedan flödet genom innehållande omärkta celler för efterföljande färgning, om det behövs. Tvätta kolonnen tre gånger med tre milliliter sorteringsbuffert. Var försiktig så att du inte torkar din kolumn.Placera sedan ett uppsamlingsrör under kolonnen och ta bort det från avskiljaren. Efter tvätten, pipetten fem milliliter sortering buffert i kolumnen. Spola omedelbart ut de magnetiskt märkta cellerna genom att trycka in kolven ordentligt i kolonnen.Slutligen upprepa dessa steg med en ny kolumn innan plätera monocyterna och utför makrofagpolariseringen enligt beskrivningen i textprotokollet. Underhåll monocyterna och makrofagerna i en syrekontrollerad miljö för att utföra hypoxisk tillståndsanalys. Använd en hypoxiarbetsstation för att bibehålla celler under önskat syre partialtryck under försöket.Vid arbete under lågt syretryck är det viktigt att förbereda alla media och tvättbuffertar under stationen, och vänta tillräckligt för att få rätt deltryck i vätskan. Utför celllys i en buffert under en anpassad huv. Ladda proteinekvivalenten på 300, 000 celler för varje prov på 4-12%bis-tris akrylamidgeler.Kontrollera varaktigheten av den elektroforetiska migrationen så att varje proteinprov kan delas upp i sex gelband enligt bilden här. Efter fastställande och färgning som beskrivs i textprotokollet, punktskatt proteinet band med en ren skalpell. Tärna varje struket band innan de placeras i 500 mikroliterrör.Nu, tvätta gelskivorna tre gånger i 200 mikroliter på 25 millimolar ammoniumbikarbonat i 20 minuter vid 37 grader Celsius, kasta ammoniumbikarbonat mellan varje steg. Följ detta med en tvätt i 25 millimolar ammoniumbikarbonat och acetonitril. Torka sedan ut gelbitarna med 200 mikroliter på 100%acetonitril i 10 minuter.Inkubera varje gelbit med 10 millimolar DTT och 25 millimolar ammoniumbikarbonat i 45 minuter vid 56 grader Celsius. Därefter, kassera DTT och inkubera gelbiten med 55 millimolar iodoacetamid i 25 millimolar ammoniumbikarbonat i 35 minuter i mörkret vid rumstemperatur. För att stoppa alkyleringen, kassera den använda lösningen och inkubera varje gelstycke med 200 mikroliter på 10 millimolar DTT i 25 millimolar ammoniumbikarbonat i 10 minuter vid rumstemperatur.Tvätta gelbitarna i 200 mikroliter på 25 millimolar ammoniumbikarbonat. Torka sedan med 200 mikroliter på 100%acetonitril i 10 minuter. Smält proteinerna över natten vid 37 grader Celsius med Trypsin/Lys-C Mix enligt tillverkarens anvisningar.Extrahera de resulterande peptiderna från gelbitar genom att tillsätta 50 mikroliter av 50%acetonitrile i 15 minuter i låg-absorptionsrör. Efter att ha lagt till 50 mikroliter av 5%myrsyra i 15 minuter, tillsätt 50 mikroliter av 100%acetonitril i 15 minuter. Dra och torka varje fraktion i låg absorptionsrör för att begränsa absorptionen av peptider och provförlust.Förvara proverna vid 80 grader Celsius tills ytterligare analys som beskrivs i textprotokollet. Visas här är den representativa renhet bedömas av flödescytometri efter magnetisk pärla val av CD14 positiva monocyter. Fas kontrast imaging av differentierade mänskliga makrofager visar heterogenitet erhållna morphologies för två olika polarisationer efter nio dagar av kultur.Ett exempel på en off-gel matsmältning med silver-färgade SDS sida geler visas. Utvärdering av protein från celllys och efter i-lösningsuppsytning visar frånvaron av nedbrytning under lys och effektiviteten i matsmältningen. Visas här är ett exempel på en kollision-inducerad dissociation spektrum av en peptid som finns på massa-till-laddning förhållandet 597,29 på MS-spektrumet med en elektrisk laddning av positiva två.Från detta spektrum fastställdes motsvarande sekvens. Slutresultatet efter analys är en värmekarta som representerar den hierarkiska klustring av alla polariseringsstater med hjälp av differentially-uttryckta proteiner. Analys visar ett kluster av proteiner över-uttryckt i alla polarisationer i 3% syre tillstånd.Samtidigt försöker denna procedur, Det är viktigt att komma ihåg att du måste bestämma först vilken typ av fraktionering du kommer att utföra på nya prover för att anpassa ditt protokoll därefter. Det proteomiska tillvägagångssättet med hjälp av detta arbete är komplement till genomiska tillvägagångssätt som har använts under de senaste åren inom området för makrofag biologi polarisationsstudier. Efter dess utveckling banar denna teknik vägen för forskare inom immunologiområdet att utforska de olika tillstånden för aktivering av immunceller hos människor och även hos andra däggdjur.Glöm inte att arbeta med DTT kan vara farligt så du måste arbeta under en anpassad huva för att göra detta förfarande.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Lösa affinitetsrenat proteinkomplex av Blue Native PAGE och protein Korrelation profilering

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

Dissektion av mänskliga näthinnan och RPE-åderhinnan för proteomiska analys

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID — Proteomiska analys av sammanhangsberoende proteinkomplex i deras infödda cellulära miljön

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

Provtagning och förbehandling av tandemaljen karbonat för stabil kol och syre isotoper analys

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Dynamisk proteomiska och miRNA analyser av Polysomes från isolerade mus hjärtat efter av Perfusion

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrering-gratis In Vitro kvantifiering av Protein Homo-oligomerisering använder kommersiella instrumentering och fri, öppen källkod ljusstyrka analys programvara

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Anaerob Protein rening och kinetiska analys via syre elektrod för att studera DesB dioxygenas aktivitet och hämning

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Mäta och tolka syre förbrukning helt flyga Head segment

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Studie om metabolismen av sex systemiska insekticider i en nyetablerad cell SUS pension kultur härledd från Tea (Camellia sinensis L.) Lämnar

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...