Name: rapid fluorescence-based characterization of single extracellular vesicles in human blood with nanoparticle-tracking analysis
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis at JoVE.com

作者感谢粒子 metrix gmbh 部分地支付了这项工作的出版费用。

杜塞尔多夫大学的机构道德委员会批准了这项工作中提出的实验 (参考编号: 3381)。
1. 从人全血中分离 ev
<ol><li>用外源沉淀溶液隔离 ev。<ol>
<li>通过静脉穿刺将人的全血收集2毫升, 并在室温 (rt) 下孵育管 15分钟, 直到凝固完成。</li>
		<li>在 rt 以 1, 700 x 克离心 sst 10分钟, 将细胞与血清分离, 并将血清中的1毫升转移到 1.5 ml 的反应管中。在4°c 条件下, 以 3, 000 x g的速度离心富含血小板的等离子体 (prp), 以15分钟的速度去除血小板, 并将100微米的血小板差等离子体 (ppp) 转移到新的 1.5 ml 反应管中。</li>
		<li>彻底加入25μl 的外生沉淀溶液 (4份 ppp, 1份外生沉淀溶液) 并彻底加入涡旋。将样品在冰上加加30分钟。保持管直立, 在潜伏期内不要旋转或混合管。</li>
		<li>在4°c 条件下, 以 1 , 500 x 克离心样品 30分钟, 使电动车颗粒状。离心后, ev 在容器底部显示为米色或白色颗粒。在4°c 下, 将上清液和离心机样品以 1, 500 x g进行5分钟的旋转。</li>
		<li>去除所有液体的痕迹, 并通过频繁的上下移液, 在100μl 的磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 中重新悬浮颗粒。在未立即进行分析时, 将 ev 悬架存储在-80°c。 注意: 当从血浆中分离电动车时, 纤维蛋白原和纤维蛋白会妨碍有效的恢复, 再悬浮液会更重, 需要更多的时间。</li>
	</ol>
</li>
	<li>用超离心分离电动车。<ol>
<li>从冰箱中取出预冷转子 (tla-55 固定角度), 并在使用前冷却超离心机。</li>
		<li>将 1.25 ml 的 ppp (在步骤1.1 中制备) 转移到合适的 1.5 ml 离心管, 其盖和离心机样品在 110, 000 x g 下, 在4°c 下90分钟。在启动前确保转子负载平衡。</li>
		<li>将上清液分上液, 并将管倒置在纸巾上 2分钟, 将颗粒重新悬浮在500μl 的 pbs 中, 并在4°c 下将样品以 110, 000 x g离心90分钟。</li>
		<li>在50μl 的 pbs 中吸吸上清液并重新悬浮颗粒。 注: 仅使用为正在使用的超离心机设计的转子和附件。通过使用水, 使转子中的管道更容易, 因为管道的强度可能因批次而异。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 样品的染色
<ol><li>用 pkh67 染色样品。<ol>
<li>在 1.5 ml 反应管中加入1μl 的 pkh67 乙醇染料溶液到50μl 的稀释剂 c (包括在试剂盒中), 并进行彻底的混合, 从而制备染色溶液。</li>
		<li>将10μl 的染色溶液转移到20μl 的 ev 悬浮液 (在步骤1.1 中制备) 到反应管中, 在黑暗中彻底混合并孵育5分钟。</li>
		<li>用2.5 毫升蒸馏水在15毫升反应管中稀释染色 ev 悬浮液 50μl, 彻底混合, 并使用这种最终悬浮液进行颗粒测量。 注意: 使用水作为电动汽车悬架的稀释剂是至关重要的, 因为其他稀释剂 (如pbs) 会影响测量。使用储存的 EV-suspension 液时, 在冰上解冻样品, 然后彻底混合, 然后再染色。</li>
	</ol>
</li>
	<li>用特定抗体染色样品。<ol>
<li>用50μl 的蒸馏水稀释 ev 悬浮液 10-20μl (在步骤1.1 中制备), 在 1.5 ml 反应管中彻底混合。</li>
		<li>将特定抗体 (表 1) 的2.5-5μl 添加到反应管中, 彻底混合, 并在黑暗中在 rt 孵育30分钟。</li>
		<li>将染色 ev 悬浮液50μl 转移到 2.5-10 ml 蒸馏水 (表 1) 中的15毫升反应管中, 充分混合, 并使用此最终悬浮液进行颗粒测量。 注意: 在某些情况下, 必须调整使用过的抗体的浓度 (表 1)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 样品的处理
注: 此方法的基本原理先前和下面的协议重点介绍了分析荧光标记的 ev14 所需的具体步骤。
<ol><li>执行启动过程。<ol>
<li>将荧光滤光片推入显微镜和相机的光路。启动程序, 并按照屏幕上的说明自动实现。</li>
		<li>在 "细胞检查" 选项卡 (细胞定义) 中选择正确的细胞号 (Z158_C1149_Fluor) 进行荧光测量。选择光学的参考位置, 以确保激光和显微镜处于共同的焦点 (激光和显微镜自动移动到这个位置)。</li>
		<li>用装满10毫升蒸馏水的注射器冲洗细胞通道。确保测量单元没有气泡, 并且不会向系统中注入气泡。</li>
		<li>准备一个校准悬架, 其中包含均匀的200纳米荧光标记聚苯乙烯颗粒, 这些颗粒表面有羧酸盐基团。用990μl 蒸馏水稀释颗粒10μl。然后将该颗粒溶液的10μl 稀释在含有 10 ml 蒸馏水的 15 ml 管中, 以获得所需的浓度。</li>
		<li>在电池通道中注入2.5 毫升稀释颗粒溶液, 然后单击 "优化对焦" 以调整相机。</li>
	</ol>
</li>
	<li>测量样品。<ol>
<li>在每次样品测量之前, 用充满10毫升蒸馏水的注射器多次冲洗细胞通道。将染色的 ev 悬架 (在步骤2中准备) 注入电池通道。</li>
		<li>根据需要调整软件中 "单元格检查" 选项卡中的以下主要相机参数 (表 2)。使用参考位置或位置0.41193 调整参数。<ol>
<li>为了提高灵敏度, 请点击 "粒子数与灵敏度" 按钮, 为每个屏幕显示不同灵敏度级别的测量粒子曲线, 从而找到最佳的灵敏度范围。 注意：</li>
			<li>对于快门, 调整相机允许光线在确定的时间间隔内通过的时间段。</li>
