Name: quantitative immunoblotting of cell lines as a standard to validate immunofluorescence for quantifying biomarker proteins in routine tissue samples
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Immunoblotting of Cell Lines as a Standard to Validate Immunofluorescence for Quantifying Biomarker Proteins in Routine Tissue Samples at JoVE.co

이 작품은 프레드릭 밴팅과 찰스 베스트 캐나다 대학원 장학금 (오전)에 의해 부분적으로 투자 되었다.

기본 인간의 조직 샘플을 사용 하 여 승인 보건 복지부 산하 교육 병원 연구 윤리 위원회 (HSREB) 여왕의 대학에서 얻은 했다.
1. 건물 셀 라인 조직 Microarray (TMA)
<ol><li>수확 하 고 세포를 씻어. 참고:이 프로토콜 (예: 헬러, Jurkat, RCH ACV) 다양 한 설립된 불멸 하 게 셀 라인에서 테스트 되었습니다.<ol>
<li>부착 세포, 그들은 약 80 %confluency 도달 약 1.3 x 107 셀을 수확. ...

<ol>
	<li>Khoury, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+Immunohistochemical+Assays+for+Integral+Biomarkers+in+the+NCI-MATCH+EAY131+Clinical+Trial.">Validation of Immunohistochemical Assays for Integral Biomarkers in the NCI-MATCH EAY131 Clinical Trial.</a> Clinical Cancer Research. 24 (3), 521-531 (2018).</li><li>Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G. L., da Silva Pinhal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+as+an+important+tool+in+biomarkers+detection+and+clinical+practice.">Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice.</a> Biomarker insights. 5, 9-20 (2010).</li><li>Seidal, T., Balaton, A. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Two+ELISA+Methods+and+Mass+Spectrometry+for+Measurement+of+Vitamin+D-Binding+Protein:+Implications+for+the+Assessment+of+Bioavailable+Vitamin+D+Concentrations+Across+Genotypes.">Comparison of Two ELISA Methods and Mass Spectrometry for Measurement of Vitamin D-Binding Protein: Implications for the Assessment of Bioavailable Vitamin D Concentrations Across Genotypes.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 31 (6), 1128-1136 (2016).</li><li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+immunohistochemistry,+imaging,+and+quantitation:+A+review,+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification,+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis.">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li><li>Peck, A. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+Practical+Methods+for+Tissue+Microarray+Construction.">De Practical Methods for Tissue Microarray Construction.</a> Methods in Molecular Medicine. , 89-101 (2005).</li><li>Kajimura, J., Ito, R., Manley, N. R., Hale, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Single-+and+Dual-Color+Immunofluorescence+Protocols+for+Formalin-Fixed,+Paraffin-Embedded+Archival+Tissues.">Optimization of Single- and Dual-Color Immunofluorescence Protocols for Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Archival Tissues.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 64 (2), 112-124 (2016).</li><li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blot:+technique,+theory,+and+trouble+shooting.">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> North American journal of medical sciences. 4 (9), 429-434 (2012).</li><li>Wiedemann, M., Lee, S. J., da Silva, R. C., Visweswaraiah, J., Soppert, J., Sattlegger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+semi-dry+electrophoretic+transfer+of+a+wide+range+of+differently+sized+proteins+for+immunoblotting.">Simultaneous semi-dry electrophoretic transfer of a wide range of differently sized proteins for immunoblotting.</a> Nature Protocol Exchange. , (2013).</li><li>Delbridge, A. R. D., Grabow, S., Strasser, A., Vaux, D. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+expression+of+Bcl-2+predicts+poor+outcome+in+diffuse+large+B-cell+lymphoma+patients+with+low+international+prognostic+index+receiving+R-CHOP+chemotherapy.">High expression of Bcl-2 predicts poor outcome in diffuse large B-cell lymphoma patients with low international prognostic index receiving R-CHOP chemotherapy.</a> International Journal of Hematology. 103 (2), 210-218 (2016).</li><li>. The Human Protein Atlas BCL2 Available from: <a target="_blank" href="https://www.proteinatlas.org/ENSG00000171791-BCL2/cell#rna">https://www.proteinatlas.org/ENSG00000171791-BCL2/cell#rna</a> (2018)</li><li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+multiplex+immunofluorescence+panels+using+multispectral+microscopy+for+immune-profiling+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+human+tumor+tissues.">Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).</li><li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Guide+to+Modern+Quantitative+Fluorescent+Western+Blotting+with+Troubleshooting+Strategies.">A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).</li><li>Zellner, M., Babeluk, R., Diestinger, M., Pirchegger, P., Skeledzic, S., Oehler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+Western+blotting+for+quantitation+of+protein+biomarkers+in+clinical+samples.">Fluorescence-based Western blotting for quantitation of protein biomarkers in clinical samples.</a> ELECTROPHORESIS. 29 (17), 3621-3627 (2008).</li><li>Parra, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Platforms+of+Multiplexed+Immunofluorescence+for+Study+of+Paraffin+Tumor+Tissues.">Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues.</a> Journal of Cancer Treatment &amp; Diagnostics. 2 (1), 43-53 (2018).</li><li>Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunofluorescence+labelling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+tissue.">Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BMC Cell Biology. 9 (1), 13 (2008).</li></ol>

