Name: quantitative immunoblotting of cell lines as a standard to validate immunofluorescence for quantifying biomarker proteins in routine tissue samples
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Immunoblotting of Cell Lines as a Standard to Validate Immunofluorescence for Quantifying Biomarker Proteins in Routine Tissue Samples at JoVE.co

Diese Arbeit wurde teilweise durch Fredrick Banting und Charles Best Kanada Graduate Stipendium (Uhr) finanziert.

Zulassung mit primären menschlichen Gewebeproben aus der Gesundheitswissenschaften und angegliedert Lehrkrankenhäuser Research Ethics Board (HSREB) an der Queens University ermittelt.
1. Aufbau einer Zelllinie Tissue Microarray (TMA)
<ol><li>Ernten Sie und waschen Sie Zellen. Hinweis: Dieses Protokoll wurde auf verschiedenen etablierten verewigt Zell-Linien (z. B. HeLa, Jurkat, RCH-ACV) getestet.<ol>
<li>Ernten Sie für adhärente Zellen ca. 1,3 x 107 Zellen sobald s...

<ol>
	<li>Khoury, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+Immunohistochemical+Assays+for+Integral+Biomarkers+in+the+NCI-MATCH+EAY131+Clinical+Trial.">Validation of Immunohistochemical Assays for Integral Biomarkers in the NCI-MATCH EAY131 Clinical Trial.</a> Clinical Cancer Research. 24 (3), 521-531 (2018).</li><li>Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G. L., da Silva Pinhal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+as+an+important+tool+in+biomarkers+detection+and+clinical+practice.">Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice.</a> Biomarker insights. 5, 9-20 (2010).</li><li>Seidal, T., Balaton, A. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blot:+technique,+theory,+and+trouble+shooting.">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> North American journal of medical sciences. 4 (9), 429-434 (2012).</li><li>Wiedemann, M., Lee, S. J., da Silva, R. C., Visweswaraiah, J., Soppert, J., Sattlegger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+semi-dry+electrophoretic+transfer+of+a+wide+range+of+differently+sized+proteins+for+immunoblotting.">Simultaneous semi-dry electrophoretic transfer of a wide range of differently sized proteins for immunoblotting.</a> Nature Protocol Exchange. , (2013).</li><li>Delbridge, A. R. D., Grabow, S., Strasser, A., Vaux, D. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+multiplex+immunofluorescence+panels+using+multispectral+microscopy+for+immune-profiling+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+human+tumor+tissues.">Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).</li><li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Guide+to+Modern+Quantitative+Fluorescent+Western+Blotting+with+Troubleshooting+Strategies.">A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunofluorescence+labelling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+tissue.">Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BMC Cell Biology. 9 (1), 13 (2008).</li></ol>

Wir haben eine Methode beschrieben, dass der quantitativen Immunoblotting (IB) nutzt, um das Dienstprogramm Immunfluoreszenz (IF) zeigen für die Ermittlung der relativen Fülle an ein Zielprotein in FFPE Gewebeproben. Aktuelle Protein Quantifizierungsmethoden beschränken sich naturgemäß kategorische, z. B. chromogenen IHC2,3, oder durch die Notwendigkeit, Proben, Untersuchung der Beispielbeständen Struktur und Zelle zu verhindern, wie z. B. Homogenisieren mi...

