Name: quantitative immunoblotting of cell lines as a standard to validate immunofluorescence for quantifying biomarker proteins in routine tissue samples
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Immunoblotting of Cell Lines as a Standard to Validate Immunofluorescence for Quantifying Biomarker Proteins in Routine Tissue Samples at JoVE.co

Эта работа частично финансируется Фредерик Banting и Чарльз Лучшие Канада выпускников стипендии (а.м.).

Разрешение на использование образцов первичной человеческой ткани был получен от медицинских наук и связанные учебных больницах исследований этики Совет (HSREB) в Университете королевы.
1. Строительство линии клетки Microarray ткани (TMA)
<ol><li>Урожай и вымыть клетки. Примечани?...

<ol>
	<li>Khoury, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+Immunohistochemical+Assays+for+Integral+Biomarkers+in+the+NCI-MATCH+EAY131+Clinical+Trial.">Validation of Immunohistochemical Assays for Integral Biomarkers in the NCI-MATCH EAY131 Clinical Trial.</a> Clinical Cancer Research. 24 (3), 521-531 (2018).</li><li>Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G. L., da Silva Pinhal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+as+an+important+tool+in+biomarkers+detection+and+clinical+practice.">Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice.</a> Biomarker insights. 5, 9-20 (2010).</li><li>Seidal, T., Balaton, A. J., Battifora, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+and+quantification+of+immunostains.">Interpretation and quantification of immunostains.</a> The American journal of surgical pathology. 25 (9), 1204-1207 (2001).</li><li>Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+brown+cannot+do+for+you.">What brown cannot do for you.</a> Nature Biotechnology. 24 (8), 914-916 (2006).</li><li>Bokhart, M. T., Rosen, E., Thompson, C., Sykes, C., Kashuba, A. D. M., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mass+spectrometry+imaging+of+emtricitabine+in+cervical+tissue+model+using+infrared+matrix-assisted+laser+desorption+electrospray+ionization.">Quantitative mass spectrometry imaging of emtricitabine in cervical tissue model using infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (8), 2073-2084 (2015).</li><li>Porta, T., Lesur, A., Varesio, E., Hopfgartner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+in+MALDI-MS+imaging:+what+can+we+learn+from+MALDI-selected+reaction+monitoring+and+what+can+we+expect+for+imaging?.">Quantification in MALDI-MS imaging: what can we learn from MALDI-selected reaction monitoring and what can we expect for imaging?.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (8), 2177-2187 (2015).</li><li>Rzagalinski, I., Volmer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+low+molecular+weight+compounds+by+MALDI+imaging+mass+spectrometry+&#8211;+A+tutorial+review.">Quantification of low molecular weight compounds by MALDI imaging mass spectrometry &#8211; A tutorial review.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1865 (7), 726-739 (2017).</li><li>Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Western+blots:+Pitfalls+of+densitometry.">Quantifying Western blots: Pitfalls of densitometry.</a> ELECTROPHORESIS. 30 (11), 1845-1855 (2009).</li><li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics.">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li><li>Burgess, M. W., Keshishian, H., Mani, D. R., Gillette, M. A., Carr, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+and+efficient+quantification+of+low-abundance+proteins+at+very+high+multiplex+via+targeted+mass+spectrometry.">Simplified and efficient quantification of low-abundance proteins at very high multiplex via targeted mass spectrometry.</a> Molecular &amp; cellular proteomics: MCP. 13 (4), 1137-1149 (2014).</li><li>Carr, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+peptide+measurements+in+biology+and+medicine:+best+practices+for+mass+spectrometry-based+assay+development+using+a+fit-for-purpose+approach.">Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach.</a> Molecular &amp; cellular proteomics: MCP. 13 (3), 907-917 (2014).</li><li>Denburg, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Two+ELISA+Methods+and+Mass+Spectrometry+for+Measurement+of+Vitamin+D-Binding+Protein:+Implications+for+the+Assessment+of+Bioavailable+Vitamin+D+Concentrations+Across+Genotypes.">Comparison of Two ELISA Methods and Mass Spectrometry for Measurement of Vitamin D-Binding Protein: Implications for the Assessment of Bioavailable Vitamin D Concentrations Across Genotypes.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 31 (6), 1128-1136 (2016).</li><li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+immunohistochemistry,+imaging,+and+quantitation:+A+review,+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification,+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis.">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li><li>Peck, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+tumor+protein+marker+quantification+by+two+independent+automated+immunofluorescence+image+analysis+platforms.">Validation of tumor protein marker quantification by two independent automated immunofluorescence image analysis platforms.</a> Modern pathology: an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 29 (10), 1143-1154 (2016).</li><li>Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proof+of+the+quantitative+potential+of+immunofluorescence+by+mass+spectrometry.">Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry.</a> Laboratory Investigation. 97 (3), 329-334 (2017).