메서드를 설명 하는 우리가 사용 하는 양적 immunoblotting (IB)의 면역 형광 검사 (면)의 유틸리티를 보여 FFPE 조직 샘플에서 대상 단백질의 관계 되는 풍부를 ascertaining에 대 한. 현재 단백질 정량화 방법 비 IHC2,3, 등 그들의 명백한 자연 또는 균질 샘플, 샘플 구조와 세포 인구에 대 한 조사와 같은 방지 하는 필요에 의해 제한 됩니다. IB 및 질량 분석<sup class="...

포 르 말린 조정의 파라핀 끼워 넣어진 (FFPE) 조직 생 검 견본에 있는 단백질을 정할 필요가 많은 임상 분야에 존재 합니다. 예를 들어 일상적인 생 검 표본에서 바이오 마커 단백질의 정량화는 암 환자1에 대 한 치료 예 후를 명료 하 사용 됩니다. 그러나, 현재 메서드는 일반적으로 주관적 및 유효성 검사 부족.
Immunohistochemistry (IHC) 병 리 실험실에서 일상적으로 사용 되 고 일반적으로 1 차적인 항 체 대상 단백질에 지시 및 양 고추냉이 과산화 효소2등 효소 상표로 활용 된 이차 항 체에 따라 달라 집니다. 기존의 IHC 구분, 만들 수 있습니다 사용 분의 샘플링 하 고 그로 인하여 그것의 관련 조직학 컨텍스트 내에서 단백질 식의 평가 허용 하는 조직 샘플의 형태학 무결성을 보존 한다. 그러나, IHC에 의해 생성 된 비 신호 빼기 때문에, 그것은 상대적으로 좁은 동적 범위에서 겪고 있다 고 멀티플렉싱2,,34에 대 한 제한 된 잠재력을 제공. 매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 질량 분석기 (MALDI-MSI) 이미징 형태학의 무결성을 유지 합니다. 그러나,이 개발 기술 겸손 형태학 해상도와 연결 하며 중요 한 보정 및 정규화, 일상 임상 사용5,,67에 대 한 그것의 타당성을 방해. 단백질 조직 샘플에서 계량을 대체 기술을 포함 immunoblotting8,11, 질량 분석의9,10,및 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA)12, 각 이 무 균으로 시작의 샘플 조직의 lysate. 기본 조직 샘플은 다른 유형의 다양 한 세포 유형 포함. 따라서, 조직 샘플 수반 기법 암 세포 같은 관심의 특정 세포 인구에서 단백질의 정량화를 허용 하지 않습니다.
IHC, 만약에 작은 적용 됩니다 처럼 FFPE 샘플링 하 고 조직학 무결성13의 보존 합니다. 그러나, 덕분에 형광 신호, 첨가제 자연 경우 의무가 여러 기본 항 체와 형광 라벨의 응용 프로그램입니다. 따라서, 관심사의 단백질 특정 셀 또는 세포질 구획 (예를 들어 핵 및 세포질) 다른 항 체를 사용 하 여 정의 내에서 상대적으로 측정할 수 있습니다. 형광 신호는 또한 더 큰 동적 범위13,14의 이점을. 우수성, 재현성, 및의 멀티플렉싱 잠재력 FFPE 샘플에 적용 하는 경우 시연된13,,1415되었습니다.
여기 우리 골드 표준으로 설립된 셀 라인을 사용 하 여 만약에 관심사의 단백질의 관계 되는 풍부를 결정에서 컴퓨터 기반 이미지 분석의 양적 성격을 확인 하는 양적 immunoblotting의 사용 설명 FFPE 조직 샘플에서 조직학 섹션입니다. 우리는 성공적으로 임상 생 샘플16,,1718바이오 마커 단백질을 계량 하는 다중 접근에서이 메서드를 적용 했습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:675px;" width="673">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">697</td>
			<td style="width:116px;">DSMZ</td>
			<td style="width:123px;">ACC 42</td>
			<td style="width:213px;">Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">JeKo-1</td>
			<td style="width:116px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">CRL-3006</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Jurkat</td>
			<td style="width:116px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">TIB-152</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">RCH-ACV</td>
			<td style="width:116px;">DSMZ</td>
			<td style="width:123px;">ACC 548</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Granta-519</td>
			<td style="width:116px;">DSMZ</td>
			<td style="width:123px;">ACC 342</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">REH</td>
			<td style="width:116px;">DSMZ</td>
			<td style="width:123px;">ACC 22</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Raji</td>
			<td style="width:116px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">CCL-86</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">HeLa</td>
			<td style="width:116px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">CCL-2</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Trypsin/EDTA solution</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">R001100</td>
			<td>For detaching adhesive cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:116px;">Wisent Inc.</td>
			<td style="width:123px;">81150</td>
			<td>To neutralize trypsin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Neutral Buffered Formalin</td>
			<td style="width:116px;">Protocol</td>
			<td style="width:123px;">245-684</td>
			<td>For fixing cell pellets</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">UltraPure low melting point agarose</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">15517-022</td>
			<td>For casting cell pellets</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">Mouse monoclonal anti-human Bcl-2 antibody, clone 124</td>
			<td style="width:116px;">Dako (Agilent)</td>
			<td style="width:123px;">cat#: M088729-2, RRID: 2064429</td>
			<td style="width:213px;">To detect Bcl-2 by immunoflourencence and immunoblot (lot#:&#160;00095786</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Ventana Discovery XT</td>
			<td style="width:116px;">Roche</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:213px;">For automation of immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-mouse)</td>
			<td style="width:116px;">Dako (Agilent)</td>
			<td style="width:123px;">K4000</td>
			<td style="width:213px;">For immunofluorescence signal amplification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-rabbit)</td>
			<td style="width:116px;">Dako (Agilent)</td>
			<td style="width:123px;">K4002</td>
			<td style="width:213px;">For immunofluorescence signal amplification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Cyanine 5 tyramide reagent</td>
