Name: quantitative immunoblotting of cell lines as a standard to validate immunofluorescence for quantifying biomarker proteins in routine tissue samples
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Immunoblotting of Cell Lines as a Standard to Validate Immunofluorescence for Quantifying Biomarker Proteins in Routine Tissue Samples at JoVE.co

Dette arbeidet var delvis finansiert av Fredrick Banting og Charles Best Canada Graduate Scholarship (am).

Godkjenning for bruk primære menneskelige vevsprøver ble innhentet fra Health Sciences og tilknyttet undervisning sykehus forskning etikk Board (HSREB) ved Queen's University.
1. bygge et cellen linje vev Microarray (TMA)
<ol><li>Harvest og vask celler. Merk: Denne protokollen er testet på ulike etablerte udødeliggjort cellelinjer (f.eks HeLa, Jurkat, RCH-ACV).<ol>
<li>For tilhenger celler, høste ca 1,3 x 107 celler når de når ca 80% confluency. Koble celler ved...

<ol>
	<li>Khoury, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+Immunohistochemical+Assays+for+Integral+Biomarkers+in+the+NCI-MATCH+EAY131+Clinical+Trial.">Validation of Immunohistochemical Assays for Integral Biomarkers in the NCI-MATCH EAY131 Clinical Trial.</a> Clinical Cancer Research. 24 (3), 521-531 (2018).</li><li>Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G. L., da Silva Pinhal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+as+an+important+tool+in+biomarkers+detection+and+clinical+practice.">Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice.</a> Biomarker insights. 5, 9-20 (2010).</li><li>Seidal, T., Balaton, A. J., Battifora, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+and+quantification+of+immunostains.">Interpretation and quantification of immunostains.</a> The American journal of surgical pathology. 25 (9), 1204-1207 (2001).</li><li>Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+brown+cannot+do+for+you.">What brown cannot do for you.</a> Nature Biotechnology. 24 (8), 914-916 (2006).</li><li>Bokhart, M. T., Rosen, E., Thompson, C., Sykes, C., Kashuba, A. D. M., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mass+spectrometry+imaging+of+emtricitabine+in+cervical+tissue+model+using+infrared+matrix-assisted+laser+desorption+electrospray+ionization.">Quantitative mass spectrometry imaging of emtricitabine in cervical tissue model using infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (8), 2073-2084 (2015).</li><li>Porta, T., Lesur, A., Varesio, E., Hopfgartner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+in+MALDI-MS+imaging:+what+can+we+learn+from+MALDI-selected+reaction+monitoring+and+what+can+we+expect+for+imaging?.">Quantification in MALDI-MS imaging: what can we learn from MALDI-selected reaction monitoring and what can we expect for imaging?.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (8), 2177-2187 (2015).</li><li>Rzagalinski, I., Volmer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+low+molecular+weight+compounds+by+MALDI+imaging+mass+spectrometry+&#8211;+A+tutorial+review.">Quantification of low molecular weight compounds by MALDI imaging mass spectrometry &#8211; A tutorial review.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1865 (7), 726-739 (2017).</li><li>Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Western+blots:+Pitfalls+of+densitometry.">Quantifying Western blots: Pitfalls of densitometry.</a> ELECTROPHORESIS. 30 (11), 1845-1855 (2009).</li><li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics.">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li><li>Burgess, M. W., Keshishian, H., Mani, D. R., Gillette, M. A., Carr, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+and+efficient+quantification+of+low-abundance+proteins+at+very+high+multiplex+via+targeted+mass+spectrometry.">Simplified and efficient quantification of low-abundance proteins at very high multiplex via targeted mass spectrometry.