Name: quantitative immunoblotting of cell lines as a standard to validate immunofluorescence for quantifying biomarker proteins in routine tissue samples
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Immunoblotting of Cell Lines as a Standard to Validate Immunofluorescence for Quantifying Biomarker Proteins in Routine Tissue Samples at JoVE.co

עבודה זו מומן בחלקו על ידי פרדריק בנטינג ו צ'ארלס הטוב ביותר בקנדה לתואר שני מלגה (בבוקר).

האישור לשימוש דגימות רקמה אנושית העיקרי היה מתקבל למדעי הבריאות, המזוהה עם בתי חולים מחקר אתיקה לוח (HSREB) באוניברסיטת קווין.
1. בניית Microarray רקמות של התא-קו (TMA)
<ol><li>הקציר ולשטוף תאים. הערה: פרוטוקול זה נבדקו על שורות תאים מונצחים הוקמה שונים (למשל הלה, Jurkat, RCH-ACV).<ol>
<li>עבור ...

<ol>
	<li>Khoury, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+Immunohistochemical+Assays+for+Integral+Biomarkers+in+the+NCI-MATCH+EAY131+Clinical+Trial.">Validation of Immunohistochemical Assays for Integral Biomarkers in the NCI-MATCH EAY131 Clinical Trial.</a> Clinical Cancer Research. 24 (3), 521-531 (2018).</li><li>Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G. L., da Silva Pinhal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+as+an+important+tool+in+biomarkers+detection+and+clinical+practice.">Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice.</a> Biomarker insights. 5, 9-20 (2010).</li><li>Seidal, T., Balaton, A. J., Battifora, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+and+quantification+of+immunostains.">Interpretation and quantification of immunostains.</a> The American journal of surgical pathology. 25 (9), 1204-1207 (2001).</li><li>Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+brown+cannot+do+for+you.">What brown cannot do for you.</a> Nature Biotechnology. 24 (8), 914-916 (2006).</li><li>Bokhart, M. T., Rosen, E., Thompson, C., Sykes, C., Kashuba, A. D. M., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mass+spectrometry+imaging+of+emtricitabine+in+cervical+tissue+model+using+infrared+matrix-assisted+laser+desorption+electrospray+ionization.">Quantitative mass spectrometry imaging of emtricitabine in cervical tissue model using infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (8), 2073-2084 (2015).</li><li>Porta, T., Lesur, A., Varesio, E., Hopfgartner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+in+MALDI-MS+imaging:+what+can+we+learn+from+MALDI-selected+reaction+monitoring+and+what+can+we+expect+for+imaging?.">Quantification in MALDI-MS imaging: what can we learn from MALDI-selected reaction monitoring and what can we expect for imaging?.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (8), 2177-2187 (2015).</li><li>Rzagalinski, I., Volmer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+low+molecular+weight+compounds+by+MALDI+imaging+mass+spectrometry+&#8211;+A+tutorial+review.">Quantification of low molecular weight compounds by MALDI imaging mass spectrometry &#8211; A tutorial review.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1865 (7), 726-739 (2017).</li><li>Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Western+blots:+Pitfalls+of+densitometry.">Quantifying Western blots: Pitfalls of densitometry.</a> ELECTROPHORESIS. 30 (11), 1845-1855 (2009).</li><li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics.">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li><li>Burgess, M. W., Keshishian, H., Mani, D. R., Gillette, M. A., Carr, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+and+efficient+quantification+of+low-abundance+proteins+at+very+high+multiplex+via+targeted+mass+spectrometry.">Simplified and efficient quantification of low-abundance proteins at very high multiplex via targeted mass spectrometry.</a> Molecular &amp; cellular proteomics: MCP. 13 (4), 1137-1149 (2014).</li><li>Carr, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+peptide+measurements+in+biology+and+medicine:+best+practices+for+mass+spectrometry-based+assay+development+using+a+fit-for-purpose+approach.">Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach.</a> Molecular &amp; cellular proteomics: MCP. 13 (3), 907-917 (2014).</li><li>Denburg, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Two+ELISA+Methods+and+Mass+Spectrometry+for+Measurement+of+Vitamin+D-Binding+Protein:+Implications+for+the+Assessment+of+Bioavailable+Vitamin+D+Concentrations+Across+Genotypes.">Comparison of Two ELISA Methods and Mass Spectrometry for Measurement of Vitamin D-Binding Protein: Implications for the Assessment of Bioavailable Vitamin D Concentrations Across Genotypes.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 31 (6), 1128-1136 (2016).</li><li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+immunohistochemistry,+imaging,+and+quantitation:+A+review,+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification,+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis.">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li><li>Peck, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+tumor+protein+marker+quantification+by+two+independent+automated+immunofluorescence+image+analysis+platforms.">Validation of tumor protein marker quantification by two independent automated immunofluorescence image analysis platforms.</a> Modern pathology: an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 29 (10), 1143-1154 (2016).</li><li>Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proof+of+the+quantitative+potential+of+immunofluorescence+by+mass+spectrometry.">Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry.</a> Laboratory Investigation. 97 (3), 329-334 (2017).