			<td style="width:116px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:123px;">NEL745001KT</td>
			<td style="width:213px;">For immunofluorescence signal amplification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Aperio ImageScope</td>
			<td style="width:116px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:213px;">To view scanned slides</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">HALO image analysis software</td>
			<td style="width:116px;">Indica Labs</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:213px;">For quantification of immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">Protease inhibitors (Halt protease inhibitor cocktail, 100X)</td>
			<td style="width:116px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">1862209</td>
			<td>To add to RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:116px;">BioShop</td>
			<td style="width:123px;">EDT001</td>
			<td>For RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">NP-40</td>
			<td style="width:116px;">BDH Limited</td>
			<td style="width:123px;">56009</td>
			<td>For RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D6750</td>
			<td>For RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Glycerol</td>
			<td style="width:116px;">FisherBiotech</td>
			<td style="width:123px;">BP229</td>
			<td>For Laemlli buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:116px;">BioShop</td>
			<td style="width:123px;">BRO777</td>
			<td>For Laemlli buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:116px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">161-0611</td>
			<td>For Laemlli buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:116px;">BioShop</td>
			<td style="width:123px;">ALB001</td>
			<td>For immunoblot washes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Protein ladder (Precision Plus Protein Dual Color Standards)</td>
			<td style="width:116px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">161-0374</td>
			<td>For running protein gel</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Filter paper (Extra thick blot paper)</td>
			<td style="width:116px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">1703969</td>
			<td>For blotting transfer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Nitrocellulose membrane</td>
			<td style="width:116px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">162-0115</td>
			<td>For blotting transfer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Trans-blot SD semi-dry transfer cell</td>
			<td style="width:116px;">Bio-Rad</td>
			<td>1703940</td>
			<td>For semi-dry transfer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Skim milk powder (Nonfat dry milk)</td>
			<td style="width:116px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:123px;">9999S</td>
			<td>For blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Tween 20</td>
			<td style="width:116px;">BioShop</td>
			<td style="width:123px;">TWN510</td>
			<td>For wash buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">GAPDH rabbit monoclonal antibody</td>
			<td style="width:116px;">Epitomics</td>
			<td style="width:123px;">2251-1</td>
			<td style="width:213px;">Primary antibody of control protein (lot#: YE101901C)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) antibody</td>
			<td style="width:116px;">abcam</td>
			<td style="width:123px;">cat#: ab6789, RRID: AB_955439</td>
			<td style="width:213px;">Secondary antibody for immunoblot</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">Goat anti-rabbit IgG (HRP conjugated) antibody</td>
			<td style="width:116px;">abcam</td>
			<td style="width:123px;">cat#: ab6721, RRID: AB_955447</td>
			<td style="width:213px;">Secondary antibody for immunoblot (lot#: GR3192725-5)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Clarity Western ECL substrates</td>
			<td style="width:116px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">1705060</td>
			<td style="width:213px;">For immunoblot signal detection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Amersham Imager 600</td>
			<td style="width:116px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">29083461</td>
			<td>For immunoblot signal detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:116px;">Freeware, NIH</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td>For densitometry analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative immunoblotting of cell lines as a standard to validate immunofluorescence for quantifying biomarker proteins in routine tissue samples

