Name: quantitative immunoblotting of cell lines as a standard to validate immunofluorescence for quantifying biomarker proteins in routine tissue samples
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Immunoblotting of Cell Lines as a Standard to Validate Immunofluorescence for Quantifying Biomarker Proteins in Routine Tissue Samples at JoVE.co

Este trabajo fue financiado parcialmente por el Fredrick Banting y Charles Best Canadá postgrado becas (A.M.).

Aprobación de las muestras de tejido humano primario se obtuvo de las Ciencias de la salud y afiliados a hospitales de enseñanza investigación ética Junta (HSREB) en la Universidad de la reina.
1. construcción de una línea celular tejido microarrays (TMA)
<ol><li>Cosecha y lavado de células. Nota: Este protocolo ha sido probado en varias líneas celulares inmortalizadas establecidas (por ejemplo, HeLa, Jurkat, RCH-ACV).<ol>
<li>Para las células adherentes, cosecha aproxim...

<ol>
	<li>Khoury, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+Immunohistochemical+Assays+for+Integral+Biomarkers+in+the+NCI-MATCH+EAY131+Clinical+Trial.">Validation of Immunohistochemical Assays for Integral Biomarkers in the NCI-MATCH EAY131 Clinical Trial.</a> Clinical Cancer Research. 24 (3), 521-531 (2018).</li><li>Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G. L., da Silva Pinhal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+as+an+important+tool+in+biomarkers+detection+and+clinical+practice.">Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice.</a> Biomarker insights. 5, 9-20 (2010).</li><li>Seidal, T., Balaton, A. 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Hemos descrito un método que hace uso de immunoblotting cuantitativa (IB) para demostrar la utilidad de la inmunofluorescencia (IF) para determinar la abundancia relativa de una proteína diana en muestras de tejido FFPE. Métodos de cuantificación de proteínas actuales están limitados por su naturaleza categorial, como cromógeno IHC2,3, o por la necesidad de homogeneizar las muestras, prevención de la investigación sobre las poblaciones de la célula y es...

