Name: quantitative immunoblotting of cell lines as a standard to validate immunofluorescence for quantifying biomarker proteins in routine tissue samples
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Immunoblotting of Cell Lines as a Standard to Validate Immunofluorescence for Quantifying Biomarker Proteins in Routine Tissue Samples at JoVE.co

この作品はフレドリック バンティングとチャールズ ・ ベスト カナダ大学院奨学金 (午前) 部分的に資金を供給されました。

主な人体組織サンプルを使用する健康科学関連教育病院研究倫理委員会 (HSREB) 女王の大学から承認されました。
1. 細胞ティッシュのマイクロ アレイ (TMA) の構築
<ol><li>収穫や洗浄のセルです。 注: このプロトコルは、様々 な確立の不死化細胞株 (例えばhela 細胞の Jurkat、RCH ACV) でテストされています。<ol>
<li>付着性のセルの約 80% の confluency に達すれば約 1.3 倍...

<ol>
	<li>Khoury, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+Immunohistochemical+Assays+for+Integral+Biomarkers+in+the+NCI-MATCH+EAY131+Clinical+Trial.">Validation of Immunohistochemical Assays for Integral Biomarkers in the NCI-MATCH EAY131 Clinical Trial.</a> Clinical Cancer Research. 24 (3), 521-531 (2018).</li><li>Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G. L., da Silva Pinhal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+as+an+important+tool+in+biomarkers+detection+and+clinical+practice.">Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice.</a> Biomarker insights. 5, 9-20 (2010).</li><li>Seidal, T., Balaton, A. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Two+ELISA+Methods+and+Mass+Spectrometry+for+Measurement+of+Vitamin+D-Binding+Protein:+Implications+for+the+Assessment+of+Bioavailable+Vitamin+D+Concentrations+Across+Genotypes.">Comparison of Two ELISA Methods and Mass Spectrometry for Measurement of Vitamin D-Binding Protein: Implications for the Assessment of Bioavailable Vitamin D Concentrations Across Genotypes.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 31 (6), 1128-1136 (2016).</li><li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+tumor+protein+marker+quantification+by+two+independent+automated+immunofluorescence+image+analysis+platforms.">Validation of tumor protein marker quantification by two independent automated immunofluorescence image analysis platforms.</a> Modern pathology: an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 29 (10), 1143-1154 (2016).</li><li>Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. 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I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+application+of+the+Automated+QUantitative+Analysis+(AQUA)+technique+to+quantify+PTEN+protein+expression+in+ovarian+cancer:+A+correlative+study+of+NCIC+CTG+OV.16.">First application of the Automated QUantitative Analysis (AQUA) technique to quantify PTEN protein expression in ovarian cancer: A correlative study of NCIC CTG OV.16.</a> Gynecologic Oncology. 140 (3), 486-493 (2016).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraffin+embedding+tissue+samples+for+sectioning.">Paraffin embedding tissue samples for sectioning.</a> CSH protocols. , (2008).</li><li>Fedor, H. L., Marzo, A. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blot:+technique,+theory,+and+trouble+shooting.">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> North American journal of medical sciences. 4 (9), 429-434 (2012).</li><li>Wiedemann, M., Lee, S. J., da Silva, R. C., Visweswaraiah, J., Soppert, J., Sattlegger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+semi-dry+electrophoretic+transfer+of+a+wide+range+of+differently+sized+proteins+for+immunoblotting.">Simultaneous semi-dry electrophoretic transfer of a wide range of differently sized proteins for immunoblotting.</a> Nature Protocol Exchange. , (2013).</li><li>Delbridge, A. R. D., Grabow, S., Strasser, A., Vaux, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thirty+years+of+BCL-2:+translating+cell+death+discoveries+into+novel+cancer+therapies.">Thirty years of BCL-2: translating cell death discoveries into novel cancer therapies.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (2), 99-109 (2016).</li><li>Bosch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bioclinical+prognostic+model+using+MYC+and+BCL2+predicts+outcome+in+relapsed/refractory+diffuse+large+B-cell+lymphoma.">A bioclinical prognostic model using MYC and BCL2 predicts outcome in relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma.</a> Haematologica. 103 (2), 288-296 (2018).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BCL2+mRNA+or+protein+abundance+is+superior+to+gene+rearrangement+status+in+predicting+clinical+outcomes+in+patients+with+diffuse+large+B-cell+lymphoma.">BCL2 mRNA or protein abundance is superior to gene rearrangement status in predicting clinical outcomes in patients with diffuse large B-cell lymphoma.</a> Hematological Oncology. 35, 288-289 (2017).</li><li>Choi, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+expression+of+Bcl-2+predicts+poor+outcome+in+diffuse+large+B-cell+lymphoma+patients+with+low+international+prognostic+index+receiving+R-CHOP+chemotherapy.">High expression of Bcl-2 predicts poor outcome in diffuse large B-cell lymphoma patients with low international prognostic index receiving R-CHOP chemotherapy.</a> International Journal of Hematology. 103 (2), 210-218 (2016).</li><li>. The Human Protein Atlas BCL2 Available from: <a target="_blank" href="https://www.proteinatlas.org/ENSG00000171791-BCL2/cell#rna">https://www.proteinatlas.org/ENSG00000171791-BCL2/cell#rna</a> (2018)</li><li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+multiplex+immunofluorescence+panels+using+multispectral+microscopy+for+immune-profiling+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+human+tumor+tissues.">Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).</li><li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Guide+to+Modern+Quantitative+Fluorescent+Western+Blotting+with+Troubleshooting+Strategies.">A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunofluorescence+labelling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+tissue.">Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BMC Cell Biology. 9 (1), 13 (2008).</li></ol>