포 르 말린 조정의 파라핀 끼워 넣어진 조직 샘플 (FFPE)에 관심사의 단백질의 정량화는 임상에서 중요 한 응용 프로그램을 연구 하는 고. 정량화 하는 최적의 방법 정확 하 고 광범위 한 선형 동적 범위를가지고 개별 세포 유형의 식별 수 있도록 샘플의 구조적 무결성을 유지 합니다. Immunohistochemistry (IHC), 질량 분석 등 immunoblotting 현재 방법 각 그들의 범주 특성상 이러한 규정에 맞게 실패 또는 샘플을 균질 필요가 있다. 대체 방법으로 우리는 면역 형광 검사 (IF) 및 FFPE 조직에 관심사의 단백질의 관계 되는 풍부를 결정 하기 위해 이미지 분석의 사용을 제안 합니다. 여기이 방법은 쉽게 최적화 된 넓은 동적 범위를 산출 및 선형 양적 immunoblotting의 황금 표준에 비해 정량은 설명 합니다. 또한,이 메서드는 샘플의 구조적 무결성의 유지 관리를 허용 하 고 진단 응용 프로그램에 중요 한 있을 수 있습니다 다양 한 세포 유형의 구별 허용 합니다. 전반적으로,이 FFPE 샘플에 있는 단백질의 상대적 정량화에 대 한 강력한 방법 이며 임상 적응 하거나 요구를 연구에 쉽게 적용할 수 있습니다.