			<li>对于采集后参数, 请选择最小亮度为20、最小尺寸为 20 nm 和最大尺寸为 500 nm 进行测量。</li>
		</ol>
</li>
		<li>请注意从显示屏上计算出的视野中检测到的粒子数量。散射杆必须在绿色到橙色范围内 (50-300 粒子)。如果散射条是红色的, 散射将融合单个粒子, 并将它们计算为单个粒子, 从而导致错误的结果。在这种情况下, 进一步稀释样品, 以避免重叠的粒子或降低灵敏度。</li>
		<li>在开始测量之前, 请单击 "单元格检查" 选项卡中的 "检查 0 v 处的粒子漂移"。如果漂移高于 5μms, 请等待样品停止流动以继续测量。 注意: 如果测量开始时漂移过高, 重复测量可能会有所不同, 结果也会复杂。由于 nta 的基本原理, 相关漂移可能会对软件计算的确定颗粒大小产生影响。</li>
		<li>点击 "测量" 选项卡中的 "运行视频采集", 选择实验次数 (3-5) 和它们之间的时间延迟 (0分钟)。</li>
		<li>定义每个测量位置的 (单个次卷) 的数量 (11) 和 (测量) 周期 (10) 的数量, 在每个测量位置应对颗粒进行分析</li>
		<li>选择一个文件夹, 创建一个新的文件名, 然后单击 "确定" 开始测量。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 结果的解释
<ol><li>测量后, 在 "分析" 选项卡上查看结果和参数。在清洗细胞通道前检查以下参数: 每个位置的平均颗粒数、跟踪颗粒总数和颗粒浓度、颗粒的分布宽度 (x10、x10 和 x10 值)、值平均值和标准偏差。如果需要, 重复测量样品。 注意: 结果也保存为. pdf 或. txt 文件。</li>
	<li>点击 "分析" 选项卡查看测量后计算的图形, 该图表按大小显示检测到的粒子的分布情况。点击 "分析" 选项卡中的 "显示", 并使用图标调整和更改特定要求的图形设置。</li>
</ol>5.通过ev 检测进行西部印迹验证
<ol><li>将 ripa 裂解和萃取缓冲液中的 ev 颗粒 (在步骤1中制备) 溶解, 在冰上彻底移液并孵育 30分钟, 在4°c 下以 8, 000 x 克离心样品 10分钟, 以澄清裂解液并将上清液转移到新的管中。</li>
	<li>用 lowry 蛋白检测试剂盒测量总蛋白。用49μl 的 ripa 缓冲液稀释隔离 ev 悬浮液的 1μl, 并在三重奏中使用5μl 进行分析。用 2x laemmli 负载缓冲液将 ev 悬架稀释至2μgμl 的最终浓度, 并在95°c 下加热10分钟。</li>
	<li>每口装20微克蛋白质。根据标准方案, 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和储罐印迹法分离和传递蛋白质。</li>
	<li>在 rt 用牛奶粉 (5%) 将膜 (0.2μm 聚偏二氟化乙烯) 固定 1小时, 并在4°c 下用特定的原生抗体 (cd9、cd63 和 vimentin) 在夜间孵育膜。 注: 主要抗体用于1:1000 稀释。</li>
	<li>用 tbst 3x5分钟清洗膜, 用辣根过氧化物酶 (hrp)-共轭二级抗体 (tbst 为 1:20000) 孵育膜60分钟。</li>
	<li>用 tbst 3x 5分钟清洗膜, 并在成像系统上使用高灵敏度底物溶液的化学发光检测蛋白质。 注: 由于 cd63 抗原被广泛和不同程度的糖基化, 分子量可能会有所不同, 并可能出现在40-65kda 之间。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ibrahim, A., Marban, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+Fundamental+Biology+and+Roles+in+Cardiovascular+Physiology.">Exosomes: Fundamental Biology and Roles in Cardiovascular Physiology.</a> Annual Review of Physiology. 78, 67-83 (2016).</li><li>Su, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+exosome-mediated+intercellular+communication+in+vascular+remodeling.">Emerging role of exosome-mediated intercellular communication in vascular remodeling.</a> Oncotarget. 8 (15), 25700-25712 (2017).</li><li>Lasser, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+saliva,+plasma+and+breast+milk+exosomes+contain+RNA:+uptake+by+macrophages.">Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages.</a> Journal of Translational Medicine. 9, 9 (2011).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+RNA+content+of+the+exosomes+derived+from+blood+serum+and+urine+and+its+potential+as+biomarkers.">Analysis of the RNA content of the exosomes derived from blood serum and urine and its potential as biomarkers.</a> Philosophical Transactions of The Royal Society B Biological Sciences. 369 (1652), (2014).