</a> Molecular &amp; cellular proteomics: MCP. 13 (4), 1137-1149 (2014).</li><li>Carr, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+peptide+measurements+in+biology+and+medicine:+best+practices+for+mass+spectrometry-based+assay+development+using+a+fit-for-purpose+approach.">Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach.</a> Molecular &amp; cellular proteomics: MCP. 13 (3), 907-917 (2014).</li><li>Denburg, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Two+ELISA+Methods+and+Mass+Spectrometry+for+Measurement+of+Vitamin+D-Binding+Protein:+Implications+for+the+Assessment+of+Bioavailable+Vitamin+D+Concentrations+Across+Genotypes.">Comparison of Two ELISA Methods and Mass Spectrometry for Measurement of Vitamin D-Binding Protein: Implications for the Assessment of Bioavailable Vitamin D Concentrations Across Genotypes.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 31 (6), 1128-1136 (2016).</li><li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+immunohistochemistry,+imaging,+and+quantitation:+A+review,+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification,+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis.">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li><li>Peck, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+tumor+protein+marker+quantification+by+two+independent+automated+immunofluorescence+image+analysis+platforms.">Validation of tumor protein marker quantification by two independent automated immunofluorescence image analysis platforms.</a> Modern pathology: an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 29 (10), 1143-1154 (2016).</li><li>Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proof+of+the+quantitative+potential+of+immunofluorescence+by+mass+spectrometry.">Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry.</a> Laboratory Investigation. 97 (3), 329-334 (2017).</li><li>AlJohani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abundant+expression+of+BMI1+in+follicular+lymphoma+is+associated+with+reduced+overall+survival.">Abundant expression of BMI1 in follicular lymphoma is associated with reduced overall survival.</a> Leukemia and Lymphoma. 59 (9), 2211-2219 (2018).</li><li>Wood, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abundant+expression+of+interleukin-21+receptor+in+follicular+lymphoma+cells+is+associated+with+more+aggressive+disease.">Abundant expression of interleukin-21 receptor in follicular lymphoma cells is associated with more aggressive disease.</a> Leukemia and Lymphoma. 54 (6), 1212-1220 (2013).</li><li>Weberpals, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+application+of+the+Automated+QUantitative+Analysis+(AQUA)+technique+to+quantify+PTEN+protein+expression+in+ovarian+cancer:+A+correlative+study+of+NCIC+CTG+OV.16.">First application of the Automated QUantitative Analysis (AQUA) technique to quantify PTEN protein expression in ovarian cancer: A correlative study of NCIC CTG OV.16.</a> Gynecologic Oncology. 140 (3), 486-493 (2016).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraffin+embedding+tissue+samples+for+sectioning.">Paraffin embedding tissue samples for sectioning.</a> CSH protocols. , (2008).</li><li>Fedor, H. L., Marzo, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+Practical+Methods+for+Tissue+Microarray+Construction.">De Practical Methods for Tissue Microarray Construction.</a> Methods in Molecular Medicine. , 89-101 (2005).</li><li>Kajimura, J., Ito, R., Manley, N. R., Hale, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Single-+and+Dual-Color+Immunofluorescence+Protocols+for+Formalin-Fixed,+Paraffin-Embedded+Archival+Tissues.">Optimization of Single- and Dual-Color Immunofluorescence Protocols for Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Archival Tissues.