이 프로토콜 FFPE 직물 구획으로 만든 셀 라인에서 안티-apoptotic 단백질 Bcl-2의 상대 수량을 결정 하는 경우의 기능 확인을 위해 사용 되었다. 암 세포에 선택적으로 측정 Bcl-2 종양 메커니즘을 명료 하 게 수 고 병 적인 진단 및 임상 관리 결정24알리는에서 유용할 수 있습니다. 좀 더 구체적으로, Bcl-2 적절 한 B-lymphocyte 개발에 역할 그리고의 식은 일반적으로...

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Quantitative Immunoblotting of Cell Lines as a Standard to Validate Immunofluorescence for Quantifying Biomarker Proteins in Routine Tissue Samples

면역 형광 측정 바이오 마커 단백질 일상적인 조직 샘플에 대 한 유효성을 검사 하는 표준으로 세포의 양적 Immunoblotting

포 르 말린 조정의 파라핀 끼워 넣어진 조직 샘플 (FFPE)에 관심사의 단백질을 측정 하는 수단으로 이미지 분석와 결합 하 여 면역 형광 조직학 유효성을 양적 immunoblotting 사용 하 여를 설명 합니다. 우리의 결과 일상적인 생 검 견본에 있는 바이오 마커 단백질의 상대적 수량을 ascertaining에 대 한 면역 형광 조직학의 유틸리티를 보여 줍니다.

Quantification of proteins of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples is important in clinical and research applications. An ...

