Name: proteomic analysis of human macrophage polarization under a low oxygen environment
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment at JoVE.com

AM genç grup lideri programıyla (CD'ye atıp/Avenir INSERM-CNRS), la Ligue Nationale contre le kanser ve la Fondation ARC pour la recherche sur le kanser tarafından finanse edilmektedir. Kütle spektrometresi biyoloji platformu (UTECHS MSBIO, Pasteur Enstitüsü, Paris) için gelen Mariette Matondo teşekkür ediyoruz. Lauren Anderson el yazması onun okuma için teşekkür ederiz.

İnsan kanı örnekleri (LRSC) sağlıklı, de-tanımlanan bağışçılardan EFS (Fransız Ulusal kan servisi) protokolünün bir parçası olarak bir yetkili (CODECOH DC-2018-3114) elde edilmiştir. Bağış kan kullanım için imzalanmış izin verdi.
1. kitle iletişim araçları ve arabellek hazırlık
<ol><li>Makrofaj orta [RPMI glutamax + 10 mM HEPES + 1 x esansiyel olmayan amino asitler (NEAA)] hazırlamak ve 37 ° c sıcak</li>
	<li>Hazırlamak makrofaj orta + AB plazma (SAB) üzeri...

<ol>
	<li>Okabe, Y., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+biology+perspective+on+macrophages.">Tissue biology perspective on macrophages.</a> Nature Immunology. 17 (1), 9-17 (2016).</li><li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+plasticity+and+polarization:+in+vivo+veritas.">Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).</li><li>Murray, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+Polarization.">Macrophage Polarization.</a> Annual Review of Physiology. 79, 541-566 (2017).</li><li>Chinetti-Gbaguidi, G., Staels, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+polarization+in+metabolic+disorders:+functions+and+regulation.">Macrophage polarization in metabolic disorders: functions and regulation.</a> Current Opinion in Lipidology. 22 (5), 365-372 (2011).</li><li>Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+mononuclear+phagocyte+system+in+the+molecular+age.">Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).</li><li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation.">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).</li><li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets.">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).</li><li>Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+multidimensional+concept+of+macrophage+ontogeny,+activation+and+function.">New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function.</a> Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).</li><li>Xue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-based+network+analysis+reveals+a+spectrum+model+of+human+macrophage+activation.">Transcriptome-based network analysis reveals a spectrum model of human macrophage activation.</a> Immunity. 40 (2), 274-288 (2014).</li><li>Csete, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+in+the+cultivation+of+stem+cells.">Oxygen in the cultivation of stem cells.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1049, 1-8 (2005).</li><li>Johansson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional,+morphological,+and+phenotypical+differences+between+rat+alveolar+and+interstitial+macrophages.">Functional, morphological, and phenotypical differences between rat alveolar and interstitial macrophages.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 16 (5), 582-588 (1997).</li><li>Pfau, J. C., Schneider, J. C., Archer, A. J., Sentissi, J., Leyva, F. J., Cramton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+oxygen+tension+affects+phenotype+in+cultured+bone+marrow-derived+macrophages.">Environmental oxygen tension affects phenotype in cultured bone marrow-derived macrophages.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (2), L354-L362 (2004).</li><li>Grodzki, A. C. G., Giulivi, C., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+tension+modulates+differentiation+and+primary+macrophage+functions+in+the+human+monocytic+THP-1+cell+line.">Oxygen tension modulates differentiation and primary macrophage functions in the human monocytic THP-1 cell line.</a> PLoS One. 8 (1), e54926 (2013).</li><li>Court, M., Petre, G., Atifi, M. E., Millet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Signature+Reveals+Modulation+of+Human+Macrophage+Polarization+and+Functions+Under+Differing+Environmental+Oxygen+Conditions.">Proteomic Signature Reveals Modulation of Human Macrophage Polarization and Functions Under Differing Environmental Oxygen Conditions.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 16 (12), 2153-2168 (2017).</li><li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+proteome-wide+label-free+quantification+by+delayed+normalization+and+maximal+peptide+ratio+extraction,+termed+MaxLFQ.">Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).</li><li>Cox, J., Neuhauser, N., Michalski, A., Scheltema, R. A., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Andromeda:+a+peptide+search+engine+integrated+into+the+MaxQuant+environment.">Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment.</a> Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).</li><li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes.">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li><li>Court, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+standardized+urine+proteome+analysis+methodology.">Toward a standardized urine proteome analysis methodology.</a> Proteomics. 11 (6), 1160-1171 (2011).</li><li>Wi&#347;niewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).</li><li>Liebler, D. C., Ham, A. -. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spin+filter-based+sample+preparation+for+shotgun+proteomics.">Spin filter-based sample preparation for shotgun proteomics.</a> Nature Methods. 6 (11), 785-786 (2009).</li><li>Hubner, N. C., Ren, S., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+separation+with+immobilized+pI+strips+is+an+attractive+alternative+to+in-gel+protein+digestion+for+proteome+analysis.">Peptide separation with immobilized pI strips is an attractive alternative to in-gel protein digestion for proteome analysis.</a> Proteomics. 8 (23-24), 4862-4872 (2008).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Informed-Proteomics:+open-source+software+package+for+top-down+proteomics.">Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics.</a> Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).</li><li>Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+oxygen+and+culture+media+on+plating+efficiency+of+some+mammalian+tissue+cells.">Influence of oxygen and culture media on plating efficiency of some mammalian tissue cells.</a> Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).</li><li>Packer, L., Fuehr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+oxygen+concentration+extends+the+lifespan+of+cultured+human+diploid+cells.">Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells.</a> Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).</li><li>Lengner, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+pre-X+inactivation+human+embryonic+stem+cells+under+physiological+oxygen+concentrations.">Derivation of pre-X inactivation human embryonic stem cells under physiological oxygen concentrations.</a> Cell. 141 (5), 872-883 (2010).</li><li>Sidoli, S., Kulej, K., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+proteomics+is+not+the+new+genomics+and+the+future+of+mass+spectrometry+in+cell+biology.">Why proteomics is not the new genomics and the future of mass spectrometry in cell biology.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 21-24 (2017).</li></ol>