については、メソッドを利用する定量的免疫ブロット (IB) 蛍光抗体法 (IF) の有用性を実証する FFPE 組織サンプルのターゲット蛋白質の相対的な豊かさを判別します。現在蛋白質定量方法が発色 IHC2,3などそのカテゴリ性質またはサンプル、サンプル構造と細胞集団に調査を防止するなどを統一する必要性によって限られています。IB と質量<sup class="x...

ホルマリン固定のパラフィン埋め込まれた (FFPE) 組織生検試料中のタンパク質を定量化する必要が多くの臨床現場であります。たとえば、ルーチン生検のマーカー蛋白質の定量は予後の解明し、癌患者1の治療に知らせるためです。ただし、現在の方法は通常主観的であり、検証がないです。
免疫組織染色 (IHC) は病理学研究室で日常的に使用、通常ターゲット蛋白質の一次抗体と二次抗体酵素西洋わさびの過酸化酵素2などラベル付き共役によって異なります。従来の IHC は敏感で、作ることができる分の使用サンプルし、その関連する組織コンテキスト内でタンパク質発現の評価が行え組織サンプルの形態学的整合性を維持します。しかし、IHC によって生成された発色の信号は減算、のでそれが比較的狭いダイナミック レンジに苦しんで、2,3、4を多重化するため限られた可能性を提供しています。マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法 (MALDI MSI) をイメージングには、形態学的整合性が維持されます。しかし、発展するこの技術はささやかな形態の解像度に関連付けられて、大幅な校正と標準化、日常的に臨床使用5,6、7の可能性を損なうことが必要です。組織サンプル中のタンパク質を定量化するための代替技術は、免疫ブロット8質量9,10,11,、酵素免疫測定法 (ELISA)12、各均質化、始まるのサンプル組織ライセート。主な組織サンプルは、細胞の種類の多数を含む異種。したがって、サンプルの均質化を伴う技術が癌細胞のような興味の特定のセル人口のタンパク質の定量を許可しません。
場合、IHC の小に適用できるような FFPE サンプルし、組織学的整合性13の保持が可能します。場合、ただし、蛍光信号の添加物の性質のおかげで複数の一次抗体、蛍光ラベルの適用を受けやすいです。したがって、特定の細胞または細胞コンパートメント (たとえば、核と細胞質) 他の抗体を使用して定義内で比較的興味の蛋白質を定量化することがあります。蛍光信号も大きいダイナミック レンジ13,14の利点があります。優位性、再現性、多重性 FFPE サンプルに適用される場合は、実証された13,14,15をされています。
ここで興味の蛋白質の相対量を決定する際にコンピューター支援画像解析と組み合わされる場合の計量的性質を確認するためのゴールド スタンダードとして確立されたセルラインを使用して定量的免疫ブロットの使用について述べるFFPE 組織サンプルからの組織学的セクション。我々 は臨床の生検サンプル16,17,18バイオ マーカー蛋白質を定量化するための多重アプローチで正常にこのメソッドを適用しました。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:675px;" width="673">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">697</td>
			<td style="width:116px;">DSMZ</td>
			<td style="width:123px;">ACC 42</td>
			<td style="width:213px;">Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">JeKo-1</td>
			<td style="width:116px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">CRL-3006</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Jurkat</td>
			<td style="width:116px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">TIB-152</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">RCH-ACV</td>
			<td style="width:116px;">DSMZ</td>
			<td style="width:123px;">ACC 548</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Granta-519</td>
			<td style="width:116px;">DSMZ</td>
			<td style="width:123px;">ACC 342</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">REH</td>
			<td style="width:116px;">DSMZ</td>
			<td style="width:123px;">ACC 22</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Raji</td>
			<td style="width:116px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">CCL-86</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">HeLa</td>
			<td style="width:116px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">CCL-2</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Trypsin/EDTA solution</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">R001100</td>
			<td>For detaching adhesive cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:116px;">Wisent Inc.</td>
			<td style="width:123px;">81150</td>
			<td>To neutralize trypsin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Neutral Buffered Formalin</td>
			<td style="width:116px;">Protocol</td>
			<td style="width:123px;">245-684</td>
			<td>For fixing cell pellets</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">UltraPure low melting point agarose</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">15517-022</td>
			<td>For casting cell pellets</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">Mouse monoclonal anti-human Bcl-2 antibody, clone 124</td>
			<td style="width:116px;">Dako (Agilent)</td>
			<td style="width:123px;">cat#: M088729-2, RRID: 2064429</td>
			<td style="width:213px;">To detect Bcl-2 by immunoflourencence and immunoblot (lot#:&#160;00095786</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Ventana Discovery XT</td>
			<td style="width:116px;">Roche</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:213px;">For automation of immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-mouse)</td>
			<td style="width:116px;">Dako (Agilent)</td>
			<td style="width:123px;">K4000</td>
			<td style="width:213px;">For immunofluorescence signal amplification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-rabbit)</td>
			<td style="width:116px;">Dako (Agilent)</td>
			<td style="width:123px;">K4002</td>
			<td style="width:213px;">For immunofluorescence signal amplification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Cyanine 5 tyramide reagent</td>
			<td style="width:116px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:123px;">NEL745001KT</td>