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 64 (2), 112-124 (2016).</li><li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blot:+technique,+theory,+and+trouble+shooting.">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> North American journal of medical sciences. 4 (9), 429-434 (2012).</li><li>Wiedemann, M., Lee, S. J., da Silva, R. C., Visweswaraiah, J., Soppert, J., Sattlegger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+semi-dry+electrophoretic+transfer+of+a+wide+range+of+differently+sized+proteins+for+immunoblotting.">Simultaneous semi-dry electrophoretic transfer of a wide range of differently sized proteins for immunoblotting.</a> Nature Protocol Exchange. , (2013).</li><li>Delbridge, A. R. D., Grabow, S., Strasser, A., Vaux, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thirty+years+of+BCL-2:+translating+cell+death+discoveries+into+novel+cancer+therapies.">Thirty years of BCL-2: translating cell death discoveries into novel cancer therapies.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (2), 99-109 (2016).</li><li>Bosch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bioclinical+prognostic+model+using+MYC+and+BCL2+predicts+outcome+in+relapsed/refractory+diffuse+large+B-cell+lymphoma.">A bioclinical prognostic model using MYC and BCL2 predicts outcome in relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma.</a> Haematologica. 103 (2), 288-296 (2018).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BCL2+mRNA+or+protein+abundance+is+superior+to+gene+rearrangement+status+in+predicting+clinical+outcomes+in+patients+with+diffuse+large+B-cell+lymphoma.">BCL2 mRNA or protein abundance is superior to gene rearrangement status in predicting clinical outcomes in patients with diffuse large B-cell lymphoma.</a> Hematological Oncology. 35, 288-289 (2017).</li><li>Choi, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+expression+of+Bcl-2+predicts+poor+outcome+in+diffuse+large+B-cell+lymphoma+patients+with+low+international+prognostic+index+receiving+R-CHOP+chemotherapy.">High expression of Bcl-2 predicts poor outcome in diffuse large B-cell lymphoma patients with low international prognostic index receiving R-CHOP chemotherapy.</a> International Journal of Hematology. 103 (2), 210-218 (2016).</li><li>. The Human Protein Atlas BCL2 Available from: <a target="_blank" href="https://www.proteinatlas.org/ENSG00000171791-BCL2/cell#rna">https://www.proteinatlas.org/ENSG00000171791-BCL2/cell#rna</a> (2018)</li><li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+multiplex+immunofluorescence+panels+using+multispectral+microscopy+for+immune-profiling+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+human+tumor+tissues.">Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).</li><li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Guide+to+Modern+Quantitative+Fluorescent+Western+Blotting+with+Troubleshooting+Strategies.">A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).</li><li>Zellner, M., Babeluk, R., Diestinger, M., Pirchegger, P., Skeledzic, S., Oehler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+Western+blotting+for+quantitation+of+protein+biomarkers+in+clinical+samples.">Fluorescence-based Western blotting for quantitation of protein biomarkers in clinical samples.</a> ELECTROPHORESIS. 29 (17), 3621-3627 (2008).</li><li>Parra, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Platforms+of+Multiplexed+Immunofluorescence+for+Study+of+Paraffin+Tumor+Tissues.">Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues.</a> Journal of Cancer Treatment &amp; Diagnostics. 2 (1), 43-53 (2018).</li><li>Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunofluorescence+labelling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+tissue.">Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BMC Cell Biology. 9 (1), 13 (2008).</li></ol>