</li><li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+novel+biomarkers+for+clinical+diagnosis.">Exosomes: novel biomarkers for clinical diagnosis.</a> The Scientific World Journal. 2015, 657086 (2015).</li><li>Properzi, F., Logozzi, M., Fais, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+the+future+of+biomarkers+in+medicine.">Exosomes: the future of biomarkers in medicine.</a> Biomarkers in Medicine. 7 (5), 769-778 (2013).</li><li>Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+composition,+biogenesis+and+function.">Exosomes: composition, biogenesis and function.</a> Nature Reviews Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).</li><li>De Toro, J., Herschlik, L., Waldner, C., Mongini, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+roles+of+exosomes+in+normal+and+pathological+conditions:+new+insights+for+diagnosis+and+therapeutic+applications.">Emerging roles of exosomes in normal and pathological conditions: new insights for diagnosis and therapeutic applications.</a> Frontiers in Immunology. 6, 203 (2015).</li><li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2006).</li><li>Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+analysis+of+extracellular+vesicles+using+flow+cytometry.">Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).</li><li>Wu, Y., Deng, W., Klinke, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+improved+methods+to+characterize+their+morphology,+RNA+content,+and+surface+protein+biomarkers.">Exosomes: improved methods to characterize their morphology, RNA content, and surface protein biomarkers.</a> Analyst. 140 (19), 6631-6642 (2015).</li><li>Bianco, N. R., Kim, S. H., Morelli, A. E., Robbins, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+immune+response+using+dendritic+cell-derived+exosomes.">Modulation of the immune response using dendritic cell-derived exosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 380, 443-455 (2007).</li><li>Conde-Vancells, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+comprehensive+proteome+profiling+of+exosomes+secreted+by+hepatocytes.">Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes.</a> Journal of Proteome Research. 7 (12), 5157-5166 (2008).</li><li>Mehdiani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+innovative+method+for+exosome+quantification+and+size+measurement.">An innovative method for exosome quantification and size measurement.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), 50974 (2015).</li></ol>

作者没有什么可透露的。

我们展示了一个详细的方案, 从全血分离 ev 和快速表征特定的表面标记与荧光纳米粒子跟踪分析。在所进行的实验中, 我们专门使用从血清样本中分离出的 ev, 但这种方法也适用于乙二胺四乙酸 (edta) 和柠檬酸血浆, 也可以扩展到其他体液, 如尿液, 母乳, 唾液,脑脊液和精液此外, 该协议还可以根据细胞培养上清液中的 ev 特性进行调整。在该协议中, ev 悬浮液是由100μl 的血清使用外源沉淀试剂产生的, 该试剂中含有一种专有聚合物, 根据从30纳米到200纳米的体积大小, 即 10-20μl, 轻轻沉淀外质和 ev为每个表面标记的特征指定了 ev。不幸的是, 隔离步骤是不可避免的, 因为血清样本中的大量蛋白质 (如白蛋白和球蛋白) 会干扰抗体染色程序, 并导致高水平的背景和复杂的发现。此外, 根据样品中外显体的生物可用性, 使用的 ev 悬浮液的数量以及加工前的稀释程度必须针对其他源材料进行调整。为了比较多个样品, 有必要采用标准化的方法来稀释样品以及一致的采集参数 (灵敏度、快门等)。另一个重要的一点是, 测量不会开始, 直到漂移低 (在我们手中, < 5μms)。如果漂移过高, 重复测量样品之间会产生较高的标准偏差, 但在漂移较低的情况下, 所产生的数据高度一致, 并确认了较高的重现性。重要的是, 所选择的抗体有一个适当的氟铬。抗体必须与亚历克莎福陆488结合, 因为 fitc 的光漂白率很高。更稳定的河流肯定会导致未来检测稳定性的提高。通常情况下, 许多研究人员使用 pbs 作为电动汽车的稀释剂.对于这个协议, 使用蒸馏水作为电动车悬架的稀释剂是至关重要的。当 ev 标记为荧光染料时, 其他稀释剂 (如 pbs) 的高渗透性和离子浓度会干扰测量, 并导致结果改变。