Existe la necesidad de cuantificar proteínas en muestras de biopsia de tejido de (FFPE) de formalina-fijos, parafina-encajado en muchos campos clínicos. Por ejemplo, cuantificación de proteínas biomarcadoras en especímenes de la biopsia de rutina se utiliza para aclarar el pronóstico y tratamiento para pacientes de cáncer1de informar. Sin embargo, los métodos actuales son generalmente subjetivos y carecen de validación.
Inmunohistoquímica (IHC) es utilizado rutinariamente en laboratorios de patología y generalmente depende de un anticuerpo primario contra la proteína diana y un anticuerpo secundario conjugado con una etiqueta enzimática como la peroxidasa de rábano picante2. IHC convencional es sensible, puede hacer uso de minutos de muestras y preserva la integridad morfológica de muestras de tejido, lo que permite la evaluación de la expresión de la proteína dentro de su contexto histológica relevante. Sin embargo, porque la señal cromogénica generada por IHC es sustractiva, se adolece de un relativamente estrecho rango dinámico y ofrece un potencial limitado de multiplexación2,3,4. Espectrometría de masas del desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-MSI) la proyección de imagen preserva integridad morfológica. Sin embargo, este desarrollo de la tecnología está asociado con una modesta resolución morfológica y requiere calibración significativo y normalización, de afectar su viabilidad para el uso clínico rutinario5,6,7. Técnicas alternativas para cuantificar proteínas en muestras de tejido son immunoblotting8, espectrometría de masas en9,10,11y enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) de ensayo12, cada de que comienza con un homogeneizado lisado del tejido de la muestra. Las muestras de tejido primario son heterogéneas que contienen una multitud de tipos celulares. Por lo tanto, técnicas que implican la homogeneización de las muestras no permiten la cuantificación de una proteína en una población celular particular de interés, como las células cancerosas.
Como IHC, si es aplicable a las pequeñas muestras de FFPE y permite la retención de la integridad histológica13. Sin embargo, gracias a la naturaleza aditiva de las señales de fluorescencia, si es favorable a la aplicación de múltiples anticuerpos primarios y etiquetas fluorescentes. Por lo tanto, una proteína de interés se puede cuantificarse relativamente dentro de compartimentos celulares (por ejemplo, núcleo y citoplasma) definidas por medio de otros anticuerpos o de células específicas. Señales de fluorescencia también tienen la ventaja de un mayor rango dinámico13,14. La superioridad, la reproducibilidad y la multiplexación potencial de si se aplica a muestras FFPE ha sido demostrada13,14,15.
Adjunto describimos el uso de immunoblotting cuantitativo utilizando las líneas celulares establecidas como patrón oro para determinar la naturaleza cuantitativa de si junto con análisis de imagen asistida por ordenador para determinar la abundancia relativa de una proteína de interés en secciones histológicas de muestras de tejido FFPE. Hemos aplicado este método con éxito en un enfoque múltiple para cuantificar proteínas biomarcadoras en muestras de biopsia clínica16,17,18.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:675px;" width="673">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">697</td>
			<td style="width:116px;">DSMZ</td>
			<td style="width:123px;">ACC 42</td>
			<td style="width:213px;">Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">JeKo-1</td>
			<td style="width:116px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">CRL-3006</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Jurkat</td>
			<td style="width:116px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">TIB-152</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">RCH-ACV</td>
			<td style="width:116px;">DSMZ</td>
			<td style="width:123px;">ACC 548</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Granta-519</td>
			<td style="width:116px;">DSMZ</td>
			<td style="width:123px;">ACC 342</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">REH</td>
			<td style="width:116px;">DSMZ</td>
			<td style="width:123px;">ACC 22</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Raji</td>
			<td style="width:116px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">CCL-86</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">HeLa</td>
			<td style="width:116px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">CCL-2</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Trypsin/EDTA solution</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">R001100</td>
			<td>For detaching adhesive cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:116px;">Wisent Inc.</td>
			<td style="width:123px;">81150</td>
			<td>To neutralize trypsin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Neutral Buffered Formalin</td>
			<td style="width:116px;">Protocol</td>
			<td style="width:123px;">245-684</td>
			<td>For fixing cell pellets</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">UltraPure low melting point agarose</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">15517-022</td>
			<td>For casting cell pellets</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">Mouse monoclonal anti-human Bcl-2 antibody, clone 124</td>
			<td style="width:116px;">Dako (Agilent)</td>
			<td style="width:123px;">cat#: M088729-2, RRID: 2064429</td>
			<td style="width:213px;">To detect Bcl-2 by immunoflourencence and immunoblot (lot#:&#160;00095786</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Ventana Discovery XT</td>
			<td style="width:116px;">Roche</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:213px;">For automation of immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-mouse)</td>
			<td style="width:116px;">Dako (Agilent)</td>
			<td style="width:123px;">K4000</td>
			<td style="width:213px;">For immunofluorescence signal amplification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-rabbit)</td>
			<td style="width:116px;">Dako (Agilent)</td>
			<td style="width:123px;">K4002</td>
			<td style="width:213px;">For immunofluorescence signal amplification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Cyanine 5 tyramide reagent</td>
			<td style="width:116px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:123px;">NEL745001KT</td>
			<td style="width:213px;">For immunofluorescence signal amplification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Aperio ImageScope</td>
			<td style="width:116px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:213px;">To view scanned slides</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">HALO image analysis software</td>
			<td style="width:116px;">Indica Labs</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:213px;">For quantification of immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">Protease inhibitors (Halt protease inhibitor cocktail, 100X)</td>
			<td style="width:116px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">1862209</td>
			<td>To add to RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:116px;">BioShop</td>
			<td style="width:123px;">EDT001</td>
			<td>For RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">NP-40</td>
			<td style="width:116px;">BDH Limited</td>
			<td style="width:123px;">56009</td>
			<td>For RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D6750</td>
			<td>For RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Glycerol</td>
			<td style="width:116px;">FisherBiotech</td>
			<td style="width:123px;">BP229</td>
			<td>For Laemlli buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:116px;">BioShop</td>
			<td style="width:123px;">BRO777</td>
			<td>For Laemlli buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:116px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">161-0611</td>
			<td>For Laemlli buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:116px;">BioShop</td>
			<td style="width:123px;">ALB001</td>
			<td>For immunoblot washes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Protein ladder (Precision Plus Protein Dual Color Standards)</td>
			<td style="width:116px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">161-0374</td>
			<td>For running protein gel</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Filter paper (Extra thick blot paper)</td>
			<td style="width:116px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">1703969</td>
			<td>For blotting transfer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Nitrocellulose membrane</td>
			<td style="width:116px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">162-0115</td>
			<td>For blotting transfer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Trans-blot SD semi-dry transfer cell</td>
			<td style="width:116px;">Bio-Rad</td>
			<td>1703940</td>
			<td>For semi-dry transfer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Skim milk powder (Nonfat dry milk)</td>
			<td style="width:116px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:123px;">9999S</td>
			<td>For blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Tween 20</td>
			<td style="width:116px;">BioShop</td>
			<td style="width:123px;">TWN510</td>
			<td>For wash buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">GAPDH rabbit monoclonal antibody</td>
			<td style="width:116px;">Epitomics</td>
			<td style="width:123px;">2251-1</td>
			<td style="width:213px;">Primary antibody of control protein (lot#: YE101901C)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) antibody</td>
			<td style="width:116px;">abcam</td>
			<td style="width:123px;">cat#: ab6789, RRID: AB_955439</td>
			<td style="width:213px;">Secondary antibody for immunoblot</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">Goat anti-rabbit IgG (HRP conjugated) antibody</td>
			<td style="width:116px;">abcam</td>
			<td style="width:123px;">cat#: ab6721, RRID: AB_955447</td>
			<td style="width:213px;">Secondary antibody for immunoblot (lot#: GR3192725-5)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Clarity Western ECL substrates</td>
			<td style="width:116px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">1705060</td>
			<td style="width:213px;">For immunoblot signal detection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Amersham Imager 600</td>
			<td style="width:116px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">29083461</td>
			<td>For immunoblot signal detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:116px;">Freeware, NIH</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td>For densitometry analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative immunoblotting of cell lines as a standard to validate immunofluorescence for quantifying biomarker proteins in routine tissue samples