</li><li>AlJohani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abundant+expression+of+BMI1+in+follicular+lymphoma+is+associated+with+reduced+overall+survival.">Abundant expression of BMI1 in follicular lymphoma is associated with reduced overall survival.</a> Leukemia and Lymphoma. 59 (9), 2211-2219 (2018).</li><li>Wood, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abundant+expression+of+interleukin-21+receptor+in+follicular+lymphoma+cells+is+associated+with+more+aggressive+disease.">Abundant expression of interleukin-21 receptor in follicular lymphoma cells is associated with more aggressive disease.</a> Leukemia and Lymphoma. 54 (6), 1212-1220 (2013).</li><li>Weberpals, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+application+of+the+Automated+QUantitative+Analysis+(AQUA)+technique+to+quantify+PTEN+protein+expression+in+ovarian+cancer:+A+correlative+study+of+NCIC+CTG+OV.16.">First application of the Automated QUantitative Analysis (AQUA) technique to quantify PTEN protein expression in ovarian cancer: A correlative study of NCIC CTG OV.16.</a> Gynecologic Oncology. 140 (3), 486-493 (2016).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraffin+embedding+tissue+samples+for+sectioning.">Paraffin embedding tissue samples for sectioning.</a> CSH protocols. , (2008).</li><li>Fedor, H. L., Marzo, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+Practical+Methods+for+Tissue+Microarray+Construction.">De Practical Methods for Tissue Microarray Construction.</a> Methods in Molecular Medicine. , 89-101 (2005).</li><li>Kajimura, J., Ito, R., Manley, N. R., Hale, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Single-+and+Dual-Color+Immunofluorescence+Protocols+for+Formalin-Fixed,+Paraffin-Embedded+Archival+Tissues.">Optimization of Single- and Dual-Color Immunofluorescence Protocols for Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Archival Tissues.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 64 (2), 112-124 (2016).</li><li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blot:+technique,+theory,+and+trouble+shooting.">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> North American journal of medical sciences. 4 (9), 429-434 (2012).</li><li>Wiedemann, M., Lee, S. J., da Silva, R. C., Visweswaraiah, J., Soppert, J., Sattlegger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+semi-dry+electrophoretic+transfer+of+a+wide+range+of+differently+sized+proteins+for+immunoblotting.">Simultaneous semi-dry electrophoretic transfer of a wide range of differently sized proteins for immunoblotting.</a> Nature Protocol Exchange. , (2013).</li><li>Delbridge, A. R. D., Grabow, S., Strasser, A., Vaux, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thirty+years+of+BCL-2:+translating+cell+death+discoveries+into+novel+cancer+therapies.">Thirty years of BCL-2: translating cell death discoveries into novel cancer therapies.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (2), 99-109 (2016).</li><li>Bosch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bioclinical+prognostic+model+using+MYC+and+BCL2+predicts+outcome+in+relapsed/refractory+diffuse+large+B-cell+lymphoma.">A bioclinical prognostic model using MYC and BCL2 predicts outcome in relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma.</a> Haematologica. 103 (2), 288-296 (2018).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BCL2+mRNA+or+protein+abundance+is+superior+to+gene+rearrangement+status+in+predicting+clinical+outcomes+in+patients+with+diffuse+large+B-cell+lymphoma.">BCL2 mRNA or protein abundance is superior to gene rearrangement status in predicting clinical outcomes in patients with diffuse large B-cell lymphoma.</a> Hematological Oncology. 35, 288-289 (2017).</li><li>Choi, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+expression+of+Bcl-2+predicts+poor+outcome+in+diffuse+large+B-cell+lymphoma+patients+with+low+international+prognostic+index+receiving+R-CHOP+chemotherapy.">High expression of Bcl-2 predicts poor outcome in diffuse large B-cell lymphoma patients with low international prognostic index receiving R-CHOP chemotherapy.</a> International Journal of Hematology. 103 (2), 210-218 (2016).</li><li>. The Human Protein Atlas BCL2 Available from: <a target="_blank" href="https://www.proteinatlas.org/ENSG00000171791-BCL2/cell#rna">https://www.proteinatlas.org/ENSG00000171791-BCL2/cell#rna</a> (2018)</li><li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+multiplex+immunofluorescence+panels+using+multispectral+microscopy+for+immune-profiling+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+human+tumor+tissues.">Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).</li><li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Guide+to+Modern+Quantitative+Fluorescent+Western+Blotting+with+Troubleshooting+Strategies.">A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).</li><li>Zellner, M., Babeluk, R., Diestinger, M., Pirchegger, P., Skeledzic, S., Oehler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+Western+blotting+for+quantitation+of+protein+biomarkers+in+clinical+samples.">Fluorescence-based Western blotting for quantitation of protein biomarkers in clinical samples.</a> ELECTROPHORESIS. 29 (17), 3621-3627 (2008).</li><li>Parra, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Platforms+of+Multiplexed+Immunofluorescence+for+Study+of+Paraffin+Tumor+Tissues.">Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues.</a> Journal of Cancer Treatment &amp; Diagnostics. 2 (1), 43-53 (2018).</li><li>Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunofluorescence+labelling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+tissue.">Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BMC Cell Biology. 9 (1), 13 (2008).</li></ol>