虽然在过去十年中, 电动车的分析方法有了很大的改进, 但仍然没有标准化的电动车隔离和表征方法.流式细胞术的主要缺点是, 许多 ev 停靠在表面上, 以提供强大且可检测到的信号10, 其中 ev 通常与珠子结合在一起, 以提供更大的表面。sem 和 tem 的缺点是样品的制备很耗时, ev 只能通过其大小和形态来区分。到目前为止, 最成熟和最常用的定性 (即生化) ev 特性的方法是西方印迹, 其中蛋白质可以用特定抗体12,13进行分析。然而, 所有这些方法的缺点在于无法分析特定表面标记的单个 ev。此外, 许多现行协议使用的处理时间长, 隔离过程长, 涉及劳动密集型步骤, 因此不适合高样品吞吐量和单个 ev 的表征.我们的协议提供了一个完整的工作流程, 用于快速隔离和表征具有特定表面标记 (如 cd63、cd9、vimentin 和 cd107a) 的单个 ev, 并可扩展到广泛的其他表面标记, 以确定发布的 evs.由于 nta 设备的长期技术进步, 我们与制造商合作, 使用最新的分析仪确认了我们的发现。无论未来电动汽车生物学的研究进展如何, 特别是外显子的研究进展如何, 这里介绍的协议都将为用特定标记对单个 ev 进行定性提供一种快速可靠的方法。由于在隔离和染色过程中的 ev 聚合是不可避免的, 因此未来的研究应侧重于开发防止 ev 聚合的方法, 并能够准确地确定荧光标记 ev 的尺寸.

细胞外囊泡 (ev), 包括外显子体, 是专门的膜质纳米囊泡 (20-150 nm), 包含脂质、粘附和细胞间信号分子的某些组合, 以及其他功能性胞增多成分, 如微 rna (mirna) 和 mrna, 在调节细胞通讯1,2中起着举足轻重的作用。ev 在其环境中从许多不同的细胞类型 (如内皮细胞、免疫细胞和肿瘤细胞) 中释放, 并可在体液中检测到, 如血清精液、尿液、母乳、唾液或脑脊液3,4. 越来越多的研究突出表明, 电动车作为早期诊断几种疾病和预测疾病进展的潜在生物标志物的各种贡献。外质体通常是由它们与之有特殊联系的分子的存在来描述的, 无论它们从7 中获得的细胞类型是什么。例如, 外显子含有不同的四帕那因 (cd9, cd63, cd81), 主要组织相容性复合体 i 类 (mhc i) 分子, 各种跨膜蛋白, 典型的细胞质蛋白 (管蛋白和肌动蛋白), 参与多囊体的分子 (cd9, cd63, cd81)mvb) 生物发生 (tsg101 和 alix)、热休克蛋白 (hsp 70 和 hsp 90) 以及参与信号转导 (蛋白激酶)的蛋白质8。
描述了许多不同的方法来描述 ev9。电动汽车分析最常见和最普遍的方法是流式细胞术10、扫描电子显微镜 (sem) 和透射电子显微镜 (tem)11。最好的方法是对 ev 含量进行生化表征, 最常用的方法是西方印迹12,13。虽然 sem 和 tem 允许检测整个尺寸谱中的 ev, 但对特定表面蛋白质的识别非常有限是这些方法的一个特别缺点。相反, 流式细胞术是识别特定 ev 表面标记的有力工具, 但这种方法的阈值将分析限制为尺寸大于500纳米的 ev。因此, 目前无法通过这三种既定的方法中的任何一种来分析孤立的电动车, 并检测到特定的表面标记。我们之前描述了另一种高度敏感的方法, 可视化和分析的 ev, 纳米粒子跟踪分析 (nta)14。简单地说, 这种方法结合了两种不同的物理原理。首先, 粒子在被激光束照射时散射光, 第二个原理被称为布朗运动, 这意味着液体悬浮液中不同粒子的扩散与其大小成反比。用于液体样品的半自动桌面纳米粒子分析仪由基于软件的分析的粒子跟踪分析仪组成, 记录了单个颗粒散射光的数字图像。用摄像机的激光散射显微镜检测粒子和粒子的运动。激光束是垂直方向的, 而光轴是水平的, 并聚焦到充满样品的电池通道。通过分散光点图及其运动速度提供的数据, 可以确定总颗粒数量和粒径分布。在激光照射后, 粒子散射光线, 由数字摄像机通过显微镜14记录. 我们以前的方法的进展是在激光 (波长 488 nm) 和细胞通道之间插入一个500纳米长的波通 (lwp) 截止滤波器, 从而能够直接分析荧光标记的粒子 (图 1)。我们的协议解决了许多研究人员在这一领域的共同需求, 即根据其父母出身,快速描述单个电动车。在该协议中, 我们描述了快速隔离 ev 与人体全血的完整工作流程, 以及利用基于荧光的纳米跟踪分析快速表征特定标记物的工作流程。ev 可以通过使用 pkh67 (一种普通的细胞膜链接器) 染色以及特定的外染色体标记 (如cd63、cd9 和 vimentin) 进行检测。我们的协议也适用于 edta 和柠檬酸血浆, 以及其他体液和细胞培养上清液。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Serum-separation tube</td>
			<td>BD</td>
			<td>366882</td>