이 방법은 일상적으로 처리된 생검 물질에서 바이오마커 단백질을 정량화함으로써 암 병리학 분야에서 중요한 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 종래의 면역히토케와 관련하여 이 기술의 주요 장점은 객관적이고, 넓은 동적 범위를 가지며, 특정 세포 유형에서 단백질의 정량화를 허용한다는 것이다. 특정 소위 바이오마커 단백질의 존재 또는 부재, 또는 특히, 암 생검 표본에 있는 그 단백질의 상대적인 풍부는 암의 특정 종류의 특정 병리 진단을 만드는 데 매우 유용할 수 있습니다.그러나 그것은 또한 암 처리에 반응을 예측에 유용할 수 있습니다, 그래서 이 기술은 암을 가진 환자의 진단 그리고 처리 둘 다 관련있는 이유입니다. 이 프로토콜은 주로 면역 형광 기반 분석의 정량적 특성을 검증하기 위해 불멸의 세포주에서 단백질 정량화를 사용하는 방법에 관한 것입니다. 그러나 면역 형광이 쉽게 멀티플렉스 접근 방식에 통합되고 1 차생검 샘플에 적용 될 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.이 절차를 지원하고 시연하는 것은 기술자인 리 부드로와 운영 책임자인 셰이켈 버크(Shakeel Virk)가 될 것입니다. 분자 병리학을 위한 여왕의 실험실에서 둘 다. 시작하려면, 원심 분리는 5 분 동안 225 Gs에서 50 밀리리터 원추형 튜브에서 이전에 수확 된 세포를 원심 분리합니다.슈퍼 나탄을 데칭하고, PBS의 10 밀리리터에서 세포 펠릿을 재중단. 그런 다음, 5 분 동안 225 Gs에서 다시 중단 된 세포를 원심 분리합니다. 10%NBF의 10 밀리리터로 세포 펠릿을 중단하십시오.그런 다음 하룻밤 동안 24 개의 RM에서 로커의 실온에서 세포를 배양합니다. 세포를 고정한 후, 세포를 225 Gs에서 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상체를 제거하고 PBS의 500 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단합니다.세포를 1.5 밀리리터 미세원심분리기 튜브로 옮기고 원심분리를 통해 세포를 펠릿한다. 그런 다음, 슈퍼 나티를 흡인. 세포를 포함하는 각 관에 1%아가로즈 용액의 약 500마이크로리터를 추가합니다.그런 다음 혼합물을 위아래로 피펫하여 혼합합니다. 아가로즈 세포 용액이 경화된 후 튜브에 10%NBF의 1밀리리터를 추가합니다. 나중에 샘플에서 NBF를 제거합니다.면도날을 사용하여 셀 플러그를 제거하고 플러그를 플라스틱 조직 카세트에 넣습니다. 자동화된 조직 프로세서로 밤새 샘플을 처리합니다. 그런 다음 표준 조직학 방법을 사용하여 파라핀 왁스에 샘플을 포함시킴을 포함시킴이에 포함시킴이 에 포함시킴이 에 포함됩니다.티슈 어레이 기악기를 사용하여 파라핀 블록에서 6mm 코어를 복제하여 빈 파라핀 블록에 삽입합니다. 그 후, 마이크로토메를 사용하여 새로 생성된 세포주 TMA의 두 가지 조직학적 섹션을 준비합니다. 그런 다음 연수 슬라이드에 섹션을 장착하고 분리합니다.첫째, 셀라인 TMA의 두 슬라이드를 자동화된 염색 시스템에 로드합니다. 최적의 1차 항체 희석을 가진 한쪽에 얼룩을 남기고, 다른 한쪽은 음수 대조군 슬라이드로 남게 한다. 두 슬라이드에 핵 카운터스테인 및 이차 항체를 적용하십시오.염색 공정 후 티라미드 신호 증폭 시약을 추가합니다. 그 후, 사용된 형광에 대한 적절한 흥분 및 검출 파장을 사용하여 면역스테인드 슬라이드를 스캔한다. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 핵 또는 세포질 여부에 관계없이 관심있는 셀룰러 구획을 식별하고 각 라인에 대한 평균 형광 강도 또는 MFI를 정량화합니다.대상 단백질의 가장 큰 풍부를 가지고 있는 세포주가 있는지 를 결정하기 위해, aliquot는 귀중한 준비된 세포가 미세 원심분리기 튜브로 lysate합니다. 그런 다음 6배 의 2.5 마이크로리터를 추가하고 충분한 RIPA 용해 버퍼를 추가하여 총 부피를 15 마이크로리터로 가져옵니다. 다음으로, 단백질 사다리와 SDS 페이지 젤을 적재하고 이전에 준비된 샘플을 로드합니다.이 후, 빈 우물에 완충하로드. 파란색 염료가 접시 바닥에 도달할 때까지 젤을 실행합니다. 반건조 단백질 전달을 수행한 후 면도날을 사용하여 멤브레인을 수평으로 절단하여 관심 있는 단백질과 관심 있는 단백질을 대조단백질과 분리합니다.제조 업체지침에 따라 차단 및 항체 배양을 수행합니다. 그런 다음 멤브레인 스트립을 투명 한 비닐 봉지에 넣습니다. P1000 파이펫을 사용하여 ECL 혼합물로 멤브레인을 덮습니다.그런 다음 가방을 밀봉하고 어둠 속에서 실온에서 멤브레인을 1 ~ 2 분 동안 배양합니다. 다음으로 멤브레인이 들어 있는 비닐 봉지를 디지털 이미징 플랫폼에 배치합니다. 화학 발광 및 색마커 검출을 사용하여 멤브레인의 다양한 노출을 캡처합니다.이미지 분석 소프트웨어 또는 시각적 관찰을 사용하여 가장 타겟 단백질을 표현하는 세포주가 결정됩니다. 이 셀라인의 직렬 희석을 면역한 후 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 노출 이미지를 엽니다. 직사각형 선택 도구를 사용하여 젤의 첫 번째 차선을 선택합니다.그런 다음 분석, 젤 및 첫 번째 차선을 선택하십시오. 