			<td style="width:213px;">For immunofluorescence signal amplification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Aperio ImageScope</td>
			<td style="width:116px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:213px;">To view scanned slides</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">HALO image analysis software</td>
			<td style="width:116px;">Indica Labs</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:213px;">For quantification of immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">Protease inhibitors (Halt protease inhibitor cocktail, 100X)</td>
			<td style="width:116px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">1862209</td>
			<td>To add to RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:116px;">BioShop</td>
			<td style="width:123px;">EDT001</td>
			<td>For RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">NP-40</td>
			<td style="width:116px;">BDH Limited</td>
			<td style="width:123px;">56009</td>
			<td>For RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D6750</td>
			<td>For RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Glycerol</td>
			<td style="width:116px;">FisherBiotech</td>
			<td style="width:123px;">BP229</td>
			<td>For Laemlli buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:116px;">BioShop</td>
			<td style="width:123px;">BRO777</td>
			<td>For Laemlli buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:116px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">161-0611</td>
			<td>For Laemlli buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:116px;">BioShop</td>
			<td style="width:123px;">ALB001</td>
			<td>For immunoblot washes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Protein ladder (Precision Plus Protein Dual Color Standards)</td>
			<td style="width:116px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">161-0374</td>
			<td>For running protein gel</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Filter paper (Extra thick blot paper)</td>
			<td style="width:116px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">1703969</td>
			<td>For blotting transfer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Nitrocellulose membrane</td>
			<td style="width:116px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">162-0115</td>
			<td>For blotting transfer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Trans-blot SD semi-dry transfer cell</td>
			<td style="width:116px;">Bio-Rad</td>
			<td>1703940</td>
			<td>For semi-dry transfer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Skim milk powder (Nonfat dry milk)</td>
			<td style="width:116px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:123px;">9999S</td>
			<td>For blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Tween 20</td>
			<td style="width:116px;">BioShop</td>
			<td style="width:123px;">TWN510</td>
			<td>For wash buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">GAPDH rabbit monoclonal antibody</td>
			<td style="width:116px;">Epitomics</td>
			<td style="width:123px;">2251-1</td>
			<td style="width:213px;">Primary antibody of control protein (lot#: YE101901C)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) antibody</td>
			<td style="width:116px;">abcam</td>
			<td style="width:123px;">cat#: ab6789, RRID: AB_955439</td>
			<td style="width:213px;">Secondary antibody for immunoblot</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">Goat anti-rabbit IgG (HRP conjugated) antibody</td>
			<td style="width:116px;">abcam</td>
			<td style="width:123px;">cat#: ab6721, RRID: AB_955447</td>
			<td style="width:213px;">Secondary antibody for immunoblot (lot#: GR3192725-5)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Clarity Western ECL substrates</td>
			<td style="width:116px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">1705060</td>
			<td style="width:213px;">For immunoblot signal detection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Amersham Imager 600</td>
			<td style="width:116px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">29083461</td>
			<td>For immunoblot signal detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:116px;">Freeware, NIH</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td>For densitometry analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative immunoblotting of cell lines as a standard to validate immunofluorescence for quantifying biomarker proteins in routine tissue samples