Die Notwendigkeit zur Quantifizierung von Proteinen in Formalin fixiert, Paraffin-eingebetteten (FFPE) Biopsie Gewebeproben existiert in vielen klinischen Bereichen. Quantifizierung der Biomarker Proteine in Routine Gewebeproben wird beispielsweise zur aufzuklären Prognose und Behandlung für Krebs Patienten1zu informieren. Jedoch aktuelle Methoden sind in der Regel subjektiv und Validierung fehlt.
Immunhistochemie (IHC) dient routinemäßig in der Pathologie-Laboratorien und hängt im Allgemeinen von einer primären Antikörper gegen das Zielprotein und ein mit einem enzymatischen Label wie Meerrettich Peroxidase2konjugierten Sekundärantikörper. Konventionelle IHC ist empfindlich, kann Gebrauch von Minute Proben und bewahrt die morphologische Integrität von Gewebeproben, die dadurch bei schönem Bewertung der Proteinexpression in seinem entsprechenden histologischen Kontext. Jedoch weil das chromogene vom IHC erzeugte Signal subtraktiven ist, leidet unter einem relativ engen Dynamikbereich und bietet begrenzten Potential für multiplexing2,3,4. Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung Massenspektrometrie imaging (MALDI-MSI) bleibt morphologischen Integrität. Allerdings diese entwickelnden Technologie ist verbunden mit einer bescheidenen morphologische Auflösung und erfordert erhebliche Kalibrierung und Normalisierung, beeinträchtigen seine Machbarkeit für klinische Routineanwendung5,6,7. Alternative Verfahren zur Quantifizierung von Protein in Gewebeproben gehören Immunoblotting8, Massenspektrometrie9,10,11und Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA)12, jedes Das beginnt mit einer homogenisierten Probe Gewebe lysate. Primäre Gewebeproben sind heterogen, weil sie eine Vielzahl von Zelltypen enthalten. Daher erlauben Techniken, die zur Folge haben, Homogenisieren der Proben keine Quantifizierung eines Proteins in einer bestimmten Zelle Bevölkerung von Interesse, wie Krebszellen.
Wie IHC, wenn gilt für kleine FFPE Proben und ermöglicht die Beibehaltung der histologischen Integrität13. Aber dank dem Additiven Charakter der Fluoreszenz Signale, wenn für die Anwendung von mehreren primären Antikörper und Fluoreszenzmarkierungen zugänglich ist. So kann ein Protein des Interesses relativ innerhalb bestimmter Zellen oder zellulären Kompartimenten (z. B. Zellkern und Zytoplasma) mit anderen Antikörpern definiert quantifiziert werden. Fluoreszenz-Signale haben auch den Vorteil eines größeren Dynamikbereich13,14. Die Überlegenheit, Reproduzierbarkeit und multiplexing Potential wurde wenn auf FFPE-Proben angewendet demonstriert13,14,15.
Hier beschreiben wir die Verwendung von quantitativen Immunoblotting mit etablierten Zelllinien als Goldstandard quantitative Artder festzustellen, ob in Verbindung mit computergestützten Bildanalyse bei der Bestimmung der relativen Fülle eines Proteins des Interesses an histologischen Abschnitte aus FFPE Gewebeproben. Wir haben diese Methode erfolgreich in einem Multiplex-Ansatz zur Quantifizierung der Biomarker Proteine in klinischen Biopsie Proben16,17,18angewandt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:675px;" width="673">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">697</td>
			<td style="width:116px;">DSMZ</td>
			<td style="width:123px;">ACC 42</td>
			<td style="width:213px;">Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">JeKo-1</td>
			<td style="width:116px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">CRL-3006</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Jurkat</td>
			<td style="width:116px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">TIB-152</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">RCH-ACV</td>
			<td style="width:116px;">DSMZ</td>
			<td style="width:123px;">ACC 548</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Granta-519</td>
			<td style="width:116px;">DSMZ</td>
			<td style="width:123px;">ACC 342</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">REH</td>
			<td style="width:116px;">DSMZ</td>
			<td style="width:123px;">ACC 22</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Raji</td>
			<td style="width:116px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">CCL-86</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">HeLa</td>
			<td style="width:116px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">CCL-2</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Trypsin/EDTA solution</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">R001100</td>
			<td>For detaching adhesive cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:116px;">Wisent Inc.</td>
			<td style="width:123px;">81150</td>
			<td>To neutralize trypsin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Neutral Buffered Formalin</td>
			<td style="width:116px;">Protocol</td>
			<td style="width:123px;">245-684</td>
			<td>For fixing cell pellets</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">UltraPure low melting point agarose</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">15517-022</td>
			<td>For casting cell pellets</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">Mouse monoclonal anti-human Bcl-2 antibody, clone 124</td>
			<td style="width:116px;">Dako (Agilent)</td>
			<td style="width:123px;">cat#: M088729-2, RRID: 2064429</td>
			<td style="width:213px;">To detect Bcl-2 by immunoflourencence and immunoblot (lot#:&#160;00095786</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Ventana Discovery XT</td>
			<td style="width:116px;">Roche</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:213px;">For automation of immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-mouse)</td>
			<td style="width:116px;">Dako (Agilent)</td>
			<td style="width:123px;">K4000</td>
			<td style="width:213px;">For immunofluorescence signal amplification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-rabbit)</td>
			<td style="width:116px;">Dako (Agilent)</td>
			<td style="width:123px;">K4002</td>
			<td style="width:213px;">For immunofluorescence signal amplification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Cyanine 5 tyramide reagent</td>
			<td style="width:116px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:123px;">NEL745001KT</td>
			<td style="width:213px;">For immunofluorescence signal amplification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Aperio ImageScope</td>
			<td style="width:116px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:213px;">To view scanned slides</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">HALO image analysis software</td>
			<td style="width:116px;">Indica Labs</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:213px;">For quantification of immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">Protease inhibitors (Halt protease inhibitor cocktail, 100X)</td>
			<td style="width:116px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">1862209</td>
			<td>To add to RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:116px;">BioShop</td>
			<td style="width:123px;">EDT001</td>
			<td>For RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">NP-40</td>
			<td style="width:116px;">BDH Limited</td>
			<td style="width:123px;">56009</td>
			<td>For RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D6750</td>
			<td>For RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Glycerol</td>
			<td style="width:116px;">FisherBiotech</td>
			<td style="width:123px;">BP229</td>
			<td>For Laemlli buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:116px;">BioShop</td>
			<td style="width:123px;">BRO777</td>
			<td>For Laemlli buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:116px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">161-0611</td>
			<td>For Laemlli buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:116px;">BioShop</td>
			<td style="width:123px;">ALB001</td>
			<td>For immunoblot washes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Protein ladder (Precision Plus Protein Dual Color Standards)</td>
			<td style="width:116px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">161-0374</td>
			<td>For running protein gel</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Filter paper (Extra thick blot paper)</td>
			<td style="width:116px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">1703969</td>
			<td>For blotting transfer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Nitrocellulose membrane</td>
			<td style="width:116px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">162-0115</td>
			<td>For blotting transfer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Trans-blot SD semi-dry transfer cell</td>
			<td style="width:116px;">Bio-Rad</td>
			<td>1703940</td>
			<td>For semi-dry transfer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Skim milk powder (Nonfat dry milk)</td>
			<td style="width:116px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:123px;">9999S</td>
			<td>For blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Tween 20</td>
			<td style="width:116px;">BioShop</td>
			<td style="width:123px;">TWN510</td>
			<td>For wash buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">GAPDH rabbit monoclonal antibody</td>
			<td style="width:116px;">Epitomics</td>
			<td style="width:123px;">2251-1</td>
			<td style="width:213px;">Primary antibody of control protein (lot#: YE101901C)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) antibody</td>
			<td style="width:116px;">abcam</td>
			<td style="width:123px;">cat#: ab6789, RRID: AB_955439</td>
			<td style="width:213px;">Secondary antibody for immunoblot</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">Goat anti-rabbit IgG (HRP conjugated) antibody</td>
			<td style="width:116px;">abcam</td>
			<td style="width:123px;">cat#: ab6721, RRID: AB_955447</td>
			<td style="width:213px;">Secondary antibody for immunoblot (lot#: GR3192725-5)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Clarity Western ECL substrates</td>
			<td style="width:116px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">1705060</td>
			<td style="width:213px;">For immunoblot signal detection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Amersham Imager 600</td>
			<td style="width:116px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">29083461</td>
			<td>For immunoblot signal detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:116px;">Freeware, NIH</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td>For densitometry analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative immunoblotting of cell lines as a standard to validate immunofluorescence for quantifying biomarker proteins in routine tissue samples

