Name: quantitative immunoblotting of cell lines as a standard to validate immunofluorescence for quantifying biomarker proteins in routine tissue samples
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Immunoblotting of Cell Lines as a Standard to Validate Immunofluorescence for Quantifying Biomarker Proteins in Routine Tissue Samples at JoVE.co

تم تمويل هذا العمل جزئيا فردريك بانتنغ وتشارلز أفضل كندا الدراسات العليا المنح الدراسية (صباحا).

تم الحصول على موافقة على استخدام عينات الأنسجة البشرية الأساسية من "العلوم الصحية" والتابعة للمستشفيات التعليمية بحوث أخلاقيات المجلس (هسريب) في جامعة كوينز.
1-بناء خط خلية أنسجة ميكرواري (تي أم أية)
<ol><li>خلايا الحصاد، والمياه والصرف الصحي. ملاحظة: تم اختبار هذا البروتوكول...

<ol>
	<li>Khoury, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+Immunohistochemical+Assays+for+Integral+Biomarkers+in+the+NCI-MATCH+EAY131+Clinical+Trial.">Validation of Immunohistochemical Assays for Integral Biomarkers in the NCI-MATCH EAY131 Clinical Trial.</a> Clinical Cancer Research. 24 (3), 521-531 (2018).</li><li>Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G. L., da Silva Pinhal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+as+an+important+tool+in+biomarkers+detection+and+clinical+practice.">Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice.</a> Biomarker insights. 5, 9-20 (2010).</li><li>Seidal, T., Balaton, A. J., Battifora, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+and+quantification+of+immunostains.">Interpretation and quantification of immunostains.</a> The American journal of surgical pathology. 25 (9), 1204-1207 (2001).</li><li>Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+brown+cannot+do+for+you.">What brown cannot do for you.</a> Nature Biotechnology. 24 (8), 914-916 (2006).</li><li>Bokhart, M. T., Rosen, E., Thompson, C., Sykes, C., Kashuba, A. D. M., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mass+spectrometry+imaging+of+emtricitabine+in+cervical+tissue+model+using+infrared+matrix-assisted+laser+desorption+electrospray+ionization.">Quantitative mass spectrometry imaging of emtricitabine in cervical tissue model using infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (8), 2073-2084 (2015).</li><li>Porta, T., Lesur, A., Varesio, E., Hopfgartner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+in+MALDI-MS+imaging:+what+can+we+learn+from+MALDI-selected+reaction+monitoring+and+what+can+we+expect+for+imaging?.">Quantification in MALDI-MS imaging: what can we learn from MALDI-selected reaction monitoring and what can we expect for imaging?.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (8), 2177-2187 (2015).</li><li>Rzagalinski, I., Volmer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+low+molecular+weight+compounds+by+MALDI+imaging+mass+spectrometry+&#8211;+A+tutorial+review.">Quantification of low molecular weight compounds by MALDI imaging mass spectrometry &#8211; A tutorial review.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1865 (7), 726-739 (2017).</li><li>Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Western+blots:+Pitfalls+of+densitometry.">Quantifying Western blots: Pitfalls of densitometry.</a> ELECTROPHORESIS. 30 (11), 1845-1855 (2009).</li><li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics.">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li><li>Burgess, M. W., Keshishian, H., Mani, D. R., Gillette, M. A., Carr, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+and+efficient+quantification+of+low-abundance+proteins+at+very+high+multiplex+via+targeted+mass+spectrometry.">Simplified and efficient quantification of low-abundance proteins at very high multiplex via targeted mass spectrometry.</a> Molecular &amp; cellular proteomics: MCP. 13 (4), 1137-1149 (2014).</li><li>Carr, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+peptide+measurements+in+biology+and+medicine:+best+practices+for+mass+spectrometry-based+assay+development+using+a+fit-for-purpose+approach.">Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach.</a> Molecular &amp; cellular proteomics: MCP. 13 (3), 907-917 (2014).</li><li>Denburg, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Two+ELISA+Methods+and+Mass+Spectrometry+for+Measurement+of+Vitamin+D-Binding+Protein:+Implications+for+the+Assessment+of+Bioavailable+Vitamin+D+Concentrations+Across+Genotypes.">Comparison of Two ELISA Methods and Mass Spectrometry for Measurement of Vitamin D-Binding Protein: Implications for the Assessment of Bioavailable Vitamin D Concentrations Across Genotypes.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 31 (6), 1128-1136 (2016).</li><li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+immunohistochemistry,+imaging,+and+quantitation:+A+review,+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification,+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis.">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li><li>Peck, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+tumor+protein+marker+quantification+by+two+independent+automated+immunofluorescence+image+analysis+platforms.">Validation of tumor protein marker quantification by two independent automated immunofluorescence image analysis platforms.</a> Modern pathology: an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 29 (10), 1143-1154 (2016).</li><li>Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proof+of+the+quantitative+potential+of+immunofluorescence+by+mass+spectrometry.">Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry.</a> Laboratory Investigation. 97 (3), 329-334 (2017).