			<td>BD Vacutainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampuwa water</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>10060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>56064C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube, 15 mL</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube, 50 mL</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>227270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>Speciality tubes for ultra centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube with Snap-On Cap 1.5 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybeads Microspheres 0.2 &#181;m</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>7304</td>
			<td>Alignment Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres beads 0.2 &#181;m</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>09834-10</td>
			<td>Alignment Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 2 mL</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606027V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 mL</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606728V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exoquick</td>
			<td>SBI</td>
			<td>EXOQ20A-1</td>
			<td>EV precipitation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli Sample Buffer (2x)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Protein Assay Kit II</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>5000112</td>
			<td>Lowry prtein assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PKH67GL-1KT</td>
			<td>For general membrane labelling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-human CD107a Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>328609</td>
			<td>Lysosomal-associated membrane protein-1 (LAMP-1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human CD9-Alexa Fluor 488</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>FAB1880G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD9 Antibody</td>
			<td>SBI</td>
			<td>EXOAB-CD9A-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63-Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MA5-18149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD63 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>353005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63. Antibody, polyclonal</td>
			<td>SantaCruz</td>
			<td>Sc-15363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-vimentin Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>677809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vimentin Antibody</td>
			<td>SBI</td>
			<td>EXOAB-VMTN-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti mouse IgG + IgM</td>
			<td>Jackson Immuno</td>
			<td>315-035-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti rabbit IgG</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>111-035-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>34094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaView</td>
			<td>Particle Metrix</td>