Cuantificación de proteínas de interés en muestras de tejido formalina-fijo, parafina-encajado (FFPE) es importante en clínica y aplicaciones de la investigación. Un método óptimo de cuantificación es preciso, tiene un rango dinámico lineal amplio y mantiene la integridad estructural de la muestra para permitir la identificación de tipos de células individuales. Los métodos actuales como la inmunohistoquímica (IHQ), espectrometría de masas y immunoblotting cada uno no cumplan con estas disposiciones debido a su naturaleza categorial o necesitan homogeneizar la muestra. Como método alternativo, proponemos el uso de inmunofluorescencia (IF) y análisis de imagen para determinar la abundancia relativa de una proteína de interés en los tejidos FFPE. Aquí se demuestra que este método se optimiza fácilmente, produce un amplio rango dinámico y es linealmente cuantificable en comparación con el estándar de oro de immunoblotting cuantitativa. Además, este método permite el mantenimiento de la integridad estructural de la muestra y permite la distinción de varios tipos de células, que puede ser crucial en aplicaciones de diagnóstico. En general, esto es un método robusto para la cuantificación relativa de proteínas en muestras FFPE y puede adaptarse fácilmente para adaptarse a clínica o investigación necesidades.

Este protocolo se utiliza para confirmar la capacidad de IF para determinar la cantidad relativa de la proteína anti-apoptótica Bcl-2 en líneas celulares hechos en bloques de tejido FFPE. Bcl-2 cuantificación selectivamente en las células cancerosas puede dilucidar mecanismos oncogénicos y puede ser útil en el diagnóstico patológico y en informar de las decisiones de manejo clínico24. Más específicamente, Bcl-2 desempeña un papel en el correcto desarro...

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Quantitative Immunoblotting of Cell Lines as a Standard to Validate Immunofluorescence for Quantifying Biomarker Proteins in Routine Tissue Samples

Immunoblotting cuantitativa de líneas celulares como un estándar para validar la inmunofluorescencia para cuantificar proteínas biomarcadoras en muestras de tejido de rutina

Describimos el uso de immunoblotting cuantitativa para validar la histología inmunofluorescencia juntada con análisis de la imagen como medio de cuantificación de la proteína de interés en muestras de tejido formalina-fijo, parafina-encajado (FFPE). Nuestros resultados demuestran la utilidad de la histología de la inmunofluorescencia para determinar la cantidad relativa de proteínas biomarcadoras en muestras de biopsia de rutina.