</li><li>AlJohani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abundant+expression+of+BMI1+in+follicular+lymphoma+is+associated+with+reduced+overall+survival.">Abundant expression of BMI1 in follicular lymphoma is associated with reduced overall survival.</a> Leukemia and Lymphoma. 59 (9), 2211-2219 (2018).</li><li>Wood, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abundant+expression+of+interleukin-21+receptor+in+follicular+lymphoma+cells+is+associated+with+more+aggressive+disease.">Abundant expression of interleukin-21 receptor in follicular lymphoma cells is associated with more aggressive disease.</a> Leukemia and Lymphoma. 54 (6), 1212-1220 (2013).</li><li>Weberpals, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+application+of+the+Automated+QUantitative+Analysis+(AQUA)+technique+to+quantify+PTEN+protein+expression+in+ovarian+cancer:+A+correlative+study+of+NCIC+CTG+OV.16.">First application of the Automated QUantitative Analysis (AQUA) technique to quantify PTEN protein expression in ovarian cancer: A correlative study of NCIC CTG OV.16.</a> Gynecologic Oncology. 140 (3), 486-493 (2016).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraffin+embedding+tissue+samples+for+sectioning.">Paraffin embedding tissue samples for sectioning.</a> CSH protocols. , (2008).</li><li>Fedor, H. L., Marzo, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+Practical+Methods+for+Tissue+Microarray+Construction.">De Practical Methods for Tissue Microarray Construction.</a> Methods in Molecular Medicine. , 89-101 (2005).</li><li>Kajimura, J., Ito, R., Manley, N. R., Hale, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Single-+and+Dual-Color+Immunofluorescence+Protocols+for+Formalin-Fixed,+Paraffin-Embedded+Archival+Tissues.">Optimization of Single- and Dual-Color Immunofluorescence Protocols for Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Archival Tissues.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 64 (2), 112-124 (2016).</li><li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blot:+technique,+theory,+and+trouble+shooting.">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> North American journal of medical sciences. 4 (9), 429-434 (2012).</li><li>Wiedemann, M., Lee, S. J., da Silva, R. C., Visweswaraiah, J., Soppert, J., Sattlegger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+semi-dry+electrophoretic+transfer+of+a+wide+range+of+differently+sized+proteins+for+immunoblotting.">Simultaneous semi-dry electrophoretic transfer of a wide range of differently sized proteins for immunoblotting.</a> Nature Protocol Exchange. , (2013).</li><li>Delbridge, A. R. D., Grabow, S., Strasser, A., Vaux, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thirty+years+of+BCL-2:+translating+cell+death+discoveries+into+novel+cancer+therapies.">Thirty years of BCL-2: translating cell death discoveries into novel cancer therapies.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (2), 99-109 (2016).</li><li>Bosch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bioclinical+prognostic+model+using+MYC+and+BCL2+predicts+outcome+in+relapsed/refractory+diffuse+large+B-cell+lymphoma.">A bioclinical prognostic model using MYC and BCL2 predicts outcome in relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma.</a> Haematologica. 103 (2), 288-296 (2018).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BCL2+mRNA+or+protein+abundance+is+superior+to+gene+rearrangement+status+in+predicting+clinical+outcomes+in+patients+with+diffuse+large+B-cell+lymphoma.">BCL2 mRNA or protein abundance is superior to gene rearrangement status in predicting clinical outcomes in patients with diffuse large B-cell lymphoma.</a> Hematological Oncology. 35, 288-289 (2017).</li><li>Choi, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+expression+of+Bcl-2+predicts+poor+outcome+in+diffuse+large+B-cell+lymphoma+patients+with+low+international+prognostic+index+receiving+R-CHOP+chemotherapy.">High expression of Bcl-2 predicts poor outcome in diffuse large B-cell lymphoma patients with low international prognostic index receiving R-CHOP chemotherapy.</a> International Journal of Hematology. 103 (2), 210-218 (2016).</li><li>. The Human Protein Atlas BCL2 Available from: <a target="_blank" href="https://www.proteinatlas.org/ENSG00000171791-BCL2/cell#rna">https://www.proteinatlas.org/ENSG00000171791-BCL2/cell#rna</a> (2018)</li><li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+multiplex+immunofluorescence+panels+using+multispectral+microscopy+for+immune-profiling+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+human+tumor+tissues.">Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).</li><li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Guide+to+Modern+Quantitative+Fluorescent+Western+Blotting+with+Troubleshooting+Strategies.">A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).</li><li>Zellner, M., Babeluk, R., Diestinger, M., Pirchegger, P., Skeledzic, S., Oehler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+Western+blotting+for+quantitation+of+protein+biomarkers+in+clinical+samples.">Fluorescence-based Western blotting for quantitation of protein biomarkers in clinical samples.</a> ELECTROPHORESIS. 29 (17), 3621-3627 (2008).</li><li>Parra, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Platforms+of+Multiplexed+Immunofluorescence+for+Study+of+Paraffin+Tumor+Tissues.">Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues.</a> Journal of Cancer Treatment &amp; Diagnostics. 2 (1), 43-53 (2018).</li><li>Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunofluorescence+labelling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+tissue.">Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BMC Cell Biology. 9 (1), 13 (2008).</li></ol>