תארנו שיטה לשימוש immunoblotting כמותית (ליברות) כדי להדגים את התועלת של immunofluorescence (אם) עבור ברור שפע יחסי של חלבון המטרה דגימות רקמה FFPE. שיטות הנוכחי של כימות חלבונים מוגבלים לפי טבעם קטגורית, כגון2,הדפסות כסף IHC3, או בצורך homogenize דגימות, מניעת חקירה דוגמת מבנה ותא הא?...

הצורך לכמת חלבונים בפורמלין-קבוע, פרפין-מוטבע של דגימות ביופסיה של (FFPE) רקמה קיים בתחומים רפואיים רבים. לדוגמה, כימות של חלבונים סמן בדגימות ביופסיה שגרתית משמש כדי להבהיר פרוגנוזה ולהודיע טיפול עבור סרטן המטופלים1. עם זאת, שיטות הם בדרך כלל סובייקטיבי, חוסר אימות.
אימונוהיסטוכימיה (IHC) משמש באופן שגרתי במעבדות פתולוגיה, תלוי בדרך כלל של נוגדן ראשוני מכוונים את חלבון המטרה של נוגדנים משניים מצומדת עם תווית אנזימטי כגון חזרת peroxidase2. IHC קונבנציונלי הוא רגיש, יכול לעשות שימוש של דקה דגימות ושומר על שלמות מורפולוגי של דגימות רקמה ובכך מאפשרת הערכה של חלבון הביטוי בתוך ההקשר היסטולוגית הרלוונטיות שלה. עם זאת, מכיוון שהאות הדפסות כסף שנוצר על ידי IHC מופחתים, הוא סובל טווח דינמי צר יחסית, ומציע פוטנציאל מוגבל ריבוב2,3,4. לייזר בסיוע מטריקס desorption/יינון ספקטרומטר מסה הדמיה (MALDI-MSI) שומר על הגינות מורפולוגית. אולם, זו הטכנולוגיה המתפתחת מזוהה עם רזולוציה מורפולוגי צנוע, דורש כיול משמעותית, נורמליזציה, ופוגע שלה היתכנות לשימוש קליני5,6,7. טכניקות חלופיות לכמת חלבון דגימות רקמה כוללים immunoblotting8, ספקטרומטר מסה9,10,11, מקושרים-אנזים immunosorbent assay (אליסה)12, כל של שמתחיל עם הומוגני lysate של דגימת רקמה. דגימות רקמה הראשי הם הטרוגנית כי הם מכילים שפע של סוגי תאים. לכן, טכניקות שכרוכים homogenizing את הדוגמאות אינן מתירות כימות של חלבון באוכלוסייה לתא מסוים עניין כגון תאים סרטניים.
כאילו IHC, אם הוא ישים קטן FFPE דוגמאות וההיתרים השמירה של שלמות היסטולוגית13. עם זאת, תודה לטבע מוספים של אותות פלורסצנטיות, אם הוא נוטה היישום של מספר נוגדנים העיקרי ותוויות פלורסנט. לפיכך, חלבון עניין עשוי להיות יחסית לכמת בתוך תאים ספציפיים או תאים סלולריים (לדוגמה, גרעין לעומת הציטופלסמה) המוגדרים באמצעות נוגדנים אחרים. קרינה פלואורסצנטית אותות גם יש את היתרון של13,טווח דינמי גדול14. עליונות הפארמצבטית, ריבוב הפוטנציאל של אם מוחל על דגימות FFPE כבר הפגינו13,14,15.
במסמך זה אנו מתארים את השימוש immunoblotting כמותיים באמצעות שורות תאים הוקמה כמו תקן הזהב כדי לברר את מהות כמותיים אם בשילוב עם ניתוח תמונות המחשב בסיוע בקביעת שפע יחסי של חלבון עניין ב- סעיפים היסטולוגית של דגימות רקמה FFPE. לנו יש להחיל שיטה זו בהצלחה בגישה מולטיפלקס לכמת חלבונים סמן קליני ביופסיה דגימות16,17,18.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:675px;" width="673">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">697</td>
			<td style="width:116px;">DSMZ</td>
			<td style="width:123px;">ACC 42</td>
			<td style="width:213px;">Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">JeKo-1</td>
			<td style="width:116px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">CRL-3006</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Jurkat</td>
			<td style="width:116px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">TIB-152</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">RCH-ACV</td>
			<td style="width:116px;">DSMZ</td>
			<td style="width:123px;">ACC 548</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Granta-519</td>
			<td style="width:116px;">DSMZ</td>
			<td style="width:123px;">ACC 342</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">REH</td>
			<td style="width:116px;">DSMZ</td>
			<td style="width:123px;">ACC 22</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Raji</td>
			<td style="width:116px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">CCL-86</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">HeLa</td>
			<td style="width:116px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">CCL-2</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Trypsin/EDTA solution</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">R001100</td>
			<td>For detaching adhesive cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:116px;">Wisent Inc.</td>
			<td style="width:123px;">81150</td>
			<td>To neutralize trypsin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Neutral Buffered Formalin</td>
			<td style="width:116px;">Protocol</td>
			<td style="width:123px;">245-684</td>
			<td>For fixing cell pellets</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">UltraPure low melting point agarose</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">15517-022</td>
			<td>For casting cell pellets</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">Mouse monoclonal anti-human Bcl-2 antibody, clone 124</td>
			<td style="width:116px;">Dako (Agilent)</td>
			<td style="width:123px;">cat#: M088729-2, RRID: 2064429</td>
			<td style="width:213px;">To detect Bcl-2 by immunoflourencence and immunoblot (lot#:&#160;00095786</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Ventana Discovery XT</td>
			<td style="width:116px;">Roche</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:213px;">For automation of immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-mouse)</td>
			<td style="width:116px;">Dako (Agilent)</td>