</li><li>AlJohani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abundant+expression+of+BMI1+in+follicular+lymphoma+is+associated+with+reduced+overall+survival.">Abundant expression of BMI1 in follicular lymphoma is associated with reduced overall survival.</a> Leukemia and Lymphoma. 59 (9), 2211-2219 (2018).</li><li>Wood, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abundant+expression+of+interleukin-21+receptor+in+follicular+lymphoma+cells+is+associated+with+more+aggressive+disease.">Abundant expression of interleukin-21 receptor in follicular lymphoma cells is associated with more aggressive disease.</a> Leukemia and Lymphoma. 54 (6), 1212-1220 (2013).</li><li>Weberpals, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+application+of+the+Automated+QUantitative+Analysis+(AQUA)+technique+to+quantify+PTEN+protein+expression+in+ovarian+cancer:+A+correlative+study+of+NCIC+CTG+OV.16.">First application of the Automated QUantitative Analysis (AQUA) technique to quantify PTEN protein expression in ovarian cancer: A correlative study of NCIC CTG OV.16.</a> Gynecologic Oncology. 140 (3), 486-493 (2016).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraffin+embedding+tissue+samples+for+sectioning.">Paraffin embedding tissue samples for sectioning.</a> CSH protocols. , (2008).</li><li>Fedor, H. L., Marzo, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+Practical+Methods+for+Tissue+Microarray+Construction.">De Practical Methods for Tissue Microarray Construction.</a> Methods in Molecular Medicine. , 89-101 (2005).</li><li>Kajimura, J., Ito, R., Manley, N. R., Hale, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Single-+and+Dual-Color+Immunofluorescence+Protocols+for+Formalin-Fixed,+Paraffin-Embedded+Archival+Tissues.">Optimization of Single- and Dual-Color Immunofluorescence Protocols for Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Archival Tissues.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 64 (2), 112-124 (2016).</li><li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blot:+technique,+theory,+and+trouble+shooting.">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> North American journal of medical sciences. 4 (9), 429-434 (2012).</li><li>Wiedemann, M., Lee, S. J., da Silva, R. C., Visweswaraiah, J., Soppert, J., Sattlegger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+semi-dry+electrophoretic+transfer+of+a+wide+range+of+differently+sized+proteins+for+immunoblotting.">Simultaneous semi-dry electrophoretic transfer of a wide range of differently sized proteins for immunoblotting.</a> Nature Protocol Exchange. , (2013).</li><li>Delbridge, A. R. D., Grabow, S., Strasser, A., Vaux, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thirty+years+of+BCL-2:+translating+cell+death+discoveries+into+novel+cancer+therapies.">Thirty years of BCL-2: translating cell death discoveries into novel cancer therapies.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (2), 99-109 (2016).</li><li>Bosch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bioclinical+prognostic+model+using+MYC+and+BCL2+predicts+outcome+in+relapsed/refractory+diffuse+large+B-cell+lymphoma.">A bioclinical prognostic model using MYC and BCL2 predicts outcome in relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma.</a> Haematologica. 103 (2), 288-296 (2018).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BCL2+mRNA+or+protein+abundance+is+superior+to+gene+rearrangement+status+in+predicting+clinical+outcomes+in+patients+with+diffuse+large+B-cell+lymphoma.">BCL2 mRNA or protein abundance is superior to gene rearrangement status in predicting clinical outcomes in patients with diffuse large B-cell lymphoma.</a> Hematological Oncology. 35, 288-289 (2017).</li><li>Choi, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+expression+of+Bcl-2+predicts+poor+outcome+in+diffuse+large+B-cell+lymphoma+patients+with+low+international+prognostic+index+receiving+R-CHOP+chemotherapy.">High expression of Bcl-2 predicts poor outcome in diffuse large B-cell lymphoma patients with low international prognostic index receiving R-CHOP chemotherapy.</a> International Journal of Hematology. 103 (2), 210-218 (2016).</li><li>. The Human Protein Atlas BCL2 Available from: <a target="_blank" href="https://www.proteinatlas.org/ENSG00000171791-BCL2/cell#rna">https://www.proteinatlas.org/ENSG00000171791-BCL2/cell#rna</a> (2018)</li><li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+multiplex+immunofluorescence+panels+using+multispectral+microscopy+for+immune-profiling+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+human+tumor+tissues.">Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).</li><li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Guide+to+Modern+Quantitative+Fluorescent+Western+Blotting+with+Troubleshooting+Strategies.">A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).</li><li>Zellner, M., Babeluk, R., Diestinger, M., Pirchegger, P., Skeledzic, S., Oehler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+Western+blotting+for+quantitation+of+protein+biomarkers+in+clinical+samples.">Fluorescence-based Western blotting for quantitation of protein biomarkers in clinical samples.</a> ELECTROPHORESIS. 29 (17), 3621-3627 (2008).</li><li>Parra, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Platforms+of+Multiplexed+Immunofluorescence+for+Study+of+Paraffin+Tumor+Tissues.">Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues.</a> Journal of Cancer Treatment &amp; Diagnostics. 2 (1), 43-53 (2018).</li><li>Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunofluorescence+labelling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+tissue.">Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BMC Cell Biology. 9 (1), 13 (2008).</li></ol>