			<td>PMX 100, Type</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima MAX-XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence Imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Amersham Imager 600</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid fluorescence-based characterization of single extracellular vesicles in human blood with nanoparticle-tracking analysis

细胞外囊泡 (ev), 包括外显子体, 是在体液中发现的特殊膜质纳米囊泡, 这些囊泡从许多细胞类型中形成了本组织释放, 在调节细胞通讯和各种细胞通信方面发挥着关键作用。生物过程。描述了许多不同的电动车特性方法。然而, 这些方法大多有缺点, 即样品的制备和表征非常耗时, 或者由于其体积小和缺乏离散标记, 很难分析感兴趣的特定标记。人口。虽然在过去十年中, 电动车的分析方法有了很大的改进, 但仍然没有标准化的单一电动车定性方法.在这里, 我们展示了一种基于荧光的纳米粒子跟踪分析对单个 ev 进行表征的半自动方法。该协议解决了这一领域许多研究人员的共同问题, 并提供了完整的工作流程, 以便使用 pkh67 (一般细胞膜链接器 pkh67) 以及特定的表面标记 (如作为 cd63、cd9、vimentin 和溶酶相关膜蛋白 1 (lamp-1)。所提供的结果表明, 正如西方印迹等其他方法所证实的那样, 具有较高的重现性。在所进行的实验中, 我们专门使用从人体血清样本中分离出的 ev, 但这种方法也适用于血浆或其他体液, 可以根据细胞培养上清液中的 ev 的特性进行调整。无论未来电动汽车生物学的研究进展如何, 本文提出的协议都为具有特定标记的单个 ev 的快速表征提供了一种快速可靠的方法。

从全血中分离出 ev, 并采用荧光试剂进行纳米颗粒跟踪分析。在我们的实验中, 确定了测量未染色颗粒的最佳灵敏度, 其范围为70%。用于调整和校准测量的荧光灯珠在灵敏度为85% 的情况下显示出最佳设置 (图 2a)。在灵敏度为70% 和90% 之间, 检测到的粒子数量迅速增加, 而进一步增加的灵敏度可能会导致颗粒大小分布的恶化, 其中粒子的数量正在重新下降。摄像机的设置显示清晰的图片 (图 2b), 重复测量显示标准偏差较低 (图 2c)。在这方面, 对处理电动车样品的协议进行了调整, 以便所有测量都能在相同的设置下进行 (表 2)。分布宽度由 x 轴上的三个值定义, 即 x10、x10 和 x10。x50 或中位粒径是指一半人口位于此值以下的直径。同样, x10 和 x10 表示10% 和90% 的检测到的颗粒的直径低于报告的大小。用 pkh67 细胞链接剂试剂盒染色, 包括一种荧光细胞链接器, 该试剂盒将带有长脂肪尾巴的绿色荧光染料集成到细胞膜的脂质区域中, 表明其灵敏度与细胞数量之间存在很强的相关性。(图 3 a)。pkh67 通常用于增殖监测, 但也被证明对监测外生体或脂质体的吸收以及体内细胞贩运有用。由于 pkh67 的非特异性标签, 可以对各种电动车进行标记和检测。粒子的分布在266纳米 (x10) 和 1946 nm (x10) 之间, 峰值最大值为 857 nm (x10), 测量之间的标准偏差较低 (28.1 nm)。lamp-1, 也被称为溶酶体相关的膜糖蛋白1和 cd107a 主要驻留在溶酶体膜上。在使用带有针对 lamp-1 的特定抗体标记的亚历克莎 fluor 488 染色后, 颗粒的分布范围从 220 nm (x10) 到 1145 nm (x10), 峰值最大值为 541 nm (x10), 标准偏差为 11.7 nm (图 3b)。对于电动车的特性, 我们使用亚历克莎福陆488标记抗体对常见的外细胞标记, 并证实了我们的发现, 由西方印迹。在使用亚历克莎 flor 488 标记的 cd9 抗体染色后, 颗粒的分布范围从 251 nm (x10) 到 1139 nm (x10) 不等, 峰值最大值为 548 nm, 第二个小峰值为约 25 nm (图 4 a)。用亚历克莎氟化物488染色标记为 cd63 (图 488) 和 vimentin (图 488) 也产生了类似的结果。西方的印迹分析证实了我们在这里使用的抗体的积极结果。重复测量显示了本报告中使用的所有抗体的可重复结果。作为对照, 我们用各自的抗体 (图 5a) 染色无囊水 (图 5a), 其中 pkh67 和 lamp1 抗体几乎没有检测到抗电动汽车, 灵敏度接近100%。以 vimentin 为例, 高灵敏度增加了新出现的文物的数量, 即使样品基本上没有颗粒。如果在漂移过高 (> 5μs) 时开始测量, 则单个重复之间会明显偏离 (图 5b)。正如用三种不同的抗体表示的那样, 在开始测量之前, 漂移要尽可能最小是至关重要的。根据我们的经验, 使用荧光素异硫氰酸酯 (fitc) 作为荧光铬的测量结果是不准确和可重现的, 因为 fitc 容易出现快速的照片漂白 (图 5c)。因此, 我们建议专门使用亚历克莎福陆488标记抗体的 ev 表征。在该协议中, 用含有聚乙二醇的聚合物外显子沉淀溶液分离出电动车。为了确保我们的结果不被应用的隔离方法伪造, 我们在超离心隔离后对 ev 进行了表征。如 pkh67 和两种不同抗体 (cd63 和 lamp-1) 所示, 我们使用外体细胞沉淀溶液进行隔离的结果 (图 6a) 与通过超离心分离的 ev 相当 (图 6A).).遗憾的是, 由于超离心后的 ev 产量较低, 与外生沉淀溶液分离相比, 初始分离血清的集合必须明显高于分离。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58731/58731fig1.jpg"> 图 1: 纳米粒子跟踪分析的原理图设置.显微仪视频轴和激光束相互定向, 在细胞通道横截面交叉。在细胞通道和显微镜之间放置荧光滤光片。粒子散射的光线显示在软件的 "实时视图" 窗口中。采集后, 结果显示为大小分布曲线坐标系。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58731/58731fig1large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58731/58731fig2.jpg"> 图 2: 用荧光标记的珠子进行校准.(a) 在自动灵敏度扫描过程中, 粒子与灵敏度曲线的数量在一个时间点显示粒子在一个位置。(b) 实时视图屏幕上粒子的可视化。(c) 重复测量后的粒径分布。