			<td style="width:123px;">K4000</td>
			<td style="width:213px;">For immunofluorescence signal amplification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-rabbit)</td>
			<td style="width:116px;">Dako (Agilent)</td>
			<td style="width:123px;">K4002</td>
			<td style="width:213px;">For immunofluorescence signal amplification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Cyanine 5 tyramide reagent</td>
			<td style="width:116px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:123px;">NEL745001KT</td>
			<td style="width:213px;">For immunofluorescence signal amplification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Aperio ImageScope</td>
			<td style="width:116px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:213px;">To view scanned slides</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">HALO image analysis software</td>
			<td style="width:116px;">Indica Labs</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:213px;">For quantification of immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">Protease inhibitors (Halt protease inhibitor cocktail, 100X)</td>
			<td style="width:116px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">1862209</td>
			<td>To add to RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:116px;">BioShop</td>
			<td style="width:123px;">EDT001</td>
			<td>For RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">NP-40</td>
			<td style="width:116px;">BDH Limited</td>
			<td style="width:123px;">56009</td>
			<td>For RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D6750</td>
			<td>For RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Glycerol</td>
			<td style="width:116px;">FisherBiotech</td>
			<td style="width:123px;">BP229</td>
			<td>For Laemlli buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:116px;">BioShop</td>
			<td style="width:123px;">BRO777</td>
			<td>For Laemlli buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:116px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">161-0611</td>
			<td>For Laemlli buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:116px;">BioShop</td>
			<td style="width:123px;">ALB001</td>
			<td>For immunoblot washes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Protein ladder (Precision Plus Protein Dual Color Standards)</td>
			<td style="width:116px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">161-0374</td>
			<td>For running protein gel</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Filter paper (Extra thick blot paper)</td>
			<td style="width:116px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">1703969</td>
			<td>For blotting transfer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Nitrocellulose membrane</td>
			<td style="width:116px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">162-0115</td>
			<td>For blotting transfer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Trans-blot SD semi-dry transfer cell</td>
			<td style="width:116px;">Bio-Rad</td>
			<td>1703940</td>
			<td>For semi-dry transfer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Skim milk powder (Nonfat dry milk)</td>
			<td style="width:116px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:123px;">9999S</td>
			<td>For blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Tween 20</td>
			<td style="width:116px;">BioShop</td>
			<td style="width:123px;">TWN510</td>
			<td>For wash buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">GAPDH rabbit monoclonal antibody</td>
			<td style="width:116px;">Epitomics</td>
			<td style="width:123px;">2251-1</td>
			<td style="width:213px;">Primary antibody of control protein (lot#: YE101901C)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) antibody</td>
			<td style="width:116px;">abcam</td>
			<td style="width:123px;">cat#: ab6789, RRID: AB_955439</td>
			<td style="width:213px;">Secondary antibody for immunoblot</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">Goat anti-rabbit IgG (HRP conjugated) antibody</td>
			<td style="width:116px;">abcam</td>
			<td style="width:123px;">cat#: ab6721, RRID: AB_955447</td>
			<td style="width:213px;">Secondary antibody for immunoblot (lot#: GR3192725-5)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Clarity Western ECL substrates</td>
			<td style="width:116px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">1705060</td>
			<td style="width:213px;">For immunoblot signal detection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Amersham Imager 600</td>
			<td style="width:116px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">29083461</td>
			<td>For immunoblot signal detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:116px;">Freeware, NIH</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td>For densitometry analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative immunoblotting of cell lines as a standard to validate immunofluorescence for quantifying biomarker proteins in routine tissue samples