Мы описали метод который использует количественных immunoblotting (IB) для демонстрации полезности иммунофлюоресценции (IF) для выяснения относительное обилие целевого белка в FFPE образцах тканей. Текущие методы количественной оценки белка ограничены их категорического характера, например хр?...

Во многих клинических областях существует необходимость для количественного определения белков в формалин исправлена, парафин врезанных образцах биопсии тканей (FFPE). Например количественная оценка биомаркер белков в обычной биопсии образцов используется прогноз и информировать лечения для рака пациентов1. Однако текущие методы обычно субъективные и отсутствие проверки.
Иммуногистохимия (IHC) обычно используется в лаборатории патологии и обычно зависит от основного антитела, направленные против целевого белка и вторичное антитело проспряганное с ферментативной метки например пероксидазы хрена2. Обычные IHC чувствителен, можно сделать использование минуту образцы и сохраняет морфологической целостности образцов тканей, тем самым позволяя оценки экспрессии белков в своих соответствующих гистологические контексте. Однако потому что хромогенных сигнал IHC Субтрактивный, он страдает от относительно узкий динамический диапазон и предлагает ограниченный потенциал для мультиплексирования2,3,4. При содействии матрицы лазерной десорбции/ионизации масс-спектрометрии изображений (MALDI-MSI) сохраняет морфологической целостности. Однако эта технология развивающихся ассоциируется с скромные морфологических резолюции и требует значительных калибровки и нормализации, умаление его осуществимости для рутинного использования клинических5,6,7. Альтернативные методы для количественного определения белка в образцах тканей включают immunoblotting8, масс-спектрометрия9,10,11и иммуноферментного анализа (ИФА)12, каждый из которых начинается с усредненной lysate образец ткани. Образцы основной ткани являются разнородными, в том, что они содержат множество типов клеток. Таким образом методы, которые влекут за собой гомогенизация пробы не количественной белка в конкретной ячейке населения интереса, таких как раковые клетки.
Как ИХС, если это применимо к малым FFPE образцы и разрешает сохранение гистологические целостности13. Однако, благодаря добавка характер флуоресценции сигналов, если поддается применение нескольких первичных антител и флуоресцентные метки. Таким образом протеин интереса может быть относительно количественно в пределах конкретных ячеек или сотовой отсеков (например, ядра и цитоплазмы) определяется с помощью других антител. Флуоресценции сигналы также имеют преимущество большего динамического диапазона13,14. Превосходство, воспроизводимость и мультиплексирования потенциал если применен к FFPE образцов был продемонстрировали13,14,15.
Здесь мы описываем использование количественных immunoblotting, с использованием установленных клеточных линий как золотой стандарт для выяснения количественный характер, если в сочетании с анализа компьютерного изображения при определении относительного изобилия протеин интереса к Гистологические срезы из образцов ткани FFPE. Мы применили этот метод успешно в мультиплекс подход к количественно биомаркер белков в клинической биопсии образцы16,17,18.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:675px;" width="673">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">697</td>
			<td style="width:116px;">DSMZ</td>
			<td style="width:123px;">ACC 42</td>
			<td style="width:213px;">Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">JeKo-1</td>
			<td style="width:116px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">CRL-3006</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Jurkat</td>
			<td style="width:116px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">TIB-152</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">RCH-ACV</td>
			<td style="width:116px;">DSMZ</td>
			<td style="width:123px;">ACC 548</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Granta-519</td>
			<td style="width:116px;">DSMZ</td>
			<td style="width:123px;">ACC 342</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">REH</td>
			<td style="width:116px;">DSMZ</td>
			<td style="width:123px;">ACC 22</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Raji</td>
			<td style="width:116px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">CCL-86</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">HeLa</td>
			<td style="width:116px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">CCL-2</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Trypsin/EDTA solution</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">R001100</td>
			<td>For detaching adhesive cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:116px;">Wisent Inc.</td>
			<td style="width:123px;">81150</td>
			<td>To neutralize trypsin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Neutral Buffered Formalin</td>
			<td style="width:116px;">Protocol</td>
			<td style="width:123px;">245-684</td>
			<td>For fixing cell pellets</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">UltraPure low melting point agarose</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">15517-022</td>
			<td>For casting cell pellets</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">Mouse monoclonal anti-human Bcl-2 antibody, clone 124</td>
			<td style="width:116px;">Dako (Agilent)</td>
			<td style="width:123px;">cat#: M088729-2, RRID: 2064429</td>