ホルマリン固定のパラフィン埋め込まれた (FFPE) 組織サンプルの興味の蛋白質の定量化は臨床的に重要なアプリケーションを研究。定量化の最適なメソッドが正確で、線形ダイナミック レンジが広い、個々 のセルの種類を識別するためにできるようにするサンプルの構造の整合性を維持します。免疫組織染色 (IHC)、質量分析法、免疫ブロットなど現在メソッドが各はそのカテゴリの性質のためこれらの規定を満たすために失敗したりサンプルを均質化する必要があります。別の方法として蛍光抗体法 (IF) と画像解析 FFPE 組織の興味の蛋白質の量を決定するための使用を提案します。ここは、このメソッドは簡単に最適化し、広いダイナミック レンジが得られますは定量的免疫ブロットのゴールド スタンダードと比較して直線的に定量化を示します。さらに、このメソッドは、サンプルの構造の整合性の維持が可能、診断アプリケーションで重要となる可能性がありますさまざまなセルタイプの区別のためことができます。全体的にみて、これは FFPE サンプルの蛋白質の相対的な定量化のための堅牢な方法で、簡単に合わせて臨床や研究のニーズに適応することができます。

このプロトコルは FFPE 組織ブロック化細胞において抗アポトーシス蛋白 Bcl 2 の相対的な量を決定する場合の機能を確認するために使用されました。がん細胞に選択的に定量化 Bcl 2 発癌機構を解明することができますおよび病理組織学的診断と臨床管理決定24を通知に便利することができます。具体的には、Bcl 2 適切な b リンパ球の開発の役割を果た...

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Quantitative Immunoblotting of Cell Lines as a Standard to Validate Immunofluorescence for Quantifying Biomarker Proteins in Routine Tissue Samples

ルーチン組織試料中のバイオ マーカー タンパク質を定量化するため, 蛍光抗体法を検証するための標準として細胞の定量的免疫ブロット

ホルマリン固定のパラフィン埋め込まれた (FFPE) 組織サンプルに興味の蛋白質を定量化するための手段として画像解析と相まって蛍光組織学を検証する定量的免疫ブロットの使用について述べる。ルーチン生検試料中のバイオ マーカー タンパク質の相対的な量を判別する蛍光組織学の有用性を示した。

Quantification of proteins of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples is important in clinical and research applications. An ...