כימות של חלבונים עניין בפורמלין-קבוע, פרפין-מוטבע דגימות רקמה (FFPE) היא חשובה קלינית ומחקר יישומי. שיטה אופטימלית של כימות מדויק, יש טווח דינמי רחב ליניארי ושומר את השלמות. המבנית של המדגם כדי לאפשר זיהוי של סוגי תאים בודדים. שיטות כגון אימונוהיסטוכימיה (IHC), ספקטרומטר מסה immunoblotting אחד לא לעמוד תנאים אלה בשל טבעם קטגורית או homogenize את הדגימה. כאמצעי חלופי, אנו מציעים את השימוש immunofluorescence (אם) וניתוח התמונה כדי לקבוע את השפע היחסי של חלבון עניין ברקמות FFPE. בזאת אנחנו מדגימים כי שיטה זו ממוטבת בקלות, התשואות טווח דינמי רחב, והוא באופן ליניארי לכימות לעומת תקן הזהב של immunoblotting כמותיים. יתר על כן, שיטה זו מאפשרת שמירה על שלמות המבנה של המדגם ומאפשר ההבחנה של סוגי תאים שונים, אשר עשוי להיות מכריע ביישומים אבחון. בסך הכל, זהו שיטה חזקה כימות היחסי של חלבונים בדגימות FFPE והוא ניתן להתאים בקלות להתאים קליני או מחקר צרכים.