			<td style="width:213px;">To detect Bcl-2 by immunoflourencence and immunoblot (lot#:&#160;00095786</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Ventana Discovery XT</td>
			<td style="width:116px;">Roche</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:213px;">For automation of immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-mouse)</td>
			<td style="width:116px;">Dako (Agilent)</td>
			<td style="width:123px;">K4000</td>
			<td style="width:213px;">For immunofluorescence signal amplification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-rabbit)</td>
			<td style="width:116px;">Dako (Agilent)</td>
			<td style="width:123px;">K4002</td>
			<td style="width:213px;">For immunofluorescence signal amplification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Cyanine 5 tyramide reagent</td>
			<td style="width:116px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:123px;">NEL745001KT</td>
			<td style="width:213px;">For immunofluorescence signal amplification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Aperio ImageScope</td>
			<td style="width:116px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:213px;">To view scanned slides</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">HALO image analysis software</td>
			<td style="width:116px;">Indica Labs</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:213px;">For quantification of immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">Protease inhibitors (Halt protease inhibitor cocktail, 100X)</td>
			<td style="width:116px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">1862209</td>
			<td>To add to RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:116px;">BioShop</td>
			<td style="width:123px;">EDT001</td>
			<td>For RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">NP-40</td>
			<td style="width:116px;">BDH Limited</td>
			<td style="width:123px;">56009</td>
			<td>For RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D6750</td>
			<td>For RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Glycerol</td>
			<td style="width:116px;">FisherBiotech</td>
			<td style="width:123px;">BP229</td>
			<td>For Laemlli buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:116px;">BioShop</td>
			<td style="width:123px;">BRO777</td>
			<td>For Laemlli buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:116px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">161-0611</td>
			<td>For Laemlli buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:116px;">BioShop</td>
			<td style="width:123px;">ALB001</td>
			<td>For immunoblot washes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Protein ladder (Precision Plus Protein Dual Color Standards)</td>
			<td style="width:116px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">161-0374</td>
			<td>For running protein gel</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Filter paper (Extra thick blot paper)</td>
			<td style="width:116px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">1703969</td>
			<td>For blotting transfer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Nitrocellulose membrane</td>
			<td style="width:116px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">162-0115</td>
			<td>For blotting transfer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Trans-blot SD semi-dry transfer cell</td>
			<td style="width:116px;">Bio-Rad</td>
			<td>1703940</td>
			<td>For semi-dry transfer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Skim milk powder (Nonfat dry milk)</td>
			<td style="width:116px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:123px;">9999S</td>
			<td>For blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Tween 20</td>
			<td style="width:116px;">BioShop</td>
			<td style="width:123px;">TWN510</td>
			<td>For wash buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">GAPDH rabbit monoclonal antibody</td>
			<td style="width:116px;">Epitomics</td>
			<td style="width:123px;">2251-1</td>
			<td style="width:213px;">Primary antibody of control protein (lot#: YE101901C)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) antibody</td>
			<td style="width:116px;">abcam</td>
			<td style="width:123px;">cat#: ab6789, RRID: AB_955439</td>
			<td style="width:213px;">Secondary antibody for immunoblot</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">Goat anti-rabbit IgG (HRP conjugated) antibody</td>
			<td style="width:116px;">abcam</td>
			<td style="width:123px;">cat#: ab6721, RRID: AB_955447</td>
			<td style="width:213px;">Secondary antibody for immunoblot (lot#: GR3192725-5)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Clarity Western ECL substrates</td>
			<td style="width:116px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">1705060</td>
			<td style="width:213px;">For immunoblot signal detection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Amersham Imager 600</td>
			<td style="width:116px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">29083461</td>
			<td>For immunoblot signal detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:116px;">Freeware, NIH</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td>For densitometry analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative immunoblotting of cell lines as a standard to validate immunofluorescence for quantifying biomarker proteins in routine tissue samples