この方法は、日常的に処理される生検材料からバイオマーカータンパク質を定量化することによって、癌病理の分野における重要な質問に答えることができます。従来の免疫検査に関連してこの技術の主な利点は、それが客観的であり、広いダイナミックレンジを有し、そして特定の細胞タイプにおけるタンパク質の定量化を可能にする。特定のいわゆるバイオマーカータンパク質の有無、またはより詳細には、癌生検標本におけるそれらのタンパク質の相対的な存在量は、特定の種類の癌の特定の病理学的診断を行う上で非常に有用であり得る。しかし、がん治療に対する反応を予測するのにも役立つため、この技術はがん患者の診断と治療の両方に関連しています。このプロトコルは、免疫蛍光ベースアッセイの定量性を検証するために、不死化細胞株におけるタンパク質定量法の使用法を主に説明します。しかし、免疫蛍光は多重化されたアプローチに容易に組み込まれ、一次生検サンプルに適用できることに注意することが重要です。この手順を支援し、デモンストレーションを行うのは、技術者のリー・ブードローとオペレーションディレクターのシェイケル・ヴァークです。両方とも女王の分子病理学研究所から。まず、前に収穫した細胞を225 Gsの50ミリリットル円錐管で5分間遠心分離する。上清をデカントし、細胞ペレットを10ミリリットルのPBSで再懸濁させた。次いで、再懸濁した細胞を225Gsで5分間遠心分離する。10%NBFの10ミリリットルで細胞ペレットを懸濁します。その後、一晩24 RPMでロッカーの室温で細胞をインキュベートします。細胞を固定した後、225 Gsで細胞を5分間遠心分離する。その後、上清を取り除き、PBSの500マイクロリットルで細胞を再懸濁します。細胞を1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに移し、遠心分離を介して細胞をペレット化する。その後、上清を吸引する。細胞を含む各チューブに約500マイクロリットルの1%アガロース溶液を加えます。その後、混合物を上下にピペットして混合する。アガロース細胞溶液が固まった後、チューブに10%NBFの1ミリリットルを加えます。後で、サンプルから NBF を削除します。カミソリの刃を使用してセルプラグを取り外し、プラグをプラスチック製のティッシュカセットに入れる。自動組織プロセッサでサンプルを一晩処理します。次に、サンプルをパラフィンワックスに埋め込み、標準的な占体法を用いる。組織アレイ装置を使用して、パラフィンブロックから6ミリメートルのコアを収穫し、空のパラフィンブロックに挿入します。この後、ミクロトームを使用して、新しく作成された細胞株TMAの2つの組織学的セクションを準備する。その後、占いのスライドにセクションをマウントし、それらを脱パラフィン化します。まず、細胞株TMAの2枚のスライドを自動染色システムにロードします。一方の側を最適な一次抗体希釈で染色し、他方を陰性対照スライドとして残します。両スライドに、核反汚れ、および二次抗体を適用する。染色プロセスの後、チラミドシグナル増幅試薬を加える。この後、使用された蛍光色素の適切な励起および検出波長を使用して、免疫染色されたスライドをスキャンします。画像解析ソフトウェアを使用して、対象となる細胞区画(核または細胞質のどちらを含むか)を特定し、各ラインの平均蛍光強度(MFI)を定量化します。どの細胞株が標的タンパク質の最大の存在量を有するかを決定するために、アリコートは、マイクロ遠心分離管に細胞リセートを貴重に調製した。その後、6xラエムリーバッファーの2.5マイクロリットル、および15マイクロリットルに総体積を持って来るために十分なRIPAのリシスバッファーを加えます。次に、SDSページゲルをタンパク質ラダーと、以前に調製したサンプルでロードします。この後、空の井戸にlaemlyバッファをロードします。青い染料がプレートの底に達するまでゲルを実行します。半乾燥タンパク質の転写を行った後、カミソリの刃を使用して膜を水平に切断し、目的のタンパク質を対照タンパク質から分離する。メーカーの指示に従ってブロッキングおよび抗体インキュベーションを行います。その後、透明なビニール袋に膜ストリップを入れます。P1000ピペットを使用して、膜をECL混合物で覆います。次に袋を密封し、暗闇の中で室温で膜を1〜2分間インキュベートします。次に、膜を含むビニール袋をデジタルイメージングプラットフォームに入れます。化学発光と色分けマーカー検出を使用して、膜のさまざまな露出をキャプチャします。画像解析ソフトウェア、または視覚観察を用いて、どの細胞株が最も標的タンパク質を発現しているかを決定する。この細胞株の連続希釈を免疫化した後、画像解析ソフトウェアを用いて露光画像を開きます。長方形選択ツールを使用して、ゲルの最初のレーンを選択します。その後、分析に行き、ゲル化し、最初のレーンを選択します。矩形選択ツールを次のレーンに移動してこのプロセスを繰り返し、解析、ゲル化、次のレーンの選択に進みます。次に、分析、ゲル、プロットレーンに移動します。各ピークのベースを横切って線を引く場合は、直線ツールを使用してバックグラウンドノイズを除去します。次に、杖ツールを使用して各ピークを選択し、結果ウィンドウから各ピークのバンド強度を取得します。密度測定出力を使用して、各一次抗体にロードされた総タンパク質の量に対してバンド強度の散布図を作成します。次に、最適な適合と視覚観察のラインを使用して、各抗体の線形ダイナミックレンジの位置を決定します。前に示したように、線状範囲内のバンド強度を生じるタンパク質濃度を選択し、そのタンパク質濃度を用いて全ての細胞系ライセートのイムノブロットを実行します。次に、デジタルスキャンで密度測定を行い、抗体ごとに以前に同定された線形範囲内のシグナルを生み出す露出を選択します。この後、各細胞株の負荷制御バンド強度に対する標的タンパク質バンド強度の比を計算する。最後に、統計ソフトウェアを使用して、IF染色の画像分析から得られた値と、免疫ブロット法から得られた値との間でピアソン相関検定を行う。このプロトコルは、抗アポトーシスタンパク質Bcl-2の相対量を決定するIFの能力を確認するために使用された。一次抗体の様々な希釈を免疫組織染色剤を用いてヒト扁桃組織で試験した。この実験では、1~50希釈が、バックグラウンドノイズの少ない強い信号を生み出す最適な希釈であると判断されました。この希釈は、免疫蛍光によって細胞株TMAを染色するために使用され、画像解析を用いてBcl-2に起因する細胞質Cy5シグナルを定量化した。試験細胞株のイムノブロットに基づいて、グランタ-519はBcl-2の最大の豊富さを有していた。次に、グランタ-519溶解物の連続希釈のイムノブロットを使用して、Bcl-2の線形ダイナミックレンジを見つけ、タンパク質GAPDHを制御した。このアッセイにおけるBcl-2のダイナミックレンジは、バンド強度が0近く、7500単位に及んだ。GAPDH のダイナミック レンジは 3000 ~ 6500 単位です。イムノブロットを、その線形範囲内の曝露で繰り返した。また、GAPDHに対するBcl-2の比率を各細胞株について計算した。ピアソン相関試験では、免疫ブロッティングからの強度比が、定量IFの強度測定値と強く、肯定的に相関していることを実証した。この手順を試みる間、すべてのバンドがそれぞれの線形範囲内にある最適な露出を見つけるためには、複数の時間ポイントの最終膜を露出することを覚えておくことが重要です。IFプロトコルの定量的性質を検証した後、標的タンパク質が発現する場所などの臨床問題に答えるために日常的に処理された組織サンプルにおいて、多重化IFについて改変することができる。