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58731/58731fig2large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58731/58731fig3.jpg"> 图 3: 使用 pkh67 和 lamp-1 染色后的代表性结果.粒子数与灵敏度曲线 (1)、实时视图屏幕上粒子的可视化 (2) 以及使用 pkh67 (a) 和 lamp-1 (b) 染色后的粒径分布 (3)。观察到类似的颗粒大小分布, 而灵敏度设置的变化导致检测到的粒子发生类似但并非完全相同的变化。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58731/58731fig3large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58731/58731fig4.jpg"> 图 4: 用亚历克莎 flor 488 染色后的代表性结果标记为 cd9、cd63 和 vimentin.粒子与灵敏度曲线 (1) 的数量, 实时视图屏幕上的粒子可视化 (2)、粒径分布 (3), 以及两个不同 ev 悬架 (4) 的具有代表性的西方印迹, 用于 cd9 (24-27 kda, a)、cd63 (26 kda,b) 和 vimentin (54 kda, c)。在西方印迹分析中, 沿灵敏度增加 (x 轴) 的粒子信号的延迟出现与较低的信号强度相关, 从而确认了相应粒子表面标记的较低量 (例如, vimentin vs.cd63)。请注意, 对于所有分析标记, 几乎相同的代表性测量曲线表明具有较高的重现性 (3)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58731/58731fig4large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58731/58731fig5.jpg"> 图 5: 已使用控件和可能的错误源的代表性结果.(a) 以 pkh67 (1)、lamp-1 (2) 和 vimentin (3) 为对照染色的无喷镜水。(b) 在使用 lamp-1 (1)、cd63 (2) 和 cd9 (3) 染色后进行的具有代表性的粒度分布, 并在悬浮漂移过高的情况下进行测量。(c) 用 fitc 标记的 cd63 抗体染色后的颗粒数与灵敏度曲线 (1) 和粒径分布 (2) 的关系。每次测量后都会观察到清晰的漂白效果, 从而使颗粒数量逐渐减少。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58731/58731fig5large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58731/58731fig6.jpg"> 图 6: ev 的不同隔离方法的比较.用 pkh67 (1)、lamp-1 (2) 和 cd63 (3) 染色后, 用外粒沉淀液 (a) 和超离心 (b) 分离出的 ev 的粒径分布。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58731/58731fig6large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>lamp-1</td>
			<td>cd9</td>
			<td>cd63</td>
			<td>维门廷</td>
		</tr>
<tr>
<td>抗体 (μl)</td>
			<td>5</td>
			<td>2.5-5</td>
			<td>2.5-5</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>电动汽车悬架 (μl)</td>
			<td>10</td>
			<td>20</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>用于染色的h2o (μl)</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>最终体积 (毫升)</td>
			<td>5-10</td>
			<td>2.5-5</td>
			<td>5</td>
			<td>10</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: 使用过的抗体清单和样品稀释范围。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>采集参数</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>灵敏度 (%)</td>
			<td>85</td>
		</tr>
<tr>
<td>快门</td>
			<td>70</td>
		</tr>
<tr>
<td>最小亮度</td>
			<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td>麦克斯。尺寸 (纳米)</td>
			<td>500元</td>
		</tr>
<tr>
<td>最小尺寸 (nm)</td>
			<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td>极性</td>
			<td>负</td>
		</tr>
<tr>
<td>电压</td>
			<td>关机</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 v (μms) 处的粒子漂移</td>
			<td><</td>
		</tr>
<tr>
<td>位置</td>
			<td>11</td>
		</tr>
<tr>
<td>周期</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>多个收购</td>
			<td>3-5</td>
		</tr>
<tr>
<td>延迟时间 (分钟)</td>
			<td>0</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2:纳米粒子跟踪分析的采集参数.