Proteomik ifade bütün bir hücre veya hücre altı bölmeleri farklı proteinlerin eğitim için güçlü bir araç olduğundan, hücre lizis Protokolü duruma getirilmesi ve proteinlerin sindirim çalışmalar bir dizi tarafından ele alınmıştır. Jel sindirim (polyacrylamide jel matris proteinlerin sindirim)17, çözüm18 ve filtre destekli örnek hazırlama19sindirim dahil yöntemleri üç ana sınıf vardır. Bu son yöntem, evrensel olarak,...

Makrofajlar doğuştan gelen bağışıklık hücreleri apoptotik hücreler kaldırılması da dahil olmak üzere ve hücre dışı matriks1/ remodeling doku homeostazı için yanıt Bulaşıcı patojenler için arasında değişen fizyolojik fonksiyonları bir dizi yer vardır. Bu hücreler kutuplaşmalar olarak da adlandırılan bir birçok olası etkinleştirme devlet çevirir güçlü fenotipik plastisite2 ile karakterizedir. Bu çeşitli kutuplaşmalar hassas moleküler açıklaması makrofaj biyoloji3alanında bir önceliktir. Sözde M1/M2 ikilemi M1 pro-inflamatuar temsil eder ve anti-inflamatuar makrofajlar M2 temsil eder kullanarak bu kutuplaşmalar sınıflandırmak için önerilmiştir. Bu model de akut enfeksiyonlar, alerji ve obezite4gibi çeşitli patolojik durumlar sığar. Ancak, kronik iltihaplı doku ve kanser, o bu sınıflandırma makrofajlar belirli hücresel ortamlar5,6', mevcut geniş fenotipik repertuar kavramak değiştiremiyor gösterilmiştir 7. makrofaj kutuplaşma daha iyi belirli microenvironmental sinyalleri8entegre etmek için bir çok boyutlu modeli kullanarak açıklanan geçerli fikir birliği olduğunu. Bu sonuç insan makrofajlar M1/M2 model elde edilen kutuplaşmalar9tanımlamada yetersiz olduğunu gösteren transcriptomic analizi ile doğrulanmıştır.
Çalışma insan makrofajlar içinde çeşitli kutuplaşmalar proteomik imzalarını edinmek için bir protokol sağlar amaçlamaktadır sundu. Biz çeşitli oksijen düzeyleri ortamlarda insan makrofajlar ayırt etmek ve peptidler etiket içermeyen bir miktar gerçekleştirmek için tüm makrofaj Proteom elde etmek nasıl açıklar. Bu miktar çeşitli proteinlerin ifade düzeylerinin karşılaştırılması sağlar. Kök hücre araştırma bir çevre anahtar parametreyi10olarak oksijen önemini ortaya koyduğu gibi bu doku parametre insanlarda makrofaj polarizasyon etkisi nasıl anlamak arıyoruz. Oksijen kısmi basınç aralığı %3 20 (Toplam atmosferik basınç) % 20 kabaca ne genellikle (tam değer %18,6 su varlığı çekerken civarındadır bir hücre kültür kuluçka kullanılır için kaynakçalara insan vücudunda bulundu hesap).
Önceki çalışma alveoler fonksiyonel üzerinden interstisyel makrofajlar farklıdır ve morfolojik nokta sayısı11 ve bu farklılıkların muhtemelen kısmen maruz kalan12oldukları farklı oksijen seviyesi nedeniyle vardır göstermiştir. Ayrıca, kemik iliği türevi makrofajlar bir düşük oksijen çevre12' ye maruz kaldığında bakteri işbirliği için artan bir yetenek göstermek. Tam tersi bir etki için insan makrofajlar THP1 Ayrıştırılan13buldum, ama bu sonuçlar oksijen regülatörü makrofaj biyoloji olduğunu ve insan makrofajlar moleküler düzeyde bu rolü açıklamak için gerekli fikir destek. Bir önceki çalışmada, bu sorunlara yönelik olarak proteomik yaklaşım başvurdum. Aynı anda binlerce proteinler için ifade düzeylerini ölçme tarafından oksijen polarizasyon etkisi vurgulanır ve yeni moleküler işaretleyicilerin görünümünü bir liste sunuyoruz. Ayrıca bu bulgular bazı makrofajlar işlevlerine ilişkilendirmek başardık. Özellikle, fagositoz apoptotik hücre oranı ALOX15 upregulation için proteomik analizi14tarafından ortaya bağlı IL4/IL13-polarize makrofajlar içinde artış olmuştur bulduk. Bu da çalışmanın, biz böyle bir analiz gerçekleştirmek açıklar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hypoxia Working Station</td>
			<td>Oxford Optronix</td>
			<td>Hypoxylab</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C6 Flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>Accuri C6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5188-6435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (FA)</td>
			<td>ARISTAR</td>
			<td>450122M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-250 Coomassie blue</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1,610,436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide, E.Coli (LPS)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>437627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2D clean-up kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>80-6484-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium, glutamax supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1 M</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) Solution 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harvard Apparatus column Reverse C18 micro spin column</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>74-4601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5 M, pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Bis-Tris 4-12%</td>
			<td>Life Technologies SAS</td>
			<td>NP0321 BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 Microbeads human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS separation column LS</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 4 (IL4)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 13 (IL13)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-112-410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interferon gamma (INF&#947;)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14-FITC (clone T&#220;K4)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-080-701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSmix Tube Rotator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic Acid (TFA)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>28904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/Lys-C Mix</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>V5073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Mini, EDTA-free Protease Inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density Gradient Solution (Histopaque 1077)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10771-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accumax</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7089-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum from human male AB plasma (SAB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4522-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) solution 30%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9576-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisma-base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>49767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>114405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 20%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>57670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiourea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C9426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL sterile plastic pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer C Eppendorf</td>
			<td>VWR</td>
			<td>460-0223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak tC18 reverse phase cartridges, 100 mg</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT036820</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proteomic analysis of human macrophage polarization under a low oxygen environment