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

アクチン共沈降アッセイ、F -アクチンへの結合タンパク質の解析のための

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

の定量的比較シス</emトランスジェニックで> -調節エレメント（CRE）の活動キイロショウジョウバエ</em

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

定量的なフィットネスの分析ワークフロー

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

リボソーム結合したポリペプチドを単離するためのツールと​​してSECM逮捕シーケンスを使用して、

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

定量的RT-PCRによって個々のヒト胚性幹細胞のプロファイリング

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

中心体におけるタンパク質レベルの変化を測定するための定量的免疫蛍光アッセイ

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

細胞株および組織試料中の脱ユビキチン化酵素の活性を測定する方法

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

ホルマリン固定パラフィン包埋参照標準細胞株にBRAF V600E変異を検出するデジタルドロップレットPCRを採用

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

内因性の免疫蛍光分析および外因性セントロメア、動原体タンパク質

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

ギャップ結合細胞間コミュニケーション：毒物および毒素の有害効果を評価するための機能バイオマーカー、および天然物の健康上の利点

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

ルーチン組織試料中のバイオ マーカー タンパク質を定量化するため, 蛍光抗体法を検証するための標準として細胞の定量的免疫ブロット

ルーチン組織試料中のバイオマーカータンパク質を定量化するため, 蛍光抗体法を検証するための標準として細胞の定量的免疫ブロット