Vi har beskrevet en metode som gjør bruk av kvantitative immunoblotting (IB) for å demonstrere nytten av immunofluorescence (hvis) for konstatere relative overflod av et mål protein i FFPE vevsprøver. Gjeldende protein kvantifisering metoder er begrenset av deres kategoriske natur, som kromogent IHC2,3, eller behovet for å homogenize prøver, forebygge etterforskning eksempel struktur og celle populasjoner, som IB og massespektrometri8</sup...

Behovet for å kvantifisere proteiner i formalin-fast, parafin-embedded (FFPE) biopsi vevsprøver finnes i mange klinisk felt. For eksempel brukes kvantifisering av biomarkør proteiner i rutinemessig biopsi prøver til å belyse prognose og informere behandling for kreft pasienter1. Imidlertid gjeldende metoder er vanligvis subjektive og mangler validering.
Immunohistochemistry (IHC) brukes rutinemessig i rutinelaboratorier og vanligvis avhenger en primær antistoff rettet mot målet protein og en sekundær antistoff konjugert med en enzymatisk etikett som pepperrot peroxidase2. Konvensjonelle IHC følsom, kan gjøre bruk av minutt prøver og beholder morfologiske integriteten av dermed tillater vurdering av protein uttrykk i relevante histologiske konteksten. Men fordi kromogent signalet generert av IHC subtraktiv, det lider et relativt lite dynamisk område og tilbyr begrenset potensial for multiplexing2,3,4. Matrix-assistert laser desorpsjon/ionisering massespektrometri imaging (MALDI-MSI) beholder morfologiske integritet. Men denne utvikle teknologien er forbundet med beskjedne morfologiske oppløsning og krever betydelig kalibrering og normalisering, svekker sine mulighetsstudie for rutinemessige klinisk bruk5,6,7. Alternative teknikker å kvantifisere protein i vevsprøver inkluderer immunoblotting8, massespektrometri9,10,11og enzym knyttet immunosorbent analysen (ELISA)12, hver av som begynner med en homogenisert lysate av prøven vev. Primære vevsprøver er heterogene ved at de inneholder en rekke celletyper. Derfor tillater teknikker som innebærer homogenisere prøvene ikke kvantifisering av et protein i en bestemt celle befolkning av interesse, slik som kreftceller.
Som IHC, hvis aktuelt for små FFPE prøver og tillater oppbevaring av histologiske integritet13. Men takket være additiv natur fluorescens signaler, hvis er mottakelig for anvendelse av flere primære antistoffer og fluorescerende etiketter. Dermed kan et protein av interesse være relativt kvantifisert i bestemte celler eller cellular avdelinger (for eksempel kjernen versus cytoplasma) defineres ved hjelp av andre antistoffer. Fluorescens signaler har også fordelen av en større dynamisk område13,14. Den overlegenhet, reproduserbarhet og multipleksing potensialet i har hvis FFPE prøver vært demonstrert13,14,15.
Her beskriver vi bruk av kvantitative immunoblotting med etablerte cellelinjer som en gullstandard for å fastslå kvantitative natur hvis kombinert med computer-assistert bildeanalyser å bestemme den relative overfloden av et protein av interesse histologiske inndelinger fra FFPE vevsprøver. Vi har brukt denne metoden i en multiplex tilnærming til kvantifisere biomarkør proteiner i klinisk biopsi prøver16,17,18.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:675px;" width="673">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">697</td>
			<td style="width:116px;">DSMZ</td>
			<td style="width:123px;">ACC 42</td>
			<td style="width:213px;">Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">JeKo-1</td>
			<td style="width:116px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">CRL-3006</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Jurkat</td>
			<td style="width:116px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">TIB-152</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">RCH-ACV</td>
			<td style="width:116px;">DSMZ</td>
			<td style="width:123px;">ACC 548</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Granta-519</td>
			<td style="width:116px;">DSMZ</td>
			<td style="width:123px;">ACC 342</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">REH</td>
			<td style="width:116px;">DSMZ</td>
			<td style="width:123px;">ACC 22</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Raji</td>
			<td style="width:116px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">CCL-86</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">HeLa</td>
			<td style="width:116px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">CCL-2</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Trypsin/EDTA solution</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">R001100</td>
			<td>For detaching adhesive cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:116px;">Wisent Inc.</td>
			<td style="width:123px;">81150</td>
			<td>To neutralize trypsin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Neutral Buffered Formalin</td>
			<td style="width:116px;">Protocol</td>
			<td style="width:123px;">245-684</td>
			<td>For fixing cell pellets</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">UltraPure low melting point agarose</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">15517-022</td>
			<td>For casting cell pellets</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">Mouse monoclonal anti-human Bcl-2 antibody, clone 124</td>
			<td style="width:116px;">Dako (Agilent)</td>
			<td style="width:123px;">cat#: M088729-2, RRID: 2064429</td>