Количественная оценка протеинов интереса в образцах тканей формалином исправлена, парафин врезанных (FFPE) имеет важное значение в клинических и научно-исследовательских приложениях. Оптимальный метод количественной оценки является точным, имеет широкий динамический диапазон линейных и поддерживает структурную целостность образца для идентификации типов отдельных клеток. Нынешние методы иммуногистохимии (IHC), масс-спектрометрии и immunoblotting друг не соответствуют эти положения ввиду их категорического характера или необходимо гомогенизировать образца. В качестве альтернативного метода мы предлагаем использование иммунофлюоресценции (КРП) и анализа изображений для определения относительного изобилия протеин интереса в FFPE тканях. Здесь мы продемонстрировать, что этот метод легко оптимизируется, дает широкий динамический диапазон и линейно количественному сравнению с золотой стандарт количественных immunoblotting. Кроме того этот метод разрешает сохранение структурной целостности образца и позволяет для разграничения различных типов клеток, которые могут иметь решающее значение в диагностические приложения. В целом это надежный метод для количественной оценки относительной белков в FFPE образцах и может быть легко адаптирована с учетом клинических или исследовательских потребностей.

Этот протокол был использован для подтверждения если способность определить относительное количество анти apoptotic белка Bcl-2 в клеточных линиях в FFPE блоков ткани. Количественного определения Bcl-2 выборочно в раковых клетках можно выяснить онкогенных механизмы и может бы...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Immunoblotting of Cell Lines as a Standard to Validate Immunofluorescence for Quantifying Biomarker Proteins in Routine Tissue Samples at JoVE.co

Quantitative Immunoblotting of Cell Lines as a Standard to Validate Immunofluorescence for Quantifying Biomarker Proteins in Routine Tissue Samples

Количественные Immunoblotting клеточных линий как стандарт для проверки иммунофлюоресценции для количественной оценки биомаркер белков в образцах тканей рутинной

Мы описывают использование количественных immunoblotting для проверки иммунофлюоресценции гистологии, наряду с анализом изображений как средства количественного протеин интереса в образцах тканей формалином исправлена, парафин врезанных (FFPE). Наши результаты показывают полезность гистология иммунофлюоресценции для выяснения относительное количество белков биомаркеров в обычной биопсии образцы.