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Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

在该协议中, 我们描述了快速分离细胞外泡从人类全血和特定标记的完整的工作流程, 通过荧光为基础的纳米粒子跟踪分析。结果表明, 该方法具有较高的重现性, 可根据细胞培养上清液的需要进行调整。

基于荧光的人体血液单细胞外囊快速表征

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

此方法解决了该领域的常见问题，并为具有特定兴趣标记的单细胞外囊泡的快速隔离和表征提供了完整的工作流程。纳米粒子跟踪分析是一种半自动化的方法。它利用光散射和布朗运动的属性来分析细胞外囊泡的大小分布。演示这个程序的将是维拉·施密特，一个来自我们实验室的博士生。为了分离细胞外囊泡，在将两毫升的人体全血样本收集到血清分离管中后，让样本在室温下凝固15分钟，然后通过离心将细胞从血清中分离。将每个样品中的一毫升血清转移到单独的1.5毫升反应管中，用于离心去除血小板，并转移100微升血小板贫素血浆到新的1.5毫升反应管。接下来，在等离子体中加入25微升的外体沉淀溶液，彻底涡流样品。在冰上孵育30分钟后，通过离心收集细胞外囊泡。颗粒将显示为米色或白色。吸上一液并再次离心样品。然后，去除所有液体的恍然大悟，将颗粒重新在 100 微升 PBS 中。要染色囊泡的细胞膜，在50微升新鲜准备的PKH67乙醇染料溶液中加入10微升的EV悬浮液，并彻底混合。在黑暗中室温下5分钟后，用2.5毫升蒸馏水在15毫升锥形管中稀释50微升染色的细胞外囊泡悬浮液，并进行彻底混合。要用抗体标记囊泡，在1.5毫升反应管中用50微升蒸馏水稀释10至20微升未污染的细胞外囊泡悬浮液，并进行彻底混合。将2.5至5微升的抗体加入反应管，彻底混合，在黑暗中室温下孵育30分钟。然后，将50微升的标记囊泡转移到一个15毫升的圆锥管中，该管含有适当的蒸馏水的实验体积，并彻底混合，如表中所示。在分析染色或标记的细胞外囊泡之前，首先将荧光过滤器移动到显微镜和相机的光学路径中，然后按照屏幕上的说明启动程序，实现自动实施。在"细胞检查"选项卡下，选择用于荧光测量的正确细胞号和光学器件的参考位置，以确认激光和显微镜是否处于共同焦点。使用注射器用 10 毫升蒸馏水冲洗细胞通道，注意测量单元没有气泡，并且不会将气泡注入系统。接下来，在990微升蒸馏水中稀释10微升200纳米大小的荧光标记聚苯乙烯颗粒，并将10微升的颗粒悬浮液加入含有10毫升蒸馏水的15毫升管中。然后，将第一个稀释颗粒溶液的 2.5 毫升注入细胞通道，然后单击"优化焦点"以调整摄像机。要测量样品，用10毫升蒸馏水多次冲洗细胞通道，并注射染色的细胞外囊泡悬浮液。使用参考位置，调整"单元格检查"选项卡下的适当采集参数，如表中所示。要确定最佳灵敏度范围，请单击"粒子数与"灵敏度，用于显示每个屏幕测量的粒子的曲线，以表示不同的灵敏度级别。对于快门参数，调整相机允许光线在确定的时间间隔内通过的时间段。对于后置参数，选择最小亮度为 20，最小尺寸为 20 纳米，最大测量尺寸为 500 纳米。请注意显示视野中检测到的粒子数。散射条应为绿色到橙色，50 到 300 粒子范围。单击"零伏特"时的粒子漂移，然后打开"测量"选项卡。单击"运行视频获取"，将实验数设置为 3 到 5，将实验之间的时间延迟设置为零分钟。将单个子卷位置数设置为 11，在分析粒子的每个测量位置将测量周期数设置为 10。然后，选择一个文件夹，创建新的文件名，然后单击"确定"以开始测量。在分析结束时，打开"分析"选项卡查看结果。然后，检查每个位置的平均粒子数、跟踪粒子总数和粒子浓度、粒子的分布宽度、平均值的值以及标准偏差。使用荧光珠调整和校准测量可提供 85% 的最佳设置灵敏度使用这些设置，摄像机可显示清晰的图像，并且重复测量显示低标准偏差。使用包括荧光细胞链接器的荧光细胞链接器染色，该试剂盒将绿色荧光染料与长而脂肪的尾部结合到细胞膜的脂质区域，揭示了灵敏度与所测颗粒数量之间的强烈相关性。细胞外囊泡染色抗体对感兴趣的蛋白质表示粒子分布从220到1，145纳米，峰值最大大小为541纳米。在控制性囊泡水的抗体染色后，未检测到细胞外囊泡，如果当漂移大于 5 微米/秒时开始测量，则个别重复表明明显的偏差。需要注意的是，使用氟素异异氰酸酯作为氟色素会导致不准确和不可重复的测量，因为这种荧光素容易产生快速光漂白。该协议解决了该领域的许多研究人员对使用特定标记快速表征单个细胞外囊泡的主要需求。尽管在过去十年中，方法有了很大改进，但还没有用于分析单个细胞外囊泡的标准化方案。无论将来细胞外囊泡生物学的研究进展如何，该方法都提供了一种快速可靠的方案，用于使用特定标记物对单个细胞外囊泡进行表征。由于我们当前的协议不涉及长处理时间或劳动密集型步骤，因此它们也适用于高样本吞吐量。

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