			<td style="width:213px;">To detect Bcl-2 by immunoflourencence and immunoblot (lot#:&#160;00095786</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Ventana Discovery XT</td>
			<td style="width:116px;">Roche</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:213px;">For automation of immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-mouse)</td>
			<td style="width:116px;">Dako (Agilent)</td>
			<td style="width:123px;">K4000</td>
			<td style="width:213px;">For immunofluorescence signal amplification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-rabbit)</td>
			<td style="width:116px;">Dako (Agilent)</td>
			<td style="width:123px;">K4002</td>
			<td style="width:213px;">For immunofluorescence signal amplification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Cyanine 5 tyramide reagent</td>
			<td style="width:116px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:123px;">NEL745001KT</td>
			<td style="width:213px;">For immunofluorescence signal amplification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Aperio ImageScope</td>
			<td style="width:116px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:213px;">To view scanned slides</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">HALO image analysis software</td>
			<td style="width:116px;">Indica Labs</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:213px;">For quantification of immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">Protease inhibitors (Halt protease inhibitor cocktail, 100X)</td>
			<td style="width:116px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">1862209</td>
			<td>To add to RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:116px;">BioShop</td>
			<td style="width:123px;">EDT001</td>
			<td>For RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">NP-40</td>
			<td style="width:116px;">BDH Limited</td>
			<td style="width:123px;">56009</td>
			<td>For RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D6750</td>
			<td>For RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Glycerol</td>
			<td style="width:116px;">FisherBiotech</td>
			<td style="width:123px;">BP229</td>
			<td>For Laemlli buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:116px;">BioShop</td>
			<td style="width:123px;">BRO777</td>
			<td>For Laemlli buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:116px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">161-0611</td>
			<td>For Laemlli buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:116px;">BioShop</td>
			<td style="width:123px;">ALB001</td>
			<td>For immunoblot washes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Protein ladder (Precision Plus Protein Dual Color Standards)</td>
			<td style="width:116px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">161-0374</td>
			<td>For running protein gel</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Filter paper (Extra thick blot paper)</td>
			<td style="width:116px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">1703969</td>
			<td>For blotting transfer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Nitrocellulose membrane</td>
			<td style="width:116px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">162-0115</td>
			<td>For blotting transfer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Trans-blot SD semi-dry transfer cell</td>
			<td style="width:116px;">Bio-Rad</td>
			<td>1703940</td>
			<td>For semi-dry transfer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Skim milk powder (Nonfat dry milk)</td>
			<td style="width:116px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:123px;">9999S</td>
			<td>For blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Tween 20</td>
			<td style="width:116px;">BioShop</td>
			<td style="width:123px;">TWN510</td>
			<td>For wash buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">GAPDH rabbit monoclonal antibody</td>
			<td style="width:116px;">Epitomics</td>
			<td style="width:123px;">2251-1</td>
			<td style="width:213px;">Primary antibody of control protein (lot#: YE101901C)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) antibody</td>
			<td style="width:116px;">abcam</td>
			<td style="width:123px;">cat#: ab6789, RRID: AB_955439</td>
			<td style="width:213px;">Secondary antibody for immunoblot</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">Goat anti-rabbit IgG (HRP conjugated) antibody</td>
			<td style="width:116px;">abcam</td>
			<td style="width:123px;">cat#: ab6721, RRID: AB_955447</td>
			<td style="width:213px;">Secondary antibody for immunoblot (lot#: GR3192725-5)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Clarity Western ECL substrates</td>
			<td style="width:116px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">1705060</td>
			<td style="width:213px;">For immunoblot signal detection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Amersham Imager 600</td>
			<td style="width:116px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">29083461</td>
			<td>For immunoblot signal detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:116px;">Freeware, NIH</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td>For densitometry analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative immunoblotting of cell lines as a standard to validate immunofluorescence for quantifying biomarker proteins in routine tissue samples