Quantification of proteins of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples is important in clinical and research applications. An ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la patología del cáncer, mediante la cuantificación de las proteínas de biomarcadores a partir de material de biopsia procesado de forma rutinaria. Las principales ventajas de esta técnica en relación con la inmunohistoquímica convencional, son que es objetiva, tiene un amplio rango dinámico, y permite la cuantificación de proteínas en tipos celulares específicos. La presencia o ausencia de ciertas llamadas proteínas de biomarcadores, o más particularmente, la abundancia relativa de esas proteínas en muestras de biopsia de cáncer puede ser muy útil para hacer un diagnóstico patológico específico de tipos específicos de cánceres.Pero también puede ser útil para predecir la respuesta a los tratamientos oncológicos, por eso esta técnica es relevante tanto para el diagnóstico como para el tratamiento de pacientes con cáncer. Este protocolo trata principalmente de cómo utilizar la cuantificación de proteínas en líneas celulares inmortalizadas para validar la naturaleza cuantitativa del ensayo basado en inmunofluorescencia. Pero es importante tener en cuenta que la inmunofluorescencia se puede incorporar fácilmente en un enfoque multiplexado y aplicarse a las muestras de biopsia primaria.Asistirán y demostrarán este procedimiento Lee Boudreau, técnico, y Shakeel Virk, el director de operaciones. Ambos del Laboratorio de Patología Molecular de la Reina. Para empezar, centrifugar las células previamente cosechadas en un tubo cónico de 50 mililitros a 225 Gs durante cinco minutos.Decantar el sobrenadante, y resuspender el pellet celular en 10 mililitros de PBS. Luego, centrifugar las células resuspendidas a 225 Gs durante cinco minutos. Suspenda el pellet celular con 10 mililitros de 10%NBF.Luego incubar las células a temperatura ambiente en un balancín a 24 RPM durante la noche. Después de fijar las células, centrifugar las células a 225 Gs durante cinco minutos. Luego retire el sobrenadante y resusppend las células en 500 microlitros de PBS.Transfiera las células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y pelete las células a través de la centrifugación. Entonces, aspira el sobrenadante. Añadir aproximadamente 500 microlitros de 1% de solución de agarosa a cada tubo que contenga células.A continuación, pipetee la mezcla hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Después de que la solución de la célula de agarosa se endurezca, agregue un mililitro de 10%NBF a los tubos. Más tarde, retire el NBF de las muestras.Utilice una cuchilla de afeitar para quitar el tapón de la celda y coloque el tapón en un casete de tejido plástico. Procesar muestras durante la noche con un procesador de tejidos automatizado. A continuación, incruste las muestras en cera de parafina, utilizando métodos de histología estándar.Usando un instrumento de matriz de tejidos, cosecha núcleos duplicados de 6 milímetros del bloque de parafina e insértalos en un bloque de parafina vacío. Después de esto, utilice un microtomo para preparar dos secciones histológicas de la línea celular recién creada, TMA. A continuación, monte las secciones en un tobogán de histología y desparafinanlas.En primer lugar, cargue las dos diapositivas de la línea celular TMA en un sistema de tinción automatizado. Mancha un lado con la dilución óptima del anticuerpo primario, dejando el otro como un deslizamiento de control negativo. Para ambas diapositivas, aplique una contramancha nuclear y un anticuerpo secundario.Después del proceso de tinción, añada los reactivos de amplificación de la señal de tiramida. Después de esto, escanee las diapositivas inmunotendéricas utilizando las longitudes de onda de excitación y detección apropiadas para los fluoróforos que se utilizaron. Utilice el software de análisis de imágenes para identificar el compartimento celular de interés, ya sea el núcleo o el citoplasma, y cuantificar la intensidad media de fluorescencia, o IMF, para cada línea.Para determinar qué línea celular tiene la mayor abundancia de la proteína diana, aliquot lysate celular preciosamente preparado en tubos de microcentrífuga. A continuación, agregue 2,5 microlitros de búfer de encaje 6x, y suficiente búfer de lisis RIPA para llevar el volumen total a 15 microlitros. A continuación, cargue un gel de página SDS, con una escalera de proteínas y las muestras previamente preparadas.Después de esto, cargue el búfer de laemly en los pozos vacíos. Ejecute el gel hasta que el tinte azul llegue a la parte inferior de la placa. Después de realizar una transferencia de proteína semi-seca, utilice una cuchilla de afeitar para cortar la membrana horizontalmente para separar la proteína de interés de la proteína de control.Realizar bloqueos e incubaciones de anticuerpos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, coloque las tiras de membrana en una bolsa de plástico transparente. Utilice una pipeta P1000 para cubrir las membranas con la mezcla de ECL.A continuación, sellar la bolsa, e incubar las membranas a temperatura ambiente en la oscuridad durante uno a dos minutos. A continuación, coloque la bolsa de plástico que contiene las membranas en una plataforma de imágenes digitales. Utilice la quimiuminoscencia y la detección de marcadores colorimétricos para capturar varias exposiciones de la membrana.Usando el software de análisis de imágenes, o la observación visual, determine qué línea