פרוטוקול זה נעשה שימוש כדי לאשר את היכולת של IF כדי לקבוע את הכמות היחסית של החלבון אנטי-מוות Bcl-2 של שורות תאים הפך גושי רקמה FFPE. לכימות Bcl-2 באופן בררני בתאי סרטן ניתן להסבר מנגנוני oncogenic והוא יכול להיות שימושי באבחון פתולוגי, סיפור קליני ניהול החלטות24. ליתר דיו?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Immunoblotting of Cell Lines as a Standard to Validate Immunofluorescence for Quantifying Biomarker Proteins in Routine Tissue Samples at JoVE.co

Quantitative Immunoblotting of Cell Lines as a Standard to Validate Immunofluorescence for Quantifying Biomarker Proteins in Routine Tissue Samples

Immunoblotting כמותית של שורות תאים כסטנדרט לאימות Immunofluorescence לכימות תנועת סמן חלבונים בדגימות הרקמות שגרתיות

אנו מתארים את השימוש immunoblotting כמותיים כדי לאמת היסטולוגיה immunofluorescence בשילוב עם ניתוח תמונות כאמצעי לכימות חלבון עניין בפורמלין-קבוע, פרפין-מוטבע דגימות רקמה (FFPE). התוצאות שלנו להפגין את התועלת של היסטולוגיה immunofluorescence עבור ברור הכמות היחסית של חלבונים סמן דגימות ביופסיה שגרתית.