Quantification of proteins of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples is important in clinical and research applications. An ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области патологии рака, путем количественной оценки биомаркеров белков из регулярно обрабатываемого материала биопсии. Основными преимуществами этого метода по отношению к обычной иммуногистохимии, являются то, что она объективна, имеет широкий динамический диапазон и позволяет количественно оценить белки в конкретных типах клеток. Наличие или отсутствие некоторых так называемых белков биомаркеров, или, в частности, относительное изобилие этих белков в образцах биопсии рака может быть очень полезным в принятии конкретной патологической диагностики конкретных видов рака.Но это также может быть полезно в прогнозировании реакции на лечение рака, поэтому этот метод имеет отношение как к диагностике и лечению больных раком. Этот протокол главным образом о как использовать квантификацию протеина в immortalized линиях клетки для того чтобы проверить количественный характер анализа основанного immunofluorescence. Но важно отметить, что иммунофторесценция может быть легко включена в мультиплексный подход и применена к первичным образцам биопсии.Помогать и демонстрировать эту процедуру будут Ли Boudreau, техник, и Shakeel Virk, директор по операциям. Оба из Королевской лаборатории молекулярной патологии. Для начала, центрифуга ранее собранных клеток в 50 миллилитров конической трубки на 225 Gs в течение пяти минут.Декант супернатант, и повторное распределение клеточных гранул в 10 миллилитров PBS. Затем центрифуга повторного перерасхода клеток на 225 Gs в течение пяти минут. Приостановить ячейку гранулы с 10 миллилитров 10%NBF.Затем инкубировать клетки при комнатной температуре на рокер на 24 RPMs ночь. После фиксации клеток, центрифуга клеток на 225 Gs в течение пяти минут. Затем удалите супернатант и повторно наполнить клетки в 500 микролитров PBS.Перенесите клетки в 1,5 миллилитр микроцентрифугную трубку и гранулировать клетки через центрифугирование. Затем, аспирировать супернатант. Добавьте около 500 микролитров раствора 1%agarose к каждой трубке, содержащей клетки.Затем, пипетка смесь вверх и вниз, чтобы смешать. После того, как раствор агарозы затвердеет, добавьте в трубки один миллилитр 10% NBF. Позже удалите NBF из образцов.Используйте лезвие бритвы, чтобы удалить вилку клетки, и поместите вилку в кассету пластиковой ткани. Обработать образцы на ночь с помощью автоматизированного процессора тканей. Затем встраивайте образцы в парафиновый воск, используя стандартные гистологические методы.Используя инструмент массивера тканей, урожай дублировать 6 миллиметровых ядер от парафина блока, и вставить их в пустой парафин блока. После этого используйте микротом для подготовки двух гистологических секций недавно созданной клеточной линии TMA. Затем смонтируйте секции на гистологическом слайде и депараффинизируйте их.Во-первых, загрузите два слайда клеточной линии TMA в автоматизированную систему окрашивания. Пятно одной стороны с оптимальным первичным разбавлением антител, оставляя другую в качестве отрицательного контроля слайда. На оба слайда нанесите ядерный счетчик и вторичные антитела.После процесса окрашивания добавьте реагенты усиления сигнала тирамида. После этого сканируйте иммуноинкрементные слайды, используя соответствующие возбуждения и обнаружения длин волн для флюорофоров, которые были использованы. Используйте программное обеспечение для анализа изображений для определения интереса к сотовому отсеку, будь то ядро или цитоплазма, и количественно оценить средняю интенсивность флуоресценции, или МФО, для каждой линии.Чтобы определить, какая линия клеток имеет наибольшее изобилие целевого белка, aliquot драгоценно подготовленные клетки лизат в микроцентрифуг труб. Затем добавьте 2,5 микролитров буфера 6x laemly и достаточно буфера лиза RIPA, чтобы довести общий объем до 15 микролитров. Затем загрузите гель страницы SDS с белковой лестницей и ранее подготовленными образцами.После этого загрузите laemly буфер в пустые колодцы. Запустите гель, пока синий краситель не достигнет нижней части пластины. После выполнения полусухой передачи белка, используйте лезвие бритвы, чтобы сократить мембрану горизонтально, чтобы отделить белок интереса от контрольного белка.Выполните блокирование и инкубации антител в соответствии с инструкциями производителей. Затем поместите мембранные полоски в четкий полиэтиленовый пакет. Используйте пипетку P1000 для покрытия мембран смесью ECL.Затем запечатать мешок, и инкубировать мембраны при комнатной температуре в темноте в течение одной-двух минут. Затем поместите полиэтиленовый пакет, содержащий мембраны, в цифровую платформу визуализации. Используйте хемилюминесценцию и обнаружение колоритных маркеров для захвата различных экспозиций мембраны.Используя программное обеспечение для анализа изображений или визуальное наблюдение, определите, какая линия клеток выражает наиболее целевой белок. После иммуноблотинга последовательного разбавления этой клеточной линии откройте изображения экспозиции с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Используйте прямоугольный инструмент выбора, чтобы выбрать первую полосу геля.