celular expresa la proteína más objetivo. Después de inmunoblotting una dilución en serie de esta línea celular, abra las imágenes de exposición utilizando el software de análisis de imágenes. Utilice la herramienta Selecciones rectangulares para seleccionar el primer carril del gel.A continuación, vaya a analizar, geles y seleccione el primer carril. Repita este proceso moviendo la herramienta de selecciones rectangulares al siguiente carril y vaya a analizar, geles y seleccionar el siguiente carril. A continuación, vaya a analizar, geles y trazar carriles.Utilice la herramienta de línea recta para dibujar líneas a través de las bases de cada pico, para eliminar el ruido de fondo. A continuación, utilice la herramienta de varita para seleccionar cada pico y obtener la intensidad de banda de cada pico desde la ventana de resultados. Cree una gráfica de dispersión de intensidad de banda frente a la cantidad de proteína total cargada para cada anticuerpo primario utilizando la salida de densitometría.A continuación, utilice una línea de mejor ajuste y observación visual para determinar la ubicación del rango dinámico lineal de cada anticuerpo. Seleccione una concentración de proteínas que produzca una intensidad de banda dentro del rango lineal, y realice un inmunoblot de todos los cilados de línea celular con esa concentración de proteína, como se demostró anteriormente. A continuación, realice la densitometría en los escaneos digitales, seleccionando exposiciones que producen señales dentro de los rangos lineales previamente identificados para cada anticuerpo.Después de esto, calcule la relación entre la intensidad de la banda de proteína objetivo y la intensidad de la banda de control de carga para cada línea celular. Por último, utilice software estadístico para realizar una prueba de correlación de Pearson entre los valores obtenidos del análisis de imágenes de la tinción IF y los obtenidos de inmunoblotting. Este protocolo se utilizó para confirmar la capacidad de IF para determinar la cantidad relativa de la proteína anti-apoptótica Bcl-2.Se probaron diferentes diluciones del anticuerpo primario en el tejido amígdalo humano con un tindor inmunohistórica. Para este experimento, se determinó que una dilución de uno a 50 era la dilución óptima que produjo una señal fuerte con poco ruido de fondo. Esta dilución se utilizó para manchar la línea celular TMA por inmunofluorescencia, y se utilizó el análisis de imagen para cuantificar la señal citoplasmático Cy5 atribuido a Bcl-2.Basado en el inmunoblot para todas las líneas celulares probadas, Granta-519 tenía la mayor abundancia de Bcl-2. Un inmunoblot de la dilución en serie del lesate Granta-519 se utilizó entonces para encontrar el rango dinámico lineal de Bcl-2, y controlar la proteína GAPDH. El rango dinámico para Bcl-2 en este ensayo osciló entre una intensidad de banda de casi 0 y 7500 unidades.El rango dinámico para GAPDH osciló entre 3000 y 6500 unidades. El inmunoblot se repitió con exposiciones dentro de ese rango lineal. Y la relación de Bcl-2 a GAPDH se calculó para cada línea celular.Una prueba de correlación de Pearson demostró que las proporciones de intensidad de inmunoblotting estaban fuertemente y positivamente correlacionadas con las lecturas de intensidad de IF cuantitativo. Al intentar este procedimiento, es importante recordar exponer la membrana final para múltiples puntos de tiempo, Con el fin de encontrar la exposición óptima donde todas las bandas están dentro de sus respectivos rangos lineales. Después de validar la naturaleza cuantitativa del protocolo IF, se puede modificar para multiplex IF, en muestras de tejido procesadas rutinariamente con el fin de responder a preguntas clínicas tales como donde se expresa una proteína diana.

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Actina Co-sedimentación de ensayo, pues el análisis de proteína de unión a la F-actina

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Investigación

Biología

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Comparación cuantitativa de Cis-Elemento regulador (CRE) Las actividades de transgénicos Drosophila melanogaster</em

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Un flujo de trabajo de Análisis Cuantitativo Gimnasio

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Usar secuencias de detención SecM como una herramienta para aislar Ribosome polipéptidos enlazados

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Perfiles de Células Madre Embrionarias Humanas individual por RT-PCR cuantitativa

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Cuantitativa inmunofluorescencia Ensayo para medir la variación en los niveles de proteína en centrosomas

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

Método para medir la actividad de enzimas deubiquitinating en líneas celulares y muestras de tejido

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

El empleo de la gotita de PCR digital para detectar mutaciones BRAF V600E en embebidos en parafina líneas celulares de referencia estándar fijos-formalina

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

Las proteínas Análisis de inmunofluorescencia de endógenos y exógenos Centrómero-cinetocoro

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

Brecha ocasiones intercelular de comunicación: un biomarcador funcional para evaluar los efectos adversos de las sustancias tóxicas y toxinas, y de Salud Beneficios de Productos Naturales

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...