직사각형 선택 도구를 다음 차선으로 이동하여 이 프로세스를 반복하고 분석, 젤 및 다음 차선을 선택합니다. 다음으로, 분석, 젤 및 플롯 레인으로 이동합니다.직선 도구를 사용하여 각 피크의 베이스를 가로질러 선을 그려 배경 노이즈를 제거합니다. 그런 다음 지팡이 도구를 사용하여 각 피크를 선택하고 결과 창에서 각 피크의 대역 강도를 가져옵니다. 밀도 측정 출력을 사용하여 각 1차 항체에 대해 로드된 총 단백질의 양에 비해 밴드 강도의 산란플롯을 만듭니다.그런 다음, 각 항체의 선형 동적 범위의 위치를 결정하기 위해 가장 적합하고 시각적 관찰의 라인을 사용합니다. 선형 범위 내에서 대역 강도를 산출하는 단백질 농도를 선택하고, 이전에 설명한 바와 같이, 그 단백질 농도로 모든 세포주의 면역blot를 수행한다. 다음으로, 디지털 스캔에서 밀도를 수행하여 각 항체에 대해 이전에 확인된 선형 범위 내에서 신호를 산출하는 노출을 선택합니다.그 후, 각 세포주에 대한 제어 대역 강도를 적재하는 표적 단백질 대역 강도의 비율을 계산한다. 마지막으로 통계 소프트웨어를 사용하여 IF 염색의 이미지 분석에서 얻은 값과 면역 블로팅에서 얻은 값 간의 Pearson 상관 관계 테스트를 수행합니다. 이 프로토콜은 항 세포 단백질 Bcl-2의 상대적 양을 결정하는 IF의 능력을 확인하기 위해 사용되었다.1 차적인 항체의 변화하는 희석은 면역 조직학 얼룩을 가진 인간 편도선 조직에 시험되었다. 이 실험의 경우 1~50개의 희석이 배경 잡음이 거의 없는 강력한 신호를 산출한 최적의 희석으로 결정되었습니다. 이러한 희석은 면역형광에 의해 세포주 TMA를 염색하는 데 사용되었고, 영상 분석은 Bcl-2에 기인하는 세포질 Cy5 신호를 정량화하기 위해 사용되었다.모든 테스트 된 세포주를 위한 면역 블롯을 기반으로, 그랜타-519Bcl-2의 가장 큰 풍부했다. 그란타-519 용액의 직렬 희석의 면역블롯은 Bcl-2의 선형 동적 범위를 찾아단백질 GAPDH를 조절하는 데 사용되었다. 이 분석기에서 Bcl-2의 다이나믹 레인지는 거의 0의 밴드 강도에서 7500 단위에 이르기까지 다양했습니다.GAPDH의 다이나믹 범위는 3000대에서 6500대까지 다양했다. 면역블롯은 선형 범위 내에서 노출과 함께 반복되었다. 그리고 Bcl-2 대 GAPDH의 비율은 각 세포주에 대해 계산되었다.Pearson 상관 관계 테스트는 면역 blotting의 강도 비율이 양적 IF의 강도 측정과 강하게 긍정적으로 상관관계가 있음을 입증했습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 모든 밴드가 각각의 선형 범위 내에 있는 최적의 노출을 찾기 위해 여러 시간 지점에 대한 최종 멤브레인을 노출하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. IF 프로토콜의 정량적 특성을 검증한 후, 표적 단백질이 발현되는 곳과 같은 임상 질문에 답하기 위해 일상적으로 처리된 조직 샘플에서 멀티플렉스 IF를 위해 수정될 수 있다.

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

굴지 공동 침강 분석, F - 굴지에 바인딩 단백질의 분석

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

연구

생물학

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

의 양적 비교 CIS</em트렌스 제닉에서> - 규제 요소 (CRE) 활동 Drosophila melanogaster</em

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

양적 휘트니스 분석 워크플로우

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Ribosome 바운드 Polypeptides을 파악하는 도구로 SecM 체포 시퀀스를 사용하여

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

정량적 RT-PCR에 의해 개별 인간 배아 줄기 세포를 프로파일 링

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

정량 면역 형광 분석은 중심체에서 단백질 수준의 변화를 측정하기 위해

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

세포주 및 조직 샘플에서 Deubiquitinating 효소의 활성을 측정 방법

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

디지털 물방울 PCR은 포르말린 고정 파라핀 포함 된 참조 표준 세포주에서 BRAF의 V600E 돌연변이를 검출하기 위해 채용

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

내생의 면역 형광 분석 및 외인성 센트로 - 동원체 단백질

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

갭 접합부 세포 간 통신 : 천연 제품의 독성 물질과 독소의 반작용을 평가하기위한 기능성 바이오 마커, 보건 혜택

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...