Затем перейдите к анализу, гели, и выбрать первую полосу. Повторите этот процесс, перемещая инструмент прямоугольных выборов на следующую полосу, и перейдите к анализу, гелям и выберите следующую полосу движения. Далее перейдите на анализ, гели и сюжетные дорожки.Используйте инструмент прямой линии, чтобы нарисовать линии через основания каждого пика, чтобы удалить фоновый шум. Затем используйте инструмент палочки, чтобы выбрать каждый пик, и получить интенсивность полосы каждого пика из окна результатов. Создайте рассеяние интенсивности полосы по сравнению с количеством общего белка, загруженного для каждого первичного антитела с использованием денситометрии выход.Затем используйте линию наилучшего соответствия и визуального наблюдения, чтобы определить расположение линейного динамического диапазона каждого антитела. Выберите концентрацию белка, которая дает интенсивность полосы в линейном диапазоне, и выполните иммуноблот всей клеточной линии лисирует с этой концентрацией белка, как пооявляло ранее. Затем выполните денситометрию на цифровом сканировании, выбрав экспозиции, которые дают сигналы в пределах ранее выявленных линейных диапазонов для каждого антитела.После этого вычислите соотношение интенсивности целевой белковой полосы к интенсивности нагрузок контрольной полосы для каждой клеточной линии. Наконец, используйте статистическое программное обеспечение для выполнения теста корреляции Пирсон между значениями, полученными в результате анализа изображений окрашивания IF, и теми, которые получены от иммуноблоттинга. Этот протокол был использован для подтверждения способности ИФ определить относительное количество антиапоптотического белка Bcl-2.Различные разбавления первичных антител были протестированы на ткани миндалин человека с иммуногистаминные пятна. В ходе этого эксперимента было определено, что разбавление от одного до 50 является оптимальным разбавлением, которое дает сильный сигнал с небольшим фоновым шумом. Это разбавление было использовано для окрашивания клеточной линии TMA иммунофлюоресценцией, а анализ изображений использовался для количественной оценки цитоплазмического сигнала Cy5, приписываемого Bcl-2.Основываясь на иммуноблоте для всех проверенных клеточных линий, Granta-519 имел наибольшее изобилие Bcl-2. Иммуноблот серийного разбавления лизата Granta-519 затем использовался для найдите линейный динамический диапазон Bcl-2 и контроль белка GAPDH. Динамический диапазон для Bcl-2 в этом анализе колебался от интенсивности полосы почти 0, до 7500 единиц.Динамический диапазон для GAPDH варьировался от 3000 до 6500 единиц. Иммунобло был повторен с воздействиями в этом линейном диапазоне. И соотношение Bcl-2 к GAPDH было рассчитано для каждой линии ячейки.Тест корреляции Пирсона показал, что коэффициенты интенсивности иммуноблоттинга сильно и положительно коррелируют с показателями интенсивности от количественных IF. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы разоблачить окончательную мембрану для нескольких точек времени, для того, чтобы найти оптимальную экспозицию, где все полосы находятся в пределах своих линейных диапазонов. После проверки количественного характера протокола IF, он может быть изменен для мультиплекса IF, в обычно обработанных образцах тканей, чтобы ответить на клинические вопросы, такие как, где целевой белок выражается.

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Актина сотрудничества седиментации Пробирной; для анализа связывание белка с F-актин

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Количественное сравнение СНГ-Регуляторного элемента (CRE) Деятельность в Трансгенные Дрозофилы</em

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Количественный анализ рабочих процессов Фитнес

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Использование МЭСМ последовательности арест как средство изолировать Рибосома связанных полипептидов

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Профилирования Индивидуальный человеческих эмбриональных стволовых клеток путем количественного RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Количественный иммунофлюоресценции для измерения различий в уровне белка на центросомах

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

Метод измерения активности ферментов Deubiquitinating в клеточных линиях и образцы тканей

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

Используя цифровой капли ПЦР для обнаружения гена BRAF V600E Мутации в формалине фиксированной в парафин Ссылка на стандарт клеточных линиях

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

Иммунофлуоресценции Анализ эндогенные и экзогенные Центромера-кинетохор Белки

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

Gap Junctional межклеточной коммуникации: Функциональная биомаркеров для оценки неблагоприятного воздействия токсикантов и токсинами, и Польза для здоровья натуральных продуктов

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...