Makrofajlar doğuştan gelen bağışıklık hücreleri doku homeostazı için yanıt Bulaşıcı patojenler için arasında değişen fizyolojik fonksiyonları bir dizi yer vardır. Bu hücrelerin çeşitli işlevlerini etkinleştirme durumlarına hangi da polarizasyon denir ilişkilidir. Bu çeşitli kutuplaşmalar hassas moleküler açıklaması makrofaj biyoloji alanında bir önceliktir. Şu anda çok boyutlu bir yaklaşım nasıl polarizasyon çevre sinyalleri tarafından kontrol edilir açıklamak gerekli olduğunu kabul edilmektedir. Bu raporda, biz insan makrofajlar içinde çeşitli kutuplaşmalar proteomik imza elde etmek için tasarlanmış bir protokol tanımlamak. Bu iletişim kuralı etiket içermeyen bir miktar jel-şeker ve Lys C/tripsin-sindirmek hücresel lizis içerik elde makrofaj protein ifade temel alır. Biz de bağlı olarak çözüm sindirim ve isoelectric alternatif olarak kullanmak için ayırma odaklanan bir protokol sağlar. Oksijen konsantrasyonu dokularda ilgili bir çevre parametresi olduğundan, biz nasıl atmosferik kompozisyon keşfetmek için bu iletişim kuralını kullanmanız veya düşük oksijen ortamı makrofaj polarizasyon sınıflandırılması etkiler.

Periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) tarafından fark Santrifüjü elde başlayarak, protokol CD14 nüfusu izni alması+ monosit akış sitometresi (Şekil 1) fazla % 98 oranında biçilen bir saflığı ile. Bu monosit ikincil olarak çeşitli kutuplaşmalar doğru (Şekil 2) farklı. Ne zaman bir ayırma jel üzerinde seçilir, SDS-sayfa jeller üzerinde geçiş istenen bant sayısı elde etmek için adapte v...

Watch this Scientific Journal Video about Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment at JoVE.com

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Biz insan makrofajlar proteomik imzaları elde edilir ve bu düşük oksijen çevre makrofaj polarizasyon üzerindeki etkisinin belirlenmesi için geçerli bir iletişim kuralı mevcut.