لقد قمنا بوصف أسلوب الذي يجعل من استخدام الكمية immunoblotting (IB) لإثبات جدوى الفلورة (إذا كان) للتحقق من الوفرة النسبية للبروتين المستهدف في عينات الأنسجة FFPE. أساليب القياس الكمي البروتين الحالية محدودة بطبيعتها القاطعة، مثل المدينة اللونية2،3، أو بالحاجة إلى مج...

الحاجة إلى تحديد كمية البروتينات في عينات خزعة الأنسجة (FFPE) الفورمالين--الثابتة، جزءا لا يتجزأ من البارافين موجود في العديد من المجالات الطبية. على سبيل المثال، يستخدم التقدير الكمي للعلامات البيولوجية البروتينات في عينات خزعة الروتينية توضيح التوقعات وأبلغ العلاج ل مرضى السرطان1. ومع ذلك، الأساليب الحالية هي عادة ذاتية وتفتقر إلى التحقق من صحة.
تستخدم بشكل روتيني في مختبرات علم الأمراض إيمونوهيستوتشيميستري (المدينة) ويتوقف عموما على جسم الأولية الموجهة في البروتين المستهدف وجسم ثانوي مترافق مع تسمية الانزيمية مثل الفجل البيروكسيديز2. المدينة التقليدية حساسة، يمكن أن تجعل استخدام دقيقة عينات ويحافظ على سلامة المورفولوجية لعينات الأنسجة مما يسمح بتقييم التعبير البروتين ضمن سياقها نسيجية ذات الصلة. ومع ذلك، نظراً للإشارات اللونية التي تم إنشاؤها بواسطة المدينة الاختزالي، يعاني من مجموعة ديناميكية ضيقة نسبيا وإمكانات محدودة للإرسال المتعدد2،،من34. الليزر ساعد مصفوفة التصوير (استخدام-MSI) الطيف الكتلي الامتزاز/التأين يحافظ على سلامة المورفولوجية. بيد أن هذه التكنولوجيا النامية يرتبط بالقرار المورفولوجية متواضعة وتتطلب المعايرة كبيرة والتطبيع وجدواه في الاستخدام السريري الروتيني5،،من67إضعاف. وتشمل تقنيات بديلة تحديد كمية البروتين في عينات الأنسجة immunoblotting8والطيف الكتلي9،،من1011والمرتبط بالانزيم المرتبط بالانزيم (إليزا)12، كل من الذي يبدأ المتجانس عينة الأنسجة. عينات الأنسجة الأساسية غير متجانسة في أنها تحتوي على العديد من أنواع الخلايا. ولذلك، لا تسمح التقنيات التي تنطوي على المجانسة العينات التحديد الكمي للبروتين في عدد سكان خلية معينة من الاهتمام مثل الخلايا السرطانية.
مثل المدينة، إذا كان قابلاً للتطبيق على الصغيرة فب عينات ويسمح بالاحتفاظ بسلامة غذائها13. ومع ذلك، بفضل طبيعة المواد المضافة إشارات الأسفار، إذا قابلة لتطبيق متعددة الأجسام الأولية وتسميات الفلورسنت. وهكذا، قد كمياً وتين فائدة نسبيا داخل خلايا معينة أو مقصورات الهاتف الخلوي (على سبيل المثال، نواة مقابل السيتوبلازم) المحددة باستخدام الأجسام المضادة الأخرى. إشارات الأسفار أيضا تتميز أكبر مجموعة ديناميكية13،14. التفوق، وإمكانية تكرار نتائج، والإمكانيات المتنوعة إذا طبقت على عينات فب قد أظهرت13،،من1415.
هذه الوثيقة يصف لنا استخدام الكمية إيمونوبلوتينج باستخدام خطوط الخلايا المحددة كمعيار الذهب للتأكد من طبيعة الكمية إذا اقترنت بتحليل الصور الحاسوب في تحديد الوفرة النسبية لبروتين فائدة في مقاطع نسيجية من عينات الأنسجة FFPE. وقد قمنا بتطبيق هذا الأسلوب بنجاح في اتباع نهج متعدد لقياس العلامات البيولوجية البروتينات في خزعة السريرية عينات16،،من1718.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:675px;" width="673">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">697</td>
			<td style="width:116px;">DSMZ</td>
			<td style="width:123px;">ACC 42</td>
			<td style="width:213px;">Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">JeKo-1</td>
			<td style="width:116px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">CRL-3006</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Jurkat</td>
			<td style="width:116px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">TIB-152</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">RCH-ACV</td>
			<td style="width:116px;">DSMZ</td>
			<td style="width:123px;">ACC 548</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Granta-519</td>
			<td style="width:116px;">DSMZ</td>
			<td style="width:123px;">ACC 342</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">REH</td>
			<td style="width:116px;">DSMZ</td>
			<td style="width:123px;">ACC 22</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Raji</td>
			<td style="width:116px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">CCL-86</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">HeLa</td>
			<td style="width:116px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">CCL-2</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Trypsin/EDTA solution</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">R001100</td>
			<td>For detaching adhesive cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:116px;">Wisent Inc.</td>
			<td style="width:123px;">81150</td>
			<td>To neutralize trypsin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Neutral Buffered Formalin</td>
			<td style="width:116px;">Protocol</td>
			<td style="width:123px;">245-684</td>
			<td>For fixing cell pellets</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">UltraPure low melting point agarose</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">15517-022</td>
			<td>For casting cell pellets</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">Mouse monoclonal anti-human Bcl-2 antibody, clone 124</td>
			<td style="width:116px;">Dako (Agilent)</td>
			<td style="width:123px;">cat#: M088729-2, RRID: 2064429</td>
			<td style="width:213px;">To detect Bcl-2 by immunoflourencence and immunoblot (lot#:&#160;00095786</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Ventana Discovery XT</td>
			<td style="width:116px;">Roche</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:213px;">For automation of immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-mouse)</td>