Quantification of proteins of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples is important in clinical and research applications. An ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הפתולוגיה של סרטן, על ידי כימות חלבונים סמנים ביולוגיים מחומר ביופסיה מעובד באופן שגרתי. היתרונות העיקריים של טכניקה זו ביחס אימונוהיסטוכימיה קונבנציונלית, הם כי הוא אובייקטיבי, יש מגוון דינמי רחב, ומאפשר כימות של חלבונים בסוגי תאים ספציפיים. נוכחות או היעדר של חלבונים מסוימים שנקרא סמן ביולוגי, או יותר במיוחד, השפע היחסי של חלבונים אלה בדגימות ביופסיה סרטן יכול להיות מאוד שימושי בקבלת אבחנה פתולוגית ספציפית של סוגים מסוימים של סרטן.אבל זה יכול להיות גם שימושי בחיזוי התגובה לטיפולים בסרטן, ולכן טכניקה זו רלוונטית הן לאבחון והן לטיפול בחולים עם סרטן. פרוטוקול זה עוסק בעיקר באופן השימוש בכימות חלבונים בקווי תאים מונצחים כדי לאמת את האופי הכמותי של ההתמדה המבוססת על כשל חיסוני. אבל חשוב לציין כי immunofluorescence יכול בקלות להיות משולב לתוך גישה multiplexed, ולהחיל על דגימות ביופסיה ראשוניות.מי שיסייעו וידגים הליך זה יהיו לי בודרו, טכנאי, ושיקל וירק, מנהל התפעול. שניהם ממעבדת המלכה לפתולוגיה מולקולרית. כדי להתחיל, צנטריפוגה התאים שנקטפו בעבר בצינור חרוט 50 מיליליטר ב 225 Gs במשך חמש דקות.Decant supernatant, ולתלות מחדש את גלולת התא ב10 מיליליטר של PBS. לאחר מכן, צנטריפוגה התאים המתווסת ב 225 Gs במשך חמש דקות. להשעות את גלולת התא עם 10 מיליליטר של 10%NBF.ואז לה הדגיר את התאים בטמפרטורת החדר על נדנדה ב 24 RPMs לילה. לאחר תיקון התאים, צנטריפוגה התאים ב 225 Gs במשך חמש דקות. לאחר מכן להסיר את supernatant ולתלות מחדש את התאים ב 500 microliters של PBS.מעבירים את התאים לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, ומעבירים את התאים באמצעות צנטריפוגה. לאחר מכן, שאף את העל-טבעי. הוסף כ 500 microliters של 1%agarose פתרון לכל צינור המכיל תאים.לאחר מכן, פיפטה את התערובת למעלה ולמטה לערבב. לאחר פתרון התא agarose מתקשה, להוסיף מיליליטר אחד של 10%NBF לצינורות. מאוחר יותר, להסיר את NBF מן הדגימות.השתמש בסכין גילוח כדי להסיר את תקע התא, והכנס את התקע לקלטת רקמת פלסטיק. עבד דגימות בן לילה עם מעבד רקמות אוטומטי. לאחר מכן, להטמיע את הדגימות שעווה פרפין, באמצעות שיטות היסטולוגיה סטנדרטיות.באמצעות מכשיר מערך רקמות, לקצור ליבות כפולות 6 מילימטר מבלוק הפרפין, ולהכניס אותם לתוך בלוק פרפין ריק. לאחר מכן, השתמש במיקרוטום כדי להכין שני חלקים היסטולוגיים של קו התאים החדש שנוצר, TMA. לאחר מכן הר את החלקים על מגלשת היסטולוגיה, ו deparaffinize אותם.תחילה, טען את שתי השקופיות של קו התא TMA למערכת הכתמים האוטומטית. הכתם צד אחד בדילול הנוגדנים הראשוני האופטימלי, והשאיר את הצד השני כמגלשת בקרה שלילית. לשתי השקופיות, יש למרוח הסכם נגד גרעיני ונוגדן משני.לאחר תהליך הכתמים, מוסיפים את הרטירמיד אות הגברה reagents. לאחר מכן, לסרוק את השקופיות immunostained באמצעות גלי העירור והאיתור המתאימים עבור פלואורופורים ששימשו. השתמש בתוכנת ניתוח תמונה כדי לזהות את התא התא המעניין, בין אם גרעין או ציטופלסמה, ולכרות את עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת, או MFI, עבור כל שורה.כדי לקבוע לאיזה קו תא יש את השפע הגדול ביותר של חלבון היעד, אלקוט מוכן ליקר התא לפזר לתוך צינורות microcentrifuge. לאחר מכן הוסיפו 2.5 מיקרוליטרים של חיץ 6x laemly, ומספיק מאגר תמיסת RIPA כדי להביא את הנפח הכולל ל-15 מיקרוליטרים. לאחר מכן, לטעון ג'ל דף SDS, עם סולם חלבון, ואת הדגימות שהוכנו בעבר.לאחר מכן, לטעון חיץ laemly לתוך בארות ריקות. מפעילים את הג'ל עד שהצבע הכחול מגיע לתחתית הצלחת. לאחר ביצוע העברת חלבון יבשה למחצה, השתמשו בסכין גילוח כדי לחתוך את הממברנה אופקית כדי להפריד את החלבון המעניין מחלבון הבקרה.בצע חסימות ודגירה נוגדנים על פי הוראות היצרנים. לאחר מכן מניחים את רצועות הממברנה בשקית ניילון שקופה. השתמש P1000 פיפטה כדי לכסות את הממברנות עם תערובת ECL.לאחר מכן לאטום את השקית, ולהידגר את הממברנות בטמפרטורת החדר בחושך במשך 1 עד 2 דקות. לאחר מכן, מניחים את שקית הניילון המכילה את הממברנות בפלטפורמת הדמיה דיגיטלית. השתמש chemiluminescence וזיהוי סמן colorimetric כדי ללכוד חשיפות שונות של הממברנה.