Düşük oksijen ortamı altında insan makrofaj polarizasyon proteomik analizi

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Yani bu yöntem makrofaj biyoloji salanındaki temel soruların cevaplandırılmaya yardımcı olabilir, örneğin protein düzeyinde çeşitli ortamlar altında aktivasyon durumunun nasıl karakterize edilebildiği gibi. Bu tekniğin en büyük avantajı, etiketsiz niceleme yöntemi kullanılarak insan makrofajlarında birçok proteinin farklı bir ifade elde edilmesi ne kadar fırsat sağlamaktadır. Prosedürü gösteren benim laboratuvarımdan Marie Malier ve Magali Court olacak.Başlamak için, çözeltiLRSC almadan önce oda sıcaklığına ısınabilir, böylece iki 50 mililitresantrik santrifüj tüpleri her içine yoğunluk gradyan hücre ayırma çözeltisi 15 mililitre ekleyin. Yoğunluk sıcaklığa bağlı olduğundan bu esastır. LRSC'yi 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne boşaltın.50 mililitreye kadar 1x PBS ekleyin ve karıştırın. Sonra, çok yavaş, dengelenmiş yoğunluk gradyan çözeltisi 15 mililitre üstüne karışımı 25 mililitre ekleyin. Bu adımsırasında aşamaları karıştırmamaya dikkat edin.Kan bu aşamada herhangi bir rahatsızlık olmadan yoğunluk gradyan çözeltisi üzerine eklenmelidir. Her iki santrifüj tüpünü de 700 G'de 25 dakika boyunca santrifüjsüz olarak ayırın. Yoğunluk gradyan santrifüjünün sonunda, alttan yukarıya doğru katmanlar, pelet, yoğunluk gradyan çözelti fazı, PBMC tabakası ve seyreltilmiş plazmayı oluşturan eritrositler ve granülositlerdir.Bir pipetle, plazma fazını aspire etmeden geçirin. Sonra, yeni bir 50 mililitre santrifüj tüpü içine PBMC tabakası toplamak. 300 G.Aspirate supernatant ve makrofaj orta 40 mililitre pelet yeniden askıya 10 dakika boyunca bir yıkama kurulum ve santrifüj olarak PBMCs için 1x PBS 50 mililitre kadar ekleyin.Bir Malassez odasında PBMCs kanepede sonra, bir santrifüj tüpü için deneme yapmak için gerekli PBMCs miktarını aktarın. Hücreleri 300 G.Aspirate'da 10 dakika santrifüj edin ve 10 milyon PBMC'de sıralama tamponunun 80 mikrolitresinde peleti yeniden askıya alın. Daha sonra, 10 milyon PBMC'ye 20 mikrolitre CD14 mikroboncuk ekleyin.İyi bir şekilde karıştırın ve sürekli ajitasyon altında 4 santigrat derecede 15 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, bir yıkama adımı olarak 10 milyon PBMC'ye bir mililitre sıralama tamponu ekleyin ve daha önce olduğu gibi santrifüj edin. Daha sonra, supernatant aspire ve 100 milyon PBMCs başına sıralama tampon 500 mikrolitre pelet yeniden askıya.