Kvantifisering av proteiner av interesse i formalin-fast, parafin-embedded (FFPE)-vevsprøver er viktig i klinisk og forskning programmer. En optimal metode for kvantifisering nøyaktig, har en rekke med lineær dynamiske og opprettholder den strukturelle integriteten for eksempel tillate for identifikasjon av personlige celletyper. Gjeldende metoder som immunohistochemistry (IHC), massespektrometri og immunoblotting hver ikke oppfyller disse bestemmelsene på grunn av deres kategoriske natur eller må homogenize prøven. Som en alternativ foreslår vi bruk av immunofluorescence (hvis) og bildeanalyse å bestemme den relative overfloden av et protein av interesse i FFPE vev. Her viser vi at denne metoden er enkelt optimalisert, gir et bredt dynamisk område og er lineært kvantifiserbare i forhold til gullstandarden av kvantitative immunoblotting. Videre, denne metoden tillater vedlikehold av den strukturelle integriteten av utvalget og tillater æren av ulike celletyper, som kan være avgjørende i diagnostiske programmer. Alt dette er en robust metode for den relative kvantifiseringen av proteiner i FFPE prøver og kan lett tilpasses passer klinisk eller forskning må.

Denne protokollen ble brukt til å bekrefte hvis evnen til å bestemme det relative antallet anti-apoptotisk proteinet Bcl-2 i cellelinjer laget i FFPE vev blokker. Kvantifisere Bcl-2 selektivt i kreftcellene kan belyse kreftfremkallende mekanismer og kan være nyttig i patologisk diagnose og informere klinisk ledelse beslutninger24. Mer spesifikt, Bcl-2 spiller en rolle i riktig B-lymphocyte utvikling og uttrykket er vanligvis undersøkt i sammenheng med lymphoma<...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Immunoblotting of Cell Lines as a Standard to Validate Immunofluorescence for Quantifying Biomarker Proteins in Routine Tissue Samples at JoVE.co

Quantitative Immunoblotting of Cell Lines as a Standard to Validate Immunofluorescence for Quantifying Biomarker Proteins in Routine Tissue Samples

Kvantitativ Immunoblotting cellen linjer som Standard til å validere Immunofluorescence for kvantifisering biomarkør proteiner i rutinemessig vevsprøver

Vi beskriver bruken av kvantitative immunoblotting å validere immunofluorescence histology kombinert med bildeanalyser for kvantifisere et protein av interesse i formalin-fast, parafin-embedded (FFPE)-vevsprøver. Våre resultater viser nytten av immunofluorescence histology for konstatere relative antallet biomarkør proteiner i rutinemessig biopsi prøver.