Quantifizierung der Proteine des Interesses in Formalin fixiert, Paraffin-eingebetteten (FFPE) Gewebeproben ist wichtig in der klinischen und Forschung Anwendungen. Eine optimale Methode zur Quantifizierung stimmt, hat einen breiten linearen Dynamikbereich und unterhält die strukturelle Integrität der Probe zur Identifizierung der einzelnen Zelltypen zu ermöglichen. Aktuelle Methoden wie Immunhistochemie (IHC), Massenspektrometrie und Immunoblotting jeweils nicht erfüllen diese Bestimmungen aufgrund ihrer kategorischen oder brauchen, um die Probe zu homogenisieren. Als eine alternative Methode schlagen wir die Verwendung von Immunfluoreszenz (IF) und Bildanalyse, die relative Häufigkeit eines Proteins des Interesses an FFPE Gewebe zu bestimmen. Hier zeigen wir, dass diese Methode ist leicht optimiert, einen breiten dynamischen Bereich liefert und im Vergleich zu der Goldstandard der quantitativen Immunoblotting linear quantifizierbar ist. Darüber hinaus ist diese Methode ermöglicht die Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität der Probe und ermöglicht die Unterscheidung der verschiedenen Zelltypen, die im diagnostischen Anwendungen entscheidend sein können. Insgesamt, dies ist eine robuste Methode für die relative Quantifizierung von Proteinen in FFPE-Proben und kann leicht an klinischen passen oder Forschung muss angepasst werden.