Şimdi, ayırıcının manyetik alanına bir sütun yerleştirin. Üç mililitre sıralama arabelleğiyle durulayarak sütunu hazırlayın. Hücre süspansiyonu sütunüzerine uygulayın.Daha sonra gerekirse, sonraki boyama için etiketlenmemiş hücreleri içeren yoluyla akışı toplamak. Sütunu üç mililitre sıralama arabelleğiyle üç kez yıkayın. Sütununuzu kurutmamaya dikkat edin.Ardından, sütunun altına bir toplama tüpü yerleştirin ve ayırıcıdan çıkarın. Yıkamadan sonra, pipet sütuna tampon sıralama beş mililitre. Hemen sıkıca sütuniçine piston iterek manyetik etiketli hücreleri dışarı floş.Son olarak, monositleri kaplamadan ve metin protokolünde açıklandığı gibi makrofaj polarizasyongerçekleştirmeden önce bu adımları yeni bir sütunla tekrarlayın. Hipoksik durum analizi yapmak için monositleri ve makrofajları oksijen kontrollü bir ortamda koruyun. Deney sırasında istenilen oksijen kısmi basınç altında hücreleri korumak için bir hipoksi çalışma istasyonu kullanın.Düşük oksijen basıncı altında çalışırken, tüm ortam ve yıkama tamponları istasyonu altında hazırlamak ve sıvı doğru kısmi basınç elde etmek için yeterli beklemek önemlidir. Uyarlanmış bir başlık altında bir tampon hücre lisis gerçekleştirin. Her örnek için 300, 000 hücrenin protein eşdeğerini 4-12%bis-tris akrilamid jellerine yükleyin.Elektroforetik göçün süresini kontrol ederek her protein örneğinin burada gösterildiği gibi altı jel bandına bölünmesini sağlayın. Sabitleme ve metin protokolünde açıklandığı gibi boyama sonra, temiz bir neşter ile protein bantları çıkarmak. 500 mikrolitrelik tüpler içine yerleştirmeden önce her excised bant zar.Şimdi, jel dilimlerini 200 mikrolitrede 25 milimolar amonyum bikarbonatta 37 derecede 20 dakika yıkayın ve her adım arasında amonyum bikarbonat atın. 25 milimolar amonyum bikarbonat ve asetonitril bir yıkama ile bu izleyin. Daha sonra jel parçalarını %100 asetonitile 200 mikrolitre ile 10 dakika dehydrate.56 santigrat derece 45 dakika boyunca 10 milimolar DTT ve 25 milimolar amonyum bikarbonat ile her jel parçası kuluçka. Daha sonra, DTT atın ve oda sıcaklığında karanlıkta 35 dakika boyunca 25 milimolar amonyum bikarbonat 55 milimolar iodoacetamide ile jel parçası inkübün. Alkiliyasyonu durdurmak için, kullanılan çözeltiyi atın ve her jel parçasını oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 25 milimolar amonyum bikarbonatta 10 milimolar DTT'lik 200 mikrolitre ile kuluçkaya yatırın.Jel parçalarını 25 milimolar amonyum bikarbonat 200 mikrolitre yıkayın. Daha sonra, 10 dakika boyunca% 100 asetonitil 200 mikrolitre ile dehydrate. Üreticinin talimatlarına göre Tripsin/Lys-C Karışımı ile proteinleri bir gecede 37 santigrat derecede sindirin.Düşük emilim tüpleri 15 dakika boyunca% 50 asetonitil 50 mikrolitre ekleyerek jel parçalarından elde edilen peptidler ayıklayın. 15 dakika boyunca %5 formik asit 50 mikrolitre ekledikten sonra, 15 dakika boyunca% 100 asetonitril 50 mikrolitre ekleyin. Peptidlerin emilimini ve numune kaybını sınırlamak için düşük emilim tüplerinde her bir fraksiyonu çekin ve kurulayın.