Quantification of proteins of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples is important in clinical and research applications. An ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål innen kreftpatologi, ved å kvantifisere biomarkørproteiner fra rutinemessig bearbeidet biopsimateriale. De viktigste fordelene med denne teknikken i forhold til konvensjonell immunohistochemistry, er at den er objektiv, har et bredt dynamisk område, og tillater kvantifisering av proteiner i bestemte celletyper. Tilstedeværelsen eller fraværet av visse såkalte biomarkørproteiner, eller mer spesielt, kan den relative overfloden av disse proteinene i kreftbiopsiprøver være svært nyttige for å lage en bestemt patologisk diagnose av bestemte typer kreftformer.Men det kan også være nyttig i å forutsi responsen på kreftbehandlinger, så det er derfor denne teknikken er relevant både for diagnose og behandling av pasienter med kreft. Denne protokollen handler hovedsakelig om hvordan man bruker proteinkvantifisering i udødeliggjorte cellelinjer for å validere den kvantitative karakteren av immunofluorescence basert analyse. Men det er viktig å merke seg at immunofluorescence lett kan innlemmes i en multipleksed tilnærming, og brukes på primære biopsiprøver.Å bistå og demonstrere denne prosedyren vil være Lee Boudreau, en tekniker, og Shakeel Virk, driftsdirektør. Begge fra Dronningens laboratorium for molekylær patologi. Til å begynne med sentrifugerer de tidligere høstede cellene i et 50 milliliter konisk rør ved 225 Gs i fem minutter.Dekanter det overnaturante, og resuspend cellepellet i 10 milliliter PBS. Deretter sentrifugere de resuspended cellene ved 225 Gs i fem minutter. Suspender cellepelleten med 10 milliliter på 10 %NBF.Deretter inkubere cellene ved romtemperatur på en rocker ved 24 RPMer over natten. Etter å ha fikset cellene, sentrifuger cellene ved 225 Gs i fem minutter. Fjern deretter de overnaturante og gjenoppusser cellene i 500 mikroliter pbs.Overfør cellene til et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør, og pellet cellene via sentrifugering. Deretter aspirerer du overnatanten. Tilsett ca. 500 mikroliter med 1 % agaroseløsning i hvert rør som inneholder celler.Deretter pipette blandingen opp og ned for å blande. Etter at agarosecelleløsningen stivner, legger du til en milliliter på 10% NBF til rørene. Fjern senere NBF fra prøvene.Bruk et barberblad til å fjerne cellepluggen, og plasser pluggen i en plastvevskassett. Behandle prøver over natten med en automatisert vevsprosessor. Deretter bygger du inn prøvene i parafinvoks, ved hjelp av standard histologimetoder.Ved hjelp av et vev arrayer instrument, høste dupliserte 6 millimeter kjerner fra parafinblokken, og sett dem inn i en tom parafinblokk. Etter dette bruker du en mikrotom til å forberede to histologiske deler av den nyopprettede cellelinjen, TMA. Deretter monterer du seksjonene på en histologisklie, og deparaffiniserer dem.Last først de to lysbildene på cellelinje-TMA inn i et automatisert fargesystem. Beis den ene siden med optimal primær antistofffortynning, slik at den andre som et negativt kontrollglidelysbilde. Til begge lysbildene, bruk en kjernefysisk motstain, og sekundært antistoff.Etter fargeprosessen, tilsett tyramidsignalforsterkningsreagensene. Etter dette skanner du de immunostained lysbildene ved hjelp av de riktige eksitasjons- og deteksjonsbølgelengdene for fluoroforene som ble brukt. Bruk bildeanalyseprogramvare til å identifisere det cellulære rommet av interesse, enten kjernen eller cytoplasma, og kvantifisere den gjennomsnittlige fluorescensintensiteten, eller MFI, for hver linje.For å finne ut hvilken cellelinje som har størst overflod av målproteinet, aliquot dyrebart forberedt celle lysate i mikrocentrifuge rør. Deretter legger du til 2,5 mikroliter 6x laemly buffer, og nok RIPA lysis buffer for å bringe det totale volumet til 15 mikroliter. Deretter laster du en SDS-sidegel, med en proteinstige, og de tidligere forberedte prøvene.Etter dette laster du laemlybufferen inn i de tomme brønnene. Kjør gelen til det blå fargestoffet når bunnen av platen. Etter å ha utført en halvtørr proteinoverføring, bruk et barberblad til å kutte membranen horisontalt for å skille proteinet av interesse fra kontrollproteinet.Utfør blokkerings- og antistoffinkubasjoner i henhold til produsentens instruksjoner. Legg deretter membranstrimlene i en klar plastpose. Bruk en P1000 pipette til å dekke membranene med ECL-blanding.Tet deretter posen, og inkuber membranene ved romtemperatur i mørket i ett til to minutter. Deretter plasserer du plastposen som inneholder membranene i en digital bildeplattform. Bruk chemiluminescence og kolorimetrisk markørdeteksjon for å fange opp ulike eksponeringer av membranen.Ved hjelp av