			<td style="width:116px;">Dako (Agilent)</td>
			<td style="width:123px;">K4000</td>
			<td style="width:213px;">For immunofluorescence signal amplification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-rabbit)</td>
			<td style="width:116px;">Dako (Agilent)</td>
			<td style="width:123px;">K4002</td>
			<td style="width:213px;">For immunofluorescence signal amplification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Cyanine 5 tyramide reagent</td>
			<td style="width:116px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:123px;">NEL745001KT</td>
			<td style="width:213px;">For immunofluorescence signal amplification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Aperio ImageScope</td>
			<td style="width:116px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:213px;">To view scanned slides</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">HALO image analysis software</td>
			<td style="width:116px;">Indica Labs</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:213px;">For quantification of immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">Protease inhibitors (Halt protease inhibitor cocktail, 100X)</td>
			<td style="width:116px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">1862209</td>
			<td>To add to RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:116px;">BioShop</td>
			<td style="width:123px;">EDT001</td>
			<td>For RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">NP-40</td>
			<td style="width:116px;">BDH Limited</td>
			<td style="width:123px;">56009</td>
			<td>For RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D6750</td>
			<td>For RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Glycerol</td>
			<td style="width:116px;">FisherBiotech</td>
			<td style="width:123px;">BP229</td>
			<td>For Laemlli buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:116px;">BioShop</td>
			<td style="width:123px;">BRO777</td>
			<td>For Laemlli buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:116px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">161-0611</td>
			<td>For Laemlli buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:116px;">BioShop</td>
			<td style="width:123px;">ALB001</td>
			<td>For immunoblot washes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Protein ladder (Precision Plus Protein Dual Color Standards)</td>
			<td style="width:116px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">161-0374</td>
			<td>For running protein gel</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Filter paper (Extra thick blot paper)</td>
			<td style="width:116px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">1703969</td>
			<td>For blotting transfer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Nitrocellulose membrane</td>
			<td style="width:116px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">162-0115</td>
			<td>For blotting transfer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Trans-blot SD semi-dry transfer cell</td>
			<td style="width:116px;">Bio-Rad</td>
			<td>1703940</td>
			<td>For semi-dry transfer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Skim milk powder (Nonfat dry milk)</td>
			<td style="width:116px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:123px;">9999S</td>
			<td>For blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Tween 20</td>
			<td style="width:116px;">BioShop</td>
			<td style="width:123px;">TWN510</td>
			<td>For wash buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">GAPDH rabbit monoclonal antibody</td>
			<td style="width:116px;">Epitomics</td>
			<td style="width:123px;">2251-1</td>
			<td style="width:213px;">Primary antibody of control protein (lot#: YE101901C)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) antibody</td>
			<td style="width:116px;">abcam</td>
			<td style="width:123px;">cat#: ab6789, RRID: AB_955439</td>
			<td style="width:213px;">Secondary antibody for immunoblot</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">Goat anti-rabbit IgG (HRP conjugated) antibody</td>
			<td style="width:116px;">abcam</td>
			<td style="width:123px;">cat#: ab6721, RRID: AB_955447</td>
			<td style="width:213px;">Secondary antibody for immunoblot (lot#: GR3192725-5)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Clarity Western ECL substrates</td>
			<td style="width:116px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">1705060</td>
			<td style="width:213px;">For immunoblot signal detection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Amersham Imager 600</td>
			<td style="width:116px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">29083461</td>
			<td>For immunoblot signal detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:116px;">Freeware, NIH</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td>For densitometry analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative immunoblotting of cell lines as a standard to validate immunofluorescence for quantifying biomarker proteins in routine tissue samples