Dieses Protokoll wurde verwendet, um die Fähigkeit der IF, die relative Menge des Anti-apoptotischen Proteins Bcl-2 in Zelllinien hergestellt in FFPE Gewebe Blöcke bestimmen zu bestätigen. Bcl-2 in Krebszellen selektiv quantifizieren kann onkogene Mechanismen aufzuklären und kann nützlich sein, in der pathologischen Diagnostik und klinisches Management Entscheidungen24zu informieren. Genauer gesagt, Bcl-2 spielt eine Rolle in richtige zahlreiche Entwicklung un...

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Quantitative Immunoblotting of Cell Lines as a Standard to Validate Immunofluorescence for Quantifying Biomarker Proteins in Routine Tissue Samples

Quantitative Immunoblotting Zelllinien als Standard, Immunfluoreszenz zur Quantifizierung der Biomarker Proteine in Routine Gewebeproben zu validieren

Wir beschreiben die Verwendung von quantitativen Immunoblotting, Immunfluoreszenz Histologie gepaart mit Bildanalyse als Mittel zur Quantifizierung eines Proteins des Interesses in Formalin fixiert, Paraffin-eingebetteten (FFPE) Gewebeproben zu validieren. Unsere Ergebnisse zeigen den Nutzen der Immunfluoreszenz Histologie für die Ermittlung der relativen Menge Biomarker Proteine im Routine-Biopsie Proben.