Örnekleri metin protokolünde ayrıntılı olarak daha fazla analiz edinceye kadar 80 santigrat derecede saklayın. Burada gösterilen cd14 pozitif monositlerin manyetik boncuk seçimi nden sonra akış sitometrisi tarafından değerlendirilen temsili saflıktır. Farklılaştırılmış insan makrofajlarının faz kontrast görüntülemesi, dokuz günlük kültürden sonra elde edilen iki farklı kutuplaşma için elde edilen morfolojilerin heterojenliğini göstermektedir.Gümüş lekeli SDS sayfa jelleri kullanılarak off-jel sindirim bir örnek gösterilir. Hücre lysis ve çözelti içi sindirim sonrası proteinin değerlendirilmesi, lysis sırasında bozulma nın olmadığını ve sindirimin verimliliğini gösterir. Burada gösterilen pozitif iki bir elektrik yükü ile MS spektrumu üzerinde 597,29 kütle-şarj oranı bulunan bir peptid bir çarpışma kaynaklı dissosilasyon spektrumu bir örnektir.Bu spektrumdan, ilgili sıra belirlendi. Analizden sonraki nihai sonuç, farklı ifade edilmiş proteinler kullanılarak tüm polarizasyon durumlarının hiyerarşik kümelenmelerini temsil eden bir ısı haritasıdır. Analiz, %3 oksijen durumundaki tüm polarizasyonlarda aşırı ifade edilen bir protein kümesini ortaya koymaktadır.Bu yordamı denerken, protokolünüzü buna göre uyarlamak için yeni örneklerde ne tür bir kesirleme gerçekleştireceğinize öncelikle karar vermeniz gerektiğini unutmamanız önemlidir. Bu çalışmayı kullanan proteomik yaklaşım, makrofaj biyolojipolarizasyon çalışmaları alanında son yıllarda kullanılan genomik yaklaşımların tamamlayıcısidir. Gelişiminden sonra, bu teknik immünoloji alanında araştırmacı insanlarda ve diğer memelilerde bağışıklık hücrelerinin aktivasyon çeşitli durumları keşfetmek için önünü açar.DTT ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın, bu nedenle bu işlemi yapmak için uyarlanmış bir başlık altında çalışmanız gerekir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

İnsan Retina ve RPE koroid diseksiyon proteomik analizi için

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID — Proteomik analiz onların yerel hücresel ortamında içeriğe özel Protein kompleksleri

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

Örnekleme ve diş minesini Önarıtma kararlı karbon ve oksijen izotop analizi için karbonat

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Dinamik proteomik ve miRNA analiz polizomlar izole fare kalp sonra Langendorff perfüzyon üzerinden

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrasyon-Alerjik Vitro miktar Protein Homo-Oligomerizasyonda ticari araçları ve ücretsiz, açık kaynak parlaklık analiz yazılımı kullanarak

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Anaerobik Protein Saflaştırma ve DesB Dioxygenase etkinliği ve inhibisyon çalışmak için oksijen elektrodu ile kinetik Analizi

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Ölçme ve oksijen Tüketim oranları tamamen yorumlama kafa kesimleri sinek

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Çay (Camellia sinensis L.) türetilmiştir yeni kurulan hücre süspansiyon kültürü altı sistemik Böcek Ilacı metabolizması üzerinde çalışma Yaprak -ları

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...