التحديد الكمي للبروتينات ذات الاهتمام في عينات الأنسجة (FFPE) الفورمالين--الثابتة، جزءا لا يتجزأ من البارافين مهم في السريرية وبحوث التطبيقات. طريقة مثلى للقياس الكمي دقيق، ولديها مجموعة واسعة نطاق ديناميكي خطي ويحافظ على وحدة الهيكلية العينة للسماح للتعرف على أنواع الخلايا الفردية. الأساليب الحالية مثل إيمونوهيستوتشيميستري (المدينة) والطيف الكتلي immunoblotting كل تعجز عن الوفاء بهذه الشروط بسبب طبيعتها القاطع أو بحاجة إلى مجانسة العينة. كأسلوب بديل، نقترح استخدام الفلورة (إذا كان) وتحليل الصور لتحديد الوفرة النسبية لبروتين فائدة في الأنسجة FFPE. هنا نظهر أن هذا الأسلوب هو الأمثل بسهولة، وتؤدي دينامية واسعة نطاق، وهو خطيا قابلة للقياس بالمقارنة مع معيار الذهب immunoblotting الكمية. وعلاوة على ذلك، هذا الأسلوب يسمح بالحفاظ على السلامة الهيكلية للعينة، ويسمح للتمييز من مختلف أنواع الخلايا، التي قد تكون حاسمة في التطبيقات التشخيصية. وعموما، هذا هو وسيلة قوية للتحديد الكمي النسبي للبروتينات في عينات فب ويمكن تكييفها بسهولة لتناسب السريرية أو احتياجات البحوث.