Quantification of proteins of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples is important in clinical and research applications. An ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der Krebspathologie zu beantworten, indem Biomarkerproteine aus routinemäßig verarbeitetem Biopsiematerial quantifiziert werden. Die Hauptvorteile dieser Technik in Bezug auf die konventionelle Immunhistochemie sind, dass sie objektiv ist, einen breiten Dynamikbereich hat und die Quantifizierung von Proteinen in bestimmten Zelltypen ermöglicht. Das Vorhandensein oder Fehlen bestimmter so genannter Biomarker-Proteine, insbesondere der relativen Häufigkeit dieser Proteine in Krebsbiopsieproben, kann sehr nützlich sein, um eine spezifische pathologische Diagnose bestimmter Krebsarten zu erstellen.Aber es kann auch nützlich sein, um die Reaktion auf Krebsbehandlungen vorherzusagen, deshalb ist diese Technik sowohl für die Diagnose als auch für die Behandlung von Krebspatienten relevant. In diesem Protokoll geht es vor allem darum, wie die Proteinquantifizierung in verewigten Zelllinien verwendet werden kann, um die quantitative Natur des immunfluoreszenzbasierten Assays zu validieren. Aber es ist wichtig zu beachten, dass Immunfluoreszenz leicht in einen Multiplex-Ansatz integriert werden kann, und auf primäre Biopsieproben angewendet werden.Unterstützt und demonstriert dieses Verfahren lee Boudreau, ein Techniker, und Shakeel Virk, der Direktor der Operationen. Beide vom Queen es Laboratory for Molecular Pathology. Zunächst zentrifugieren Sie die zuvor geernteten Zellen in einem 50 Milliliter konischen Rohr bei 225 Gs für fünf Minuten.Dekantieren Sie den Überstand, und setzen Sie das Zellpellet in 10 Milliliter PBS wieder auf. Zentrifugieren Sie dann die resuspendierten Zellen bei 225 Gs für fünf Minuten. Setzen Sie das Zellpellet mit 10 Millilitern von 10%NBF aus.Dann inkubieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur auf einer Wippe bei 24 RPMs über Nacht. Nach der Fixierung der Zellen zentrieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 225 Gs. Entfernen Sie dann den Überstand und setzen Sie die Zellen in 500 Mikroliter PBS wieder aus.Übertragen Sie die Zellen in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr und pellet die Zellen über Zentrifugation. Dann aspirieren Sie den Überstand. Fügen Sie etwa 500 Mikroliter 1%Agarose-Lösung zu jedem Rohr enthaltende Zellen hinzu.Dann pipette die Mischung nach oben und unten zu mischen. Nachdem die Agarose-Zelllösung aushärtet, fügen Sie den Röhren einen Milliliter 10% NBF hinzu. Entfernen Sie später die NBF aus den Proben.Verwenden Sie eine Rasierklinge, um den Zellstecker zu entfernen, und legen Sie den Stecker in eine Kunststoff-Gewebekassette. Verarbeiten Sie Proben über Nacht mit einem automatisierten Gewebeprozessor. Dann betten Sie die Proben in Paraffinwachs ein, mit Standard-Histologie-Methoden.Mit einem Tissue-Arrayer-Instrument duplizieren Sie duplizierte 6-Millimeter-Kerne aus dem Paraffinblock und fügen Sie sie in einen leeren Paraffinblock ein. Verwenden Sie anschließend ein Mikrotom, um zwei histologische Abschnitte der neu erstellten Zelllinie TMA vorzubereiten. Montieren Sie dann die Abschnitte auf einer Histologiefolie, und deparaffinisieren Sie sie.Laden Sie zunächst die beiden Dias der Zelllinie TMA in ein automatisiertes Färbesystem. Färben Sie eine Seite mit der optimalen primären Antikörperverdünnung, so dass die andere als negativer Kontrollschlitten. Auf beiden Dias einen nuklearen Gegenfleck und einen sekundären Antikörper auftragen.Fügen Sie nach dem Färbevorgang die Tyramidsignalverstärkungsreagenzien hinzu. Danach scannen Sie die immunbefleckten Dias mit den entsprechenden Anregungs- und Detektionswellenlängen für die verwendeten Fluorophore. Verwenden Sie Bildanalysesoftware, um das zelluläre Fach von Interesse zu identifizieren, ob Kern oder Zytoplasma, und quantifizieren Sie die mittlere Fluoreszenzintensität oder MFI für jede Linie.Um zu bestimmen, welche Zelllinie die größte Fülle des Zielproteins hat, wird aliquot kostbar zubereitete Zelllysat in Mikrozentrifugenröhren lysiert. Fügen Sie dann 2,5 Mikroliter 6x Laemly Buffer und genügend RIPA-Lysepuffer hinzu, um das Gesamtvolumen auf 15 Mikroliter zu bringen. Als nächstes laden Sie ein SDS-Seitengel mit einer Proteinleiter und den zuvor vorbereiteten Proben.Danach laemly Puffer in die leeren Brunnen. Führen Sie das Gel, bis der blaue Farbstoff den Boden der Platte erreicht. Nach einem halbtrockenen Proteintransfer verwenden Sie eine Rasierklinge, um die Membran horizontal zu schneiden, um das von Interesse bestosliche Protein vom Kontrollprotein zu trennen.Führen Sie Blockierungs- und Antikörperinkubationen gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. Dann legen Sie die Membranstreifen in eine durchsichtigen Plastiktüte. Verwenden Sie eine P1000 Pipette, um die Membranen mit ECL-Mischung zu bedecken.Dann versiegeln Sie den Beutel und bebrüten die Membranen bei Raumtemperatur im Dunkeln für ein bis zwei Minuten. Legen Sie als Nächstes die Plastiktüte mit den Membranen in eine digitale Bildgebungsplattform. Verwenden Sie Chemilumineszenz und kolorimetrische Markererkennung, um verschiedene Belichtungen der Membran zu erfassen.Bestimmen Sie mithilfe von Bildanalysesoftware oder visueller Beobachtung, welche Zelllinie das zielreichste Protein ausdrückt. Nachdem