באמצעות תוכנת ניתוח תמונה, או תצפית חזותית, לקבוע איזה קו תא מבטא את החלבון היעד ביותר. לאחר immunoblotting דילול סדרתי של קו תא זה, לפתוח את תמונות החשיפה באמצעות תוכנה לניתוח תמונה. השתמש בכלי בחירות מלבניות כדי לבחור את הנתיב הראשון של הג'ל.לאחר מכן עבור לניתוח, ג'לים, ובחר נתיב ראשון. חזור על תהליך זה על-ידי הזזת כלי הבחירות המלבני לנתיב הבא, עבור לניתוח, ג'לים ובחר בנתיב הבא. לאחר מכן, עבור לניתוח, ג'לים, ותווי עלילה.השתמש בכלי הקו הישר כדי לצייר קווים לאורך הבסיסים של כל שיא, כדי להסיר את רעשי הרקע. לאחר מכן השתמש בכלי שרביט כדי לבחור כל שיא, ולקבל את עוצמת הפס של כל שיא מחלון התוצאות. צור פיזור בעוצמת הלהקה לעומת כמות החלבון הכוללת שנטענה עבור כל נוגדן ראשי באמצעות תפוקת הצפיפות.לאחר מכן, השתמש בקו של התאמה הטובה ביותר ותצפית חזותית כדי לקבוע את המיקום של הטווח הדינמי ליניארי של כל נוגדן. בחר ריכוז חלבון המניב עוצמת פס בטווח ליניארי, ולבצע immunoblot של כל קו התא lysates עם ריכוז חלבון זה, כפי שהודגם קודם לכן. לאחר מכן, בצעו צפיפות בסריקות הדיגיטליות, ובחרו חשיפות המניבות אותות בטווחים ליניאריים שזוהו בעבר עבור כל נוגדן.לאחר מכן, לחשב את היחס של עוצמת רצועת חלבון היעד לטעינת עוצמת רצועת הבקרה עבור כל קו תא. לבסוף, השתמש בתוכנה סטטיסטית כדי לבצע בדיקת מתאם פירסון בין הערכים המתקבלים מניתוח תמונה של כתמי IF, ואלה המתקבלים immunoblotting. פרוטוקול זה שימש כדי לאשר את היכולת של IF כדי לקבוע את הכמות היחסית של חלבון אנטי אפטומטי Bcl-2.דילולים משתנים של הנוגדן העיקרי נבדקו על רקמת השקדים האנושית עם מכתים אימונוהיסטולוגיה. עבור ניסוי זה, דילול של 1 עד 50 נקבע להיות הדילול האופטימלי שהניב אות חזק עם מעט רעשי רקע. דילול זה שימש כדי להכתים את קו התא TMA על ידי immunofluorescence, וניתוח תמונה שימש לכמת את האות Cytoplasmic Cy5 המיוחס Bcl-2.בהתבסס על האימונובלו לכל קווי התאים שנבדקו, לגרנטה-519 היה השפע הגדול ביותר של Bcl-2. לאחר מכן נעשה שימוש באימונובלו של הדילול הסדרתי של ליזאט Granta-519 כדי למצוא את הטווח הדינמי ליניארי של Bcl-2, ולשלוט בחלבון GAPDH. הטווח הדינמי עבור Bcl-2 בהקשה זו נע בין עוצמת הלהקה של כמעט 0, ל 7500 יחידות.הטווח הדינמי של GAPDH נע בין 3000 ל-6500 יחידות. האימונובלו חזר על עצמו עם חשיפות בטווח ליניארי זה. והיחס בין Bcl-2 ל- GAPDH חושב עבור כל קו תא.בדיקת מתאם פירסון הראתה כי יחסי האינטנסיביות של immunoblotting היו חזקים באופן חיובי בקורלציה עם קריאות אינטנסיביות של IF כמותי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לחשוף את הממברנה הסופית עבור נקודות זמן מרובות, על מנת למצוא את החשיפה האופטימלית שבה כל הלהקות נמצאות בטווחים ליניאריים בהתאמה. לאחר אימות האופי הכמותי של פרוטוקול IF, ניתן לשנות אותו עבור מולטיפלקס IF, בדגימות רקמה מעובדות באופן שגרתי על מנת לענות על שאלות קליניות כגון היכן מתבטא חלבון יעד.

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

אקטין Co-Assay שקיעה, כי ניתוח של חלבון מחייב את ה-F-אקטין

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

השוואה כמותית של Cis-רגולטוריות (Cre) אלמנט פעילות טראנסגנטי תסיסנית melanogaster</em

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

כושר ניתוח כמותי של זרימת עבודה

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

באמצעות רצף מעצר SecM ככלי לבודד פוליפפטידים כרוכים הריבוזום

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

אפיון תאי גזע עוברי האנושי על ידי הפרט כמותי RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

כמותי Immunofluorescence Assay למדוד הווריאציה ברמות חלבון בCentrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

שיטה למדידת הפעילות של אנזימי Deubiquitinating בשורות תאים ודגימות רקמה

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

העסקת דיגיטלי אגל PCR לזיהוי מוטציות V600E BRAF בשורות תאי ההפניה תקן קבוע פורמלין מוטבע-פרפין

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

חלבונים Immunofluorescence ניתוח של אנדוגני אקסוגניים centromere-קינטוכור

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

גאפ junctional אינטר תקשורת: ביומרקר פונקציונלית להערכת תופעות לוואי של toxicants ורעלים, ואת היתרונות הבריאותיים של מוצרים טבעיים

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...