bildeanalyseprogramvare, eller visuell observasjon, bestemme hvilken cellelinje uttrykker mest målprotein. Etter immunoblotting en seriell fortynning av denne cellelinjen, åpne eksponeringsbildene ved hjelp av bildeanalyseprogramvare. Bruk verktøyet for rektangulære valg til å velge gelens første kjørefelt.Deretter går du for å analysere, geler, og velg første kjørefelt. Gjenta denne prosessen ved å flytte verktøyet for rektangulære valg over til neste kjørefelt, og gå for å analysere, gels og velge neste kjørefelt. Deretter går du for å analysere, geler og plotte baner.Bruk det rette linjeverktøyet til å tegne linjer over basene på hver topp, for å fjerne bakgrunnsstøyen. Bruk deretter tryllestavverktøyet til å velge hver topp, og få båndintensiteten til hver topp fra resultatvinduet. Lag en scatterplot av båndintensitet versus mengden totalt protein lastet for hvert primære antistoff ved hjelp av densitometriutgangen.Deretter bruker du en linje med best passform og visuell observasjon for å bestemme plasseringen av det lineære dynamiske området for hvert antistoff. Velg en proteinkonsentrasjon som gir et bånd intensitet innenfor det lineære området, og utfør en immunoblot av alle cellelinjelylater med den proteinkonsentrasjonen, som vist tidligere. Deretter utfører du tettsitometri på de digitale skanningene, og velger eksponeringer som gir signaler innenfor de tidligere identifiserte lineære områdene for hvert antistoff.Etter dette beregner du forholdet mellom målproteinbåndintensitet til belastningskontrollbåndintensitet for hver cellelinje. Til slutt, bruk statistisk programvare til å utføre en Pearson korrelasjonstest mellom verdiene hentet fra bildeanalyse av IF-farging, og de som er hentet fra immunoblotting. Denne protokollen ble brukt til å bekrefte muligheten for IF å bestemme den relative mengden av anti-apoptotisk protein Bcl-2.Varierende fortynninger av det primære antistoffet ble testet på humant mandlenevev med en immunohistologiflekk. For dette eksperimentet ble en til 50 fortynning fastslått å være den optimale fortynningen som ga et sterkt signal med liten bakgrunnsstøy. Denne fortynningen ble brukt til å farge cellelinjen TMA ved immunofluorescence, og bildeanalyse ble brukt til å kvantifisere det cytoplasmatiske Cy5-signalet tilskrevet Bcl-2.Basert på immunoblot for alle de testede cellelinjene, hadde Granta-519 den største overfloden av Bcl-2. En immunoblot av seriell fortynning av Granta-519 lysate ble deretter brukt til å finne det lineære dynamiske området Bcl-2, og kontrollere protein GAPDH. Det dynamiske området for Bcl-2 i denne analysen varierte fra en båndintensitet på nesten 0 til 7500 enheter.Det dynamiske området for GAPDH varierte fra 3000 til 6500 enheter. Immunoblot ble gjentatt med eksponeringer innenfor det lineære området. Og forholdet mellom Bcl-2 og GAPDH ble beregnet for hver cellelinje.En Pearson korrelasjonstest viste at intensitetsforholdene fra immunoblotting var sterkt og positivt korrelert med intensitetsmålingene fra kvantitativ IF. Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske å utsette den endelige membranen for flere tidspunkter, For å finne den optimale eksponeringen der alle båndene er innenfor sine respektive lineære områder. Etter validering av den kvantitative karakteren av IF-protokollen, kan den endres for multipleks IF, i rutinemessig bearbeidede vevsprøver for å svare på kliniske spørsmål som hvor et målprotein uttrykkes.

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Kvantitative Sammenligning av Cis-Regulatory Element (CRE) Aktiviteter i Transgen Drosophila melanogaster</em

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

En kvantitativ fitnessanalyse Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Bruke SecM Arrest sekvens som et verktøy for å isolere ribosom Innbundne polypeptider

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Profilering Individuell humane embryonale stamceller ved kvantitativ RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Kvantitativ Immunfluorescens analysen Mål Variasjon i protein nivåer på Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

Metode for måling av aktiviteten til Deubiquitinating Enzymer i cellelinjer og vevsprøver

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

Ansette Digital Droplet PCR å oppdage BRAF V600E Mutasjoner i formalinfiksert parafininnstøpte Reference Standard cellelinjer

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

Immunofluorescensanalyse av Endogene og eksogene cent-kinetochore Proteiner

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

Gap junctional interkommunikasjons: En funksjonell biomarkør for å vurdere skadevirkninger av giftstoffer og giftstoffer, og helsemessige fordeler av Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...