Sie eine serielle Verdünnung dieser Zelllinie immunisiert haben, öffnen Sie die Belichtungsbilder mit der Bildanalysesoftware. Verwenden Sie das rechteckige Auswahlwerkzeug, um die erste Spur des Gels auszuwählen.Gehen Sie dann zu analysieren, Gele, und wählen Sie die erste Spur. Wiederholen Sie diesen Vorgang, indem Sie das werkzeug für die rechteckige Auswahl auf die nächste Spur verschieben, und gehen Sie zu analysieren, Gele, und wählen Sie die nächste Spur aus. Gehen Sie als Nächstes zu analysieren, Gele und Plotspuren.Verwenden Sie das Werkzeug gerade, um Linien über die Basen jeder Spitze zu zeichnen, um das Hintergrundrauschen zu entfernen. Verwenden Sie dann das Werkzeug Zauberstab, um jeden Peak auszuwählen und die Bandintensität jedes Peaks aus dem Ergebnisfenster abzusuchen. Erstellen Sie ein Streudiagramm der Bandintensität im Vergleich zur Gesamtproteinmenge, die für jeden primären Antikörper geladen wird, wobei die Densitometrie-Ausgabe verwendet wird.Verwenden Sie dann eine Linie der besten Anpassung und visuellen Beobachtung, um die Position des linearen Dynamikbereichs jedes Antikörpers zu bestimmen. Wählen Sie eine Proteinkonzentration aus, die eine Bandintensität innerhalb des linearen Bereichs ergibt, und führen Sie einen Immunoblot aller Zelllinienlysate mit dieser Proteinkonzentration durch, wie zuvor gezeigt. Führen Sie als Nächstes die Densitometrie für die digitalen Scans durch und wählen Sie Belichtungen aus, die Signale innerhalb der zuvor identifizierten linearen Bereiche für jeden Antikörper liefern.Danach berechnen Sie das Verhältnis der Zielproteinbandintensität zur Ladekontrollbandintensität für jede Zelllinie. Schließlich verwenden Sie statistische Software, um einen Pearson-Korrelationstest zwischen den Werten, die aus der Bildanalyse der IF-Färbung erhalten wurden, und denen, die durch Immunoblotting erhalten, durchzuführen. Dieses Protokoll wurde verwendet, um die Fähigkeit von IF zu bestätigen, die relative Menge des anti-apoptotischen Proteins Bcl-2 zu bestimmen.Unterschiedliche Verdünnungen des primären Antikörpers wurden mit einem immunhistologischen Färbemittel am menschlichen Mandelgewebe getestet. Für dieses Experiment wurde eine Verdünnung von eins bis 50 als die optimale Verdünnung bestimmt, die ein starkes Signal mit wenig Hintergrundrauschen ergab. Diese Verdünnung wurde verwendet, um die Zelllinie TMA durch Immunfluoreszenz zu färben, und Bildanalyse wurde verwendet, um das zytoplasmatische Cy5-Signal zu quantifizieren, das Bcl-2 zugeschrieben wird.Basierend auf dem Immunoblot für alle getesteten Zelllinien hatte Granta-519 die größte Fülle von Bcl-2. Ein Immunoblot der seriellen Verdünnung von Granta-519-Lysat wurde dann verwendet, um den linearen Dynamikbereich von Bcl-2 zu finden und das Protein GAPDH zu kontrollieren. Der Dynamikbereich für Bcl-2 reichte in diesem Test von einer Bandintensität von fast 0 bis 7500 Einheiten.Der Dynamikbereich für GAPDH reichte von 3000 bis 6500 Einheiten. Der Immunoblot wurde mit Expositionen innerhalb dieses linearen Bereichs wiederholt. Und das Verhältnis von Bcl-2 zu GAPDH wurde für jede Zelllinie berechnet.Ein Pearson-Korrelationstest zeigte, dass die Intensitätsverhältnisse von Immunoblotting stark und positiv mit den Intensitätswerten aus quantitativem IF korrelierten. Beim Versuch dieses Verfahrens, ist es wichtig, daran zu denken, die endgültige Membran für mehrere Zeitpunkte zu belichten, Um die optimale Belichtung zu finden, wo alle Bänder innerhalb ihrer jeweiligen linearen Bereiche sind. Nach der Validierung des quantitativen Charakters des IF-Protokolls kann es für Multiplex IF in routinemäßig verarbeiteten Gewebeproben modifiziert werden, um klinische Fragen zu beantworten, z. B. wo ein Zielprotein exprimiert wird.

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Aktin Co-Sedimentation Assay; für die Analyse von Protein-Bindung an F-Aktin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Forschung

Biologie

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Quantitativen Vergleich der Cis-Regulatory Element (CRE) Aktivitäten in transgenen Drosophila melanogaster</em

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

A Quantitative Analysis Fitness-Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Mit SECM Arrest Sequenz als Werkzeug zum Ribosom gebunden Polypeptide isolieren

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Profiling Individuelle humanen embryonalen Stammzellen durch quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Quantitative Immunfluoreszenz-Assay, um die Variation der Protein-Ebene an Zentrosomen Messen

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

Verfahren zur Messung der Aktivität von Deubiquitinierungsenzyme in Zelllinien und Gewebeproben

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

Verwendung digitaler Droplet PCR zu BRAF V600E Mutationen in Formalin-fixierte Paraffin Reference Standard-Zelllinien Detect

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

Immunofluoreszenz-Analyse von endogener und exogener Zentromer-Proteine ​​kinetochore

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

Interzelluläre Gap Junction-Kommunikation: Eine funktionelle Biomarker zur Beurteilung Unerwünschte Auswirkungen von Schadstoffen und Toxinen und gesundheitlichen Vorteile von Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...