وكان استخدام هذا البروتوكول لتأكيد قدرة IF لتحديد الكمية النسبية لمكافحة أبوبتوتيك البروتين Bcl-2 في خطوط الخلايا إلى كتل الأنسجة FFPE. ويمكن توضيح آليات النمطان Bcl-2 تحديد بشكل انتقائي في الخلايا السرطانية ويمكن أن تكون مفيدة في تشخيص المرضية وإبلاغ قرارات الإدارة السريرية<s...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Immunoblotting of Cell Lines as a Standard to Validate Immunofluorescence for Quantifying Biomarker Proteins in Routine Tissue Samples at JoVE.co

Quantitative Immunoblotting of Cell Lines as a Standard to Validate Immunofluorescence for Quantifying Biomarker Proteins in Routine Tissue Samples

إيمونوبلوتينج كمية من خطوط الخلايا كمعيار للتحقق من صحة الفلورة للتحديد الكمي للعلامات البيولوجية البروتينات في عينات الأنسجة الروتينية

يصف لنا استخدام الكمية إيمونوبلوتينج للتحقق من صحة الأنسجة الفلورة مقترنة بتحليل الصورة كوسيلة لتحديد كمية وتين فائدة في عينات الأنسجة (FFPE) الفورمالين--الثابتة، جزءا لا يتجزأ من البارافين. نتائجنا تثبت فائدة علم الأنسجة الفلورة للتحقق من الكمية النسبية للعلامات البيولوجية البروتينات في عينات خزعة الروتينية.

Quantification of proteins of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples is important in clinical and research applications. An ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أمراض السرطان ، من خلال قياس بروتينات المؤشرات الحيوية من مواد الخزعة المعالجة بشكل روتيني. المزايا الرئيسية لهذه التقنية فيما يتعلق بالكيمياء المناعية التقليدية، هي أنها موضوعية، ولها مجموعة ديناميكية واسعة، وتسمح لتحديد كمي للبروتينات في أنواع محددة من الخلايا. وجود أو غياب بعض ما يسمى بروتينات العلامات الحيوية، أو على وجه الخصوص، وفرة نسبية من تلك البروتينات في عينات خزعة السرطان يمكن أن تكون مفيدة جدا في إجراء تشخيص مرضي محدد لأنواع محددة من السرطانات.ولكن يمكن أن تكون مفيدة أيضا في التنبؤ بالاستجابة لعلاج السرطان، لذلك هذا هو السبب في أن هذه التقنية هي ذات الصلة على حد سواء لتشخيص وعلاج المرضى الذين يعانون من السرطان. هذا البروتوكول هو أساسا حول كيفية استخدام كم البروتين في خطوط الخلايا الخالدة للتحقق من الطبيعة الكمية للمناعة القائمة على الفحص. ولكن من المهم ملاحظة أن الفلورورات المناعية يمكن دمجها بسهولة في نهج متعدد الحساسية، وتطبيقها على عينات الخزعة الأولية.وسيساعد في هذا الإجراء ويبرهن على ذلك لي بودرو، وهو فني، و شكيل فيرك، مدير العمليات. كلاهما من مختبر الملكة لعلم الأمراض الجزيئية للبدء، الطرد المركزي الخلايا التي تم حصادها سابقا في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر في 225 Gs لمدة خمس دقائق.Decant الماثرة ، وإعادة فرض بيليه الخلية في 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني. ثم، الطرد المركزي الخلايا التي أعيد تعليقها في 225 Gs لمدة خمس دقائق. تعليق بيليه الخلية مع 10 ملليلتر من 10٪ NBF.ثم احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة على الروك في 24 RPMs بين عشية وضحاها. بعد إصلاح الخلايا، الطرد المركزي الخلايا في 225 Gs لمدة خمس دقائق. ثم إزالة فائقة وإعادة تعليق الخلايا في 500 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني.نقل الخلايا إلى أنبوب microcentuge 1.5 ملليلتر، و بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي. ثم، pirate المابير. إضافة ما يقرب من 500 ميكرولترات من 1٪ agarose حل لكل أنبوب تحتوي على الخلايا.ثم، ماصة الخليط صعودا وهبوطا لخلط. بعد أن يصلب حل الخلايا agarose، إضافة ملليلتر واحد من 10٪ NBF إلى الأنابيب. لاحقاً، إزالة NBF من العينات.استخدم شفرة حلاقة لإزالة قابس الخلية، ووضع المكونات في كاسيت من الأنسجة البلاستيكية. عينات معالجة بين عشية وضحاها مع معالج الأنسجة الآلي. ثم، تضمين العينات في الشمع البارافين، وذلك باستخدام أساليب علم الأنسجة القياسية.باستخدام أداة مصفّدة الأنسجة، حصاد 6 مليمترات مكررة من كتلة البارافين، وإدراجها في كتلة البارافين فارغة. بعد ذلك، استخدم ميكروتوم لإعداد قسمين النسيجي من خط الخلية المنشأة حديثا، TMA. ثم قم بتحميل المقاطع على شريحة الأنسجة، وفك زحزحها.أولاً، قم بتحميل منزلتي خط الخلية TMA في نظام تلوين آلي. وصمة واحدة جانب مع التخفيف الأمثل للجسم المضاد الأولية، وترك الآخر كشريحة تحكم سلبية. على كلا الشرائح، قم بتطبيق علامة مضادة نووية، والأجسام المضادة الثانوية.بعد عملية تلطيخ، إضافة الكواشف التضخيم إشارة tyramide. بعد ذلك، قم بمسح الشرائح المثبطة للمناعة باستخدام الإثارة المناسبة والأطوال الموجية للكشف عن الفلوروبهورات التي تم استخدامها. استخدام برنامج تحليل الصور لتحديد المقصورة الخلوية من الفائدة، سواء النواة أو السيتوبلازم، وقياس شدة الفلورس متوسط، أو MFI، لكل خط.لتحديد أي خط الخلية لديه أكبر وفرة من البروتين الهدف، aliquot إعدادها الثمينة خلية lysate في أنابيب microcentrifuge. ثم إضافة 2.5 ميكرولترات من 6x laemly العازلة، ويكفي RIPA تحلل العازلة لتحقيق حجم الكلية إلى 15 ميكرولترات. بعد ذلك، قم بتحميل هلام صفحة SDS، مع سلم البروتين، والعينات المعدة مسبقا.بعد ذلك، تحميل عازلة laemly في الآبار الفارغة. تشغيل هلام حتى تصل الصبغة الزرقاء إلى الجزء السفلي من لوحة. بعد إجراء نقل البروتين شبه الجاف، استخدم شفرة حلاقة لقطع الغشاء أفقيًا لفصل البروتين الذي يهمك عن بروتين التحكم.تنفيذ الاحتضان الحجب والأجسام المضادة وفقا لتعليمات الشركات المصنعة. ثم ضع شرائط الغشاء في كيس بلاستيكي واضح. استخدام ماصة P1000 لتغطية الأغشية مع خليط ECL.ثم ختم الكيس، واحتضان الأغشية في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة دقيقة إلى دقيقتين. بعد ذلك، ضع الكيس البلاستيكي الذي يحتوي على الأغشية في منصة تصوير رقمية. استخدام chemiluminescence وكشف علامة colorimetric لالتقاط مختلف التعرض للغشاء.باستخدام برنامج تحليل الصور، أو الملاحظة البصرية، تحديد خط الخلية يعبر عن البروتين الأكثر استهدافا. بعد مناعة تخفيف تسلسلي من هذا الخط الخلية، وفتح صور التعرض باستخدام برنامج تحليل الصور. استخدم أداة التحديدات المستطيلة لتحديد المسار الأول من الجل.ثم انتقل إلى تحليل، المواد الهلامية، وحدد المسار الأول. كرر هذه العملية عن طريق نقل أداة التحديدات المستطيلة إلى الممر التالي ، وانتقل إلى التحليل ، والمواد الهلامية ، وحدد المسار التالي. بعد ذلك ، انتقل إلى تحليل ، والمواد الهلامية ، والممرات مؤامرة.استخدام أداة خط مستقيم لرسم خطوط عبر أسس كل قمة ، لإزالة الضوضاء الخلفية. ثم استخدم أداة العصا لتحديد كل قمة، والحصول على شدة النطاق لكل ذروة من نافذة النتائج. إنشاء مبعثر من كثافة الفرقة مقابل كمية من البروتين الكلي محملة لكل الأجسام المضادة الأولية باستخدام الناتج قياس الكثافة.ثم استخدم خطًا من أفضل الملاءمة والملاحظة البصرية لتحديد موقع النطاق الديناميكي الخطي لكل جسم مضاد. حدد تركيز البروتين الذي ينتج كثافة الفرقة داخل النطاق الخطي، وأداء مناعي من جميع lysates خط الخلية مع أن تركيز البروتين، كما هو موضح سابقا. بعد ذلك، قم بإجراء قياس الكثافة على الفحوصات الرقمية، واختيار عمليات التعرض التي تنتج إشارات داخل النطاقات الخطية التي تم تحديدها مسبقًا لكل جسم مضاد.بعد ذلك، حساب نسبة كثافة الفرقة البروتينية المستهدفة إلى كثافة نطاق التحكم في التحميل لكل خط خلية. وأخيراً، استخدم البرامج الإحصائية لإجراء اختبار ارتباط Pearson بين القيم التي تم الحصول عليها من تحليل الصورة لتلطيخ IF، وتلك التي تم الحصول عليها من التلطخ المناعي. وقد استخدم هذا البروتوكول لتأكيد قدرة IF لتحديد الكمية النسبية للبروتين المضاد للبروتين المضاد للبروتين Bcl-2.تم اختبار تم تخفيف متفاوتة من الأجسام المضادة الأولية على أنسجة اللوزتين البشرية مع stainer المناعة. لهذه التجربة، تم تحديد تخفيف واحد إلى 50 ليكون التخفيف الأمثل الذي أسفر عن إشارة قوية مع القليل من الضوضاء الخلفية. وقد استخدم هذا التخفيف لطخة TMA خط الخلية عن طريق المناعةfluorescence، واستخدمت تحليل الصور لتحديد كمية إشارة Cy5 السيتوبلازمي المنسوبة إلى Bcl-2.استنادا إلى منطّط لجميع خطوط الخلايا المختبرة، كان غرانتا-519 أكبر وفرة من Bcl-2. ثم تم استخدام مناعي من التخفيف المسلسل من غرانتا-519 lysate للعثور على مجموعة ديناميكية خطية من Bcl-2، والسيطرة على البروتين GAPDH. تراوحت المدى الديناميكي لـ Bcl-2 في هذا الفحص من كثافة النطاقات من 0 تقريبًا ، إلى 7500 وحدة.تراوحت مجموعة ديناميكية لـ GAPDH من 3000 إلى 6500 وحدة. وتكرر الناعَز مع التعرض داخل ذلك النطاق الخطي. وتم حساب نسبة Bcl-2 إلى GAPDH لكل خط خلية.أظهر اختبار ارتباط Pearson أن نسب الكثافة من مناعة المناعة كانت مرتبطة بقوة وإيجابية بقراءات الكثافة من IF الكمي. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن تكشف عن الغشاء النهائي لنقاط زمنية متعددة، من أجل العثور على التعرض الأمثل حيث جميع العصابات هي ضمن النطاقات الخطية الخاصة بها. بعد التحقق من الطبيعة الكمية لبروتوكول IF ، يمكن تعديله لـ multix IF ، في عينات الأنسجة المعالجة بشكل روتيني من أجل الإجابة على الأسئلة السريرية مثل حيث يتم التعبير عن البروتين المستهدف.

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

أكتين المشارك الترسيب الفحص ، وبالنسبة للتحليل البروتين ملزمة لF - أكتين

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

الكمية مقارنة رابطة الدول المستقلة التنظيم العنصر (لجنة المساواة العرقية) في الأنشطة المعدلة وراثيا ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

تحليل كمي لياقة سير العمل

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

باستخدام SecM تسلسل توقيف كأداة لعزل البروتينية منضم ريبوسوم

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

التنميط الفردية الخلايا الجذعية الجنينية البشرية من خلال الكمي RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

الكمية المناعي الفحص لقياس التفاوت في مستويات البروتين في Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

طريقة لقياس آخر من Deubiquitinating الانزيمات في خطوط الخلايا وعينات الأنسجة

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

توظيف الرقمية القطرة PCR لكشف الطفرات BRAF V600E في البارافين جزءا لا يتجزأ من خطوط الخلايا المعيار المرجعي الفورمالين الثابتة

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

البروتينات التحليل المناعي من الداخلية والخارجية السنترومير-الحيز الحركي

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

الفجوة صلي بين الخلايا الاتصالات: العلامات البيولوجية الوظيفية لتقييم التأثيرات السلبية للالسميات والسموم